大動脈弁移植 - 教則ビデオのマウスモデルでスリーブを用いた

要約

マウスでスリーブを用いた同所性同種大動脈移植モデルを提案します。それは非常に急速な吻合法のことで、血管疾患の研究に用いることができます。

要約

スリーブを用いた同所性同種大動脈弁移植は、唯一の 10-20% の故障率で大動脈への損傷を低減します。スリーブ メソッドを使用してマウスの大動脈を吻合するために時間は短くて簡単な平均 20 分、iso/同種移植の研究を許可します。次の資料では、私たちの研究室で使用される大動脈移植手順について説明します。マウスは、1.5% ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して 100% の酸素の混合物で麻酔をかけられました。この時点で、大動脈腎動脈とその分岐間のセグメントは、上大静脈、自由に準備と clampedat から分離された単一の絹糸と近位および遠位のセグメント。大動脈の削除する前に、ヘパリンを含む食塩は下大静脈に注入されました。大動脈クランプの間カットされたし、生理食塩水ヘパリン溶液を用いて内腔をフラッシュします。モノフィラメント縫合糸で袖のテクニックは、同所性同種位置で腹部大動脈を移植するために使用されました。

概要

移植自体によって引き起こされる特定の血管反応と arteriogenic 環境に接続されている特定の全身的要因の識別をできるマウス大動脈移植モデルに細心の注意を支払われている先行研究で指摘したよう^1,2,3。 ここで重要な役割を果たしている主要な要因は、ノックアウト、トランスジェニック マウスの可用性です。このようなモデルに関与識別および退行性血管疾患、動脈硬化や動脈瘤形成^4,などの開発に関連付けられている新しい病態生理学的経路を決定する可能性を提供しています⁵。

それは、本質的な虚血/再灌流を移植中に移植用血管への損傷が表示されますは注目に値するです。したがって、移植の整合性や術後の期間中に予期しない炎症性反応に関する特定の問題の発生がおそらく血管の変性疾患^{3 の病態生理学的変化を除外除外できません。、4,5,6,7}。スリーブ吻合は直径 1 ミリ以下の血管の動脈吻合のため代替エンドで方法で、大動脈に続いて合わせられたラットの腎・心臓移植で正常に適用されています。Dambrinらによるマウスの移植^8,9,10,11。

スリーブの移植技術を用いた大動脈損傷は非常に技術的な失敗率が低く、平均でわずか 20 分を持続的な原因を最小限に抑えます。以前の研究結果は、スリーブ法¹を用いた移植後体内の isograft の構造と機能性を実証しています。Dambrinら説明短い学習曲線の成功率は 78% を終わった後¹⁰。血栓症などの合併症はまれですが、たとえば Engelbrechtらがラット⁸腎移植でスリーブを用いた血栓症を観察しなかったです。

スリーブ吻合とマウス大動脈移植モデルは、iso/同種移植血管反応を研究する迅速かつ簡単なツールです。このビデオは、当研究室で実施する大動脈移植手順を示しています。この移植モデル血管変性疾患の根本的な病理メカニズムを定義する際に役に立つかもしれませんし、分子および薬理学的介入の¹²のそれ以上の評価に貢献するかもしれない。

プロトコル

動物を対象とする手順がアーヘン工科大学、アリゾナ州 84 02.04.2012.A234 で承認された機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC).

注: CD1 の背景を持つ成人男性野生型マウスを使用して、手順を説明します。食品、動物用の特殊なコントロールや治療への適切なアクセスを確保し、手術前後の専門研究所単位でマウスを飼うため。動物を購入した場合の手術を行う前に、1 週間を順化外

