Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Resumen

Presentamos un modelo de aórtica trasplante ortotópico utilizando la técnica de la manga en ratones. Es un método muy rápido de la anastomosis, que puede emplearse en estudios de enfermedad vascular.

Resumen

Trasplante orthotopic aórtica con la técnica de la manga reduce daño a la aorta con la tasa de fracaso de sólo 10-20%. El tiempo para anastomizar la aorta en ratones utilizando el método de la manga era corta y fácil con un promedio de 20 minutos, permitiendo estudios de iso/allo injertos. El siguiente artículo describe el procedimiento de trasplante aórtica utilizado en nuestro laboratorio. Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de isoflurano de volumen de 1,5% y oxígeno al 100% a través de una mascarilla. En este punto, el segmento de la aorta entre las arterias renales y su bifurcación fue separado de la vena cava, preparado libremente y clampedat los segmentos proximales y distales con una sola sutura de seda. Antes de la eliminación de la aorta, una solución salina que contiene heparina se inyecta en la vena cava inferior. Luego la aorta fue cortada entre las abrazaderas y se usó una solución de heparina solución salina para lavar el lumen. Se utilizó la técnica de la manga con las suturas de monofilamento para trasplante de la aorta abdominal en posición ortotópica.

Introducción

Como ha señalado en un estudio anterior, mucha atención se ha prestado a modelos murinos trasplante aórtica que permiten la discriminación entre las respuestas vasculares específicas causadas por el injerto en sí mismo y ciertos factores sistémicos relacionados con un entorno de Arteriogénica ^{1 , 2 , 3}. el principal factor que juega un papel crucial aquí es la disponibilidad de ratones transgénicos y knockout. Su participación en este modelo ofrece la posibilidad de identificar y determinar nuevos caminos patofisiológicos asociados con el desarrollo de enfermedad vascular degenerativa, como arterioesclerosis y aneurisma formación^{4, 5}.

Cabe destacar que durante el injerto una isquemia/reperfusión intrínseca puede aparecer lesión a los recipientes destinados para el trasplante. Por lo tanto, la ocurrencia de problemas específicos con la integridad del injerto o una inesperada reacción inflamatoria durante el postoperatorio no puede excluirse que posiblemente cambios fisiopatológicos en las enfermedades vasculares degenerativas^{3 ,4,5,6,7}. Anastomosis de manga es el método alternativo en un extremo para la anastomosis arterial de vasos con un diámetro de menos de un milímetro y se ha aplicado con éxito en el trasplante renal y cardíaco en ratas que posteriormente fue adaptado a la aórtica trasplante en los ratones por Dambrin et al. ^{8 , 9 , 10 , 11}.

Se reduce al mínimo daño aórtico utilizando la técnica de trasplante de manga con una tasa muy baja de fallo técnico, debido a que dura sólo 20 minutos en promedio. Los resultados anteriores han demostrado excelentes propiedades funcionales y estructurales de un isograft en vivo después del trasplante con la técnica de la manga¹. Dambrin et al describe que después de una curva de aprendizaje corta la tasa de éxito fue superior al 78%¹⁰. Complicaciones como la trombosis son raras, por ejemplo Engelbrecht et al no observar la trombosis mediante la técnica de la manga en el trasplante renal en la rata⁸.

El modelo murino de trasplante aórtica con anastomosis del manga es una herramienta rápida y fácil para estudiar reacciones de iso/aloinjerto en el recipiente del trasplantado. Este video ilustra el procedimiento de trasplante aórtica lleva a cabo en nuestro laboratorio. Este modelo de trasplante puede ser útil en la definición de los mecanismos patológicos subyacentes de la enfermedad degenerativa vascular y puede contribuir a la evaluación adicional de las intervenciones moleculares y farmacológicas¹².

Protocolo

procedimientos con sujetos animales fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en RWTH Aachen University, Arizona 84-02.04.2012.A234.

Nota: el procedimiento es demostrado utilizando ratones de tipo salvaje macho adulto con fondo CD1. Mantener los ratones en una unidad especializada de laboratorio antes y después de la cirugía, asegurando el acceso adecuado a alimentación, control veterinario especializado y el tratamiento. Si los animales se compran de afuera, permite la aclimatación de una semana antes de realizar cirugía.