。

1 ドナーの準備

1. 感染症を避けるために手術中に滅菌状態を維持するために滅菌材料・機器を使用します。
。
2. は、ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して酸素を 100% 1.5% の混合物に各マウスを麻酔します。仰臥位とテープでプラットフォーム オペレーティング テーブルにすべての足でマウスを置きます。その反射を確認するには、マウスを十分に麻酔、確かに後部のフィートをつまんでします。プロシージャの間に乾燥を防ぐために目の上眼軟膏を置きます
。
3. 脱毛ジェルを使用して腹部からすべての髪を削除または髭剃りを使用します。無菌条件下で操作を実行します。クロルヘキシジンと滅菌水のスクラブを交互に腹部を消毒します
。
4. ハサミやメスで正中線腹部切開を介してドナー大動脈を削除します。右に手動で腸を撤回します。手動で軽くパウダー フリー手袋を使用する側に上腸を反映します。
   1. それを湿った保つため生理食塩水で湿らしたガーゼの部分に腸を配置します
   。
   2. 離れて非常に慎重にピンセットで鈍的切離を使用して周囲の組織から腹部大動脈を解剖します
   。
   3. ピンセットで腎動脈と上大静脈からの分岐の間に大動脈のセグメントを区切ります
   。
   4. このセグメントを非常に慎重に 11-0 モノフィラメント縫合を使用のすべての小さな枝を確保します
   。
   5. 大動脈を削除する前に下大静脈にヘパリンの 50 U を含む生理食塩水の溶液 0.5 ミリリットル (mL) を挿入します
   。
   6. 大動脈のセグメントが削除された後の exsanguinate ドナー動物ができます
   。
   7. 生理食塩水を完全にグラフトをすすいで氷冷生理食塩水の容器にすぐに転送します
   。

2。受信者の準備

1. ボリューム イソフルランとフェイス マスクを通して酸素を 100% 1.5% の混合物を持つ受信者の動物の麻酔を髪を削除し、(セクション 1) を駆除します。メスと骨盤に、剣から中間線切開を行い、腹部の壁を撤回します。プロシージャの間に乾燥を防ぐために目の上眼軟膏を置きます
。
2. ラップ食塩水内腸ガーゼを湿らせたし、動物に非常にゆっくり転置 ' s 右
。
3. Dissect 高齢者大動脈腎動脈の間無料の近位と遠位のピンセット分岐します
。
4. このセグメントを非常に慎重に 11-0 モノフィラメント縫合を使用のすべての小さな枝を確保します
。
5. 6-0 シングル絹縫合糸で大動脈の近位および遠位部分をクランプします
。
6. クランプ間の中間に大動脈を分割し、ルーメン オープンをフラッシュするヘパリン生理食塩水で切口を灌漑します
。
7. は世話を正しく合わせてドナーと受信者 (大動脈の任意のねじれを避けるために 11-0 のモノフィラメントで縫合に続いて受信容器に挿入餌容器端と同所性同種の位置にグラフトを配置します。 図 1) ¹⁰.
8. 吻合部の検査を実施した後、合字を慎重に取り外します。まず遠位クランプをリリースします。この方が低気圧が近位部の高圧側を解放する前に、一緒に壁を保持します
。
9. はすぐに移植を灌流し、パルスが見えるを確認してください。絹の残党を慎重に取り外します。ドナーと受信者の大動脈の間最適なラップの長さは 1-2 mm.
10. 腹部の内容を腹腔内に戻り、全体を閉じる実行中 3-0 ポリグ リコール酸縫合糸で巻き
。
11. マウス ブプレノルフィンを与える (0.05 mg/kg 体重の皮下 (SC)) 麻酔を終了する前にします
。
12. 放置しないでください動物それが完全に意識するまで。疼痛管理 buprenophine 0.05 mg/kg 体重で療法が SC 術後後 3 日間一日に三回管理機関監督機関による承認
。
13. 組織採取、麻酔として受信者のマウスの上記の説明し、4% ホルムアルデヒド/PBS、続いてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で血管のフラッシュ (pH 7.4 を =) 心臓穿刺によって。グラフトをそっと取り外します。4% ホルムアルデヒド/PBS で一晩固定後プロセス標本はさらに、パラフィンに埋め込む
。

結果

血栓症の高いリスクがあったが、マウスがない観測の身体障害を持つ 15-30 分以内麻酔から回復しました。超音波解析が行われた術後フォロー。野生型マウスの研究で使用されるは、内腔の寸法変化を起こしません。したがって、狭窄も動脈瘤の形成が観察されました。移植動物は血管壁 (図 2) のプラーク開発を展示できませんでした。

プラーク, 平滑筋細胞とマクロファージの集積を決定する immunohistology など従来の汚損プロシージャを使用できます。本研究では組織学的免疫組織化学染色をグラフトの整合性をテストする接ぎ木後 6 週間行った。組織染色 (ヘマトキシリンとエオシン (HE) および免疫組織化学染色 (平滑筋アクチン (SMA) とマクロファージ (MAC2)) (図 3) を見せてくれた平滑筋細胞、内皮細胞のライニング、および no の分布パターンをそのまま内膜の細胞の蓄積。グラフト血管 (図 3) で検出された重要な病変や細胞の活性化がないことが示唆されました。

図 1: 袖の手法。腹部大動脈は、袖のテクニックを使用して移植されました。この手順ではドナーの大動脈は浅刺さ餌容器内に存在と同所性同種の位置に置かれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 術中超音波画像と。移植移植 (A)、(B) 三次元超音波および B モード表示 (C) 後 6 週間の術中 (剖検) ビューの例です。術後のフォロー アップは、超音波を用いて行った。写真は、ルーメンの次元で変化なしでグラフトの開存を表示.また、狭窄や動脈瘤の形成は認められなかった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 組織学的および免疫組織化学画像。移植後 6 週間で移植した動物の組織学的および免疫組織化学の代表的なイメージ。組織によって移植された大動脈に大きな病変認められなかった (ヘマトキシリンとエオシン、彼は、100 倍の倍率、スケールバー = 50 μ m)、免疫組織染色 (平滑筋アクチン SMA (赤)、またはマクロファージ MAC2 (緑) 200 X 倍率、スケール バー =25 μ m)。核カウンターで染色 DAPI (青).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究の前にマウスでの他の各種の移植モデルは徹底的に分析^{3,6,7,10,13,14}.私たちの条件にマッチした従来のエンド-エンド縫合方法と比較してスリーブ吻合部の高い信頼性を示したと Dambrinらによって変更とスリーブを用いた大動脈移植モデルが選択されました。^1,10。

この手法は、クロス クランプ時間かなり短縮術中大動脈へのダメージを最小限に抑えることと多くの点で有利です。血栓症の発生率が低いは、容器口径ドナーと受信者の間の潜在的な不一致を避けることに加えられなかった。上記の観察はこの手法をマウスの大動脈移植における血管疾患を調査するため非常に作る。

超音波が移植後 8 週間が実行されたフォロー アップ研究で有意な変化は認められなかった.これは手術中に大動脈への損傷が最小限¹だろうと仮定を確認しました。

この記事で紹介した移植術は障害血管整合性とその機能の両方を保証します。したがって、この実験的移植モデルが退行性血管疾患遺伝子改変マウスでの将来の分子および薬理学的調査のための貴重なツールとして可能性があります判断できます。

ビデオのガイドすることができますこの単純な動静脈動脈モデルの使用を示す教材として機能することと、血管病態の多くの重要な問題についてさらに実り多い議論に貢献することと考えています。この非常に急速な吻合法は、遺伝子組み換えマウスで血管疾患を勉強するに使えます。移植併用動脈瘤モデルでの変更としても使えます。

プロシージャの間に重要なポイントがあります。縫合自体を配置することは、最も重要なステップです。外科医は、ドナーとレシピエントの適切な配置による大動脈の任意のねじれを避けるために世話をするが。クランプは、吻合部の検査後慎重に削除されます。遠位クランプは、まず近位部の高圧側のリリース前に壁を保持している低圧の結果常に解放する必要があります。正しく次のリリースのシーケンスの結果を出血でしょう。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halsey Needle Holder	Fine Science Tools	12001-13
Dumont #5 Forceps -	Fine Science Tools	11254-20
Lexer-Baby Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-01
Vannas Scissors	Aesculap, Germany	Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps	Geuder, Germany	19015
6-0 silk black (Silk)	Deknatel, Research Triangle Park NC, USA	18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)	Ethicon, Norderstedt, Germany	EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit)	Serag-Wiessner, Naila, Germany	60203214
Isofluorane	Any genericon
Heparin	Any genericon
0.9% saline	Any genericon
Buprenorphine	Any genericon
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany
Microscop	Zeiss	Opmi MDO/S5
Vaporiser	Eickemeyer	TEC3
Ultrasound	Vevo, Canada	770,2100