1. preparación del donante

1. utilizar instrumentos y materiales estériles para mantener las condiciones estériles durante la cirugía para evitar infecciones.
2. Anestesiar cada ratón con una mezcla de 1.5% de isoflurano de volumen y oxígeno al 100% a través de una mascarilla. Coloque el ratón sobre una plataforma en la posición supina y la cinta todas sus patas a la mesa de operaciones. Compruebe sus reflejos pellizcando los pies traseros para asegurarse de que el ratón es suficientemente anestesiado. Poner pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento.
3. Remover todo el pelo del abdomen con un gel depilatorio o utilizar una máquina de afeitar. Realizar la operación bajo condiciones estériles. Desinfectar el abdomen alternando peelings de clorhexidina y agua estéril.
4. Quitar la aorta del donante mediante una incisión abdominal de línea media con tijeras o bisturí. Retraiga el intestino manualmente hacia la derecha. Reflexionar con cuidado manualmente los intestinos sobre hacia el uso de guantes sin talco.
   1. Colocar el intestino en un trozo de gasa humedecido con solución salina para mantenerlo húmedo.
   2. a disecar la aorta abdominal con mucho cuidado de los tejidos circundantes mediante una disección Roma con una pinza.
   3. Separar el segmento de la aorta entre las arterias renales y la bifurcación de la vena cava con pinzas.
   4. Garantizar todas las ramas pequeñas de este segmento muy cuidadosamente usando una sutura de 11-0 monofilamento.
   5. Antes de quitar la aorta, inyectar 0,5 mililitros (mL) de solución salina que contiene 50 U de heparina en la vena cava inferior.
   6. Dejó el animal donante exsanguinate después de retira el segmento de la aorta.
   7. Enjuague la prótesis con solución salina y luego, transferir inmediatamente a un recipiente con solución salina helada.

2. Preparación del receptor

1. anestesiar el animal receptor con una mezcla de 1.5% de isoflurano de volumen y oxígeno al 100% a través de una mascarilla, luego eliminar el vello y desinfectar (sección 1). Hacer una incisión en la línea media de la xifoides a la pelvis con un bisturí y retrae las paredes abdominales. Poner pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad durante el proceso de.
2. Abrigo al intestino en solución salina humedece una gasa y desplazar suavemente al animal ' s derecho.
3. Diseque la aorta del infrarenal libre entre las arterias renales proximalmente y la bifurcación distal con una pinza.
4. Garantizar todas las ramas pequeñas de este segmento muy cuidadosamente usando una sutura de 11-0 monofilamento.
5. Abrazadera de las porciones proximales y distales de la aorta con una sutura de seda solo 6-0.
6. Divide la aorta en el centro entre las abrazaderas y regar los extremos cortados con solución salina heparinizada para lavar el lumen abierto.
7. Colocar el injerto en posición ortotópica con alimentación recipiente final insertado en el buque receptor seguido de sutura con monofilamento de 11-0, teniendo cuidado de evitar cualquier torsión de la aorta alineando correctamente el donante y receptor ( figura 1) ¹⁰.
8. con cuidado suelte las ligaduras después de realizar una inspección de la anastomosis. Suelte la abrazadera distal primero. Esto se traduce en baja presión manteniendo las paredes juntos antes de ofrecer el lado de alta presión proximal.
9. Perfusión del injerto inmediatamente y busque un pulso visible. Suavemente Quite los restos de la seda. La longitud de superposición óptima entre donante y receptor aorta es 1-2 mm.
10. Devolver el contenido abdominal a la cavidad abdominal y cerrar toda la herida con una corriente sutura ácida de poliglicólico 3-0.
11. Dar la buprenorfina de ratón (0,05 mg/kg de peso corporal por vía subcutánea (SC)) antes de terminar la anestesia.
12. No descuide un animal hasta que esté completamente consciente. Manejar el dolor la terapia con buprenophine 0.05 mg/kg de peso corporal administrada SC tres veces al día durante tres días después de la operación aprobadas por el órgano de supervisión institucional.
13. Para tejido cosecha, anestesiar los ratones receptores como descrita anteriormente y al ras los vasos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido por 4% formaldehído/PBS (pH = 7,4) por punción cardiaca. Retire suavemente los injertos. Después de la noche a la mañana fijación en formaldehído 4% / PBS, ejemplares de proceso más y embed en parafina.

Resultados

Los ratones se recuperaron de la anestesia dentro de 15-30 min con ninguna incapacidad física observada, aunque existe un riesgo elevado de trombosis. Análisis de ultrasonido fue utilizado durante el seguimiento postoperatorio para arriba. Los ratones de tipo salvaje utilizados en el estudio no exhibieron ningún cambio en las dimensiones de su lumen. En consecuencia, se observan estenosis ni formaciones aneurismáticas. El trasplante de animales no presentan desarrollo de la placa de las paredes del vaso (figura 2).

Procedimientos de tinción convencionales como el immunohistology pueden utilizarse para determinar la placa, patrón de las células musculares lisas y la acumulación de macrófagos. En nuestro estudio el histológico y la tinción inmunohistoquímica se realizó seis semanas después de injertar para probar la integridad del injerto. Tinción histológica (hematoxilina y eosina (HE) y immunohistochemical que manchaba (actina de músculo liso (SMA) y macrófagos (MAC2)) (figura 3) nos mostró sin cambios los patrones de distribución de las células musculares lisas, revestimiento endotelial intacto de la célula y no acumulación de células de la íntima. Estos resultados indican que ninguna activación significativa de lesión o de la célula fue detectada en los vasos injertados (figura 3).

Figura 1 : Técnica de la manga. La aorta abdominal fue trasplantada con la técnica de la manga. En este procedimiento, aorta del donante era colocado en la posición ortotópica con las mordeduras superficiales presentes en el recipiente de alimentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Intraoperatoria e imágenes de ultrasonido. Ejemplos de la visión intraoperatoria (la autopsia) de los injertos 6 semanas después del trasplante (A), ultrasonido tridimensional (B) y ver de modo B (C). El seguimiento postoperatorio se realizó mediante ecografía. Las imágenes muestran la permeabilidad del injerto sin cambio en dimensiones de luz. Además, no se observaron estenosis o formaciones aneurismáticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Histológica e inmunohistoquímica imágenes. Las imágenes representativas histológicas e inmunohistoquímica de los animales trasplantados a las 6 semanas después del trasplante. Lesiones significativas no se observaron en aortas trasplantados por la histología (hematoxilina y eosina, él, 100 aumentos, barra de escala = 50 μm), immunohistochemical que manchaba (músculo liso actina SMA (rojo) o macrófagos MAC2 (verde), magnificación de 200 X, barra de escala = 25 μm). Núcleos en fueron manchados por DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Antes de este estudio, varios otros modelos de trasplante en los ratones fueron minuciosamente analizados^{3,6,7,10,13,14}. El modelo de trasplante aórtico mediante la técnica de la manga con modificaciones Dambrin et al. fue seleccionado ya que empareja nuestros criterios y demostró una alta confiabilidad de la anastomosis de la manga con los métodos convencionales de end-to-end de sutura ^{1 , 10}.

Esta técnica es favorable en muchos aspectos con el tiempo de pinzamiento reducido considerablemente minimizando los daños a la aorta durante la cirugía. Se observó una baja incidencia de trombosis además de evitar un posible desajuste en calibre de vasos entre el donante y el receptor. Las anteriores observaciones hacen esta técnica muy conveniente para investigar enfermedad vascular aórtica transplantes en ratones.

En un estudio de seguimiento en el que un ultrasonido fue realizado 8 semanas después del trasplante, se detectaron ningunos cambios significativos. Esto confirma hipótesis que cualquier daño a la aorta durante la cirugía sería mínimo¹.

El injerto procedimiento presentado en este artículo no garantiza ningún deterioro en la integridad del injerto y su función. Por lo tanto, se puede concluir que este modelo experimental de trasplante puede servir como una herramienta valiosa para futuras investigaciones moleculares y farmacológicas de la enfermedad degenerativa del recipiente en ratones modificados genéticamente.

Creemos que la guía de vídeo puede funcionar como material que ilustra el uso de este simple modelo arterio-arterial y que contribuirá más fructífero debate sobre muchas cuestiones importantes en patologías vasculares. Este método de anastomosis muy rápido puede utilizarse para el estudio de la enfermedad vascular en ratones modificados genéticamente. También puede utilizarse como una modificación en el modelo de aneurisma combinado con el trasplante.

Hay puntos críticos durante el procedimiento. La colocación de la sutura en sí mismo es el paso más crítico. El cirujano tiene que tener cuidado de evitar cualquier torsión de la aorta por la alineación apropiada del donante y del receptor. Las grapas se retiran cuidadosamente después de la inspección de la anastomosis. La pinza distal siempre se debe lanzar primero, lo que resulta en baja presión manteniendo las paredes juntos antes del lanzamiento del lado de alta presión proximal. Sangrado la consecuencia de no seguir la secuencia de lanzamiento.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halsey Needle Holder	Fine Science Tools	12001-13
Dumont #5 Forceps -	Fine Science Tools	11254-20
Lexer-Baby Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-01
Vannas Scissors	Aesculap, Germany	Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps	Geuder, Germany	19015
6-0 silk black (Silk)	Deknatel, Research Triangle Park NC, USA	18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)	Ethicon, Norderstedt, Germany	EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit)	Serag-Wiessner, Naila, Germany	60203214
Isofluorane	Any genericon
Heparin	Any genericon
0.9% saline	Any genericon
Buprenorphine	Any genericon
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany
Microscop	Zeiss	Opmi MDO/S5
Vaporiser	Eickemeyer	TEC3
Ultrasound	Vevo, Canada	770,2100