膵管注入:薬物およびウイルス送達の有効かつ選択的な方法

要約

膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。ここでは、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達のための膵管注入技術を紹介する。

要約

膵臓は、内分泌成分と外分泌成分の両方を有する二官能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、膵臓癌を含む膵臓を苦しめることができます。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。これらの研究分野をさらに進めるツールはほとんどありません。膵管注入は、系統トレース、遺伝子導入、および細胞ライン特異的ターゲティングを可能にする重要な技術です。この技術は、十二指腸とアンペアの第2部分の複雑な解剖を必要とし、続いて胆管の閉塞と膵管のカヌル化を伴う。このテクニックは最初は技術的に難しいですが、アプリケーションは無数です。グループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準プロトコルの必要性を強調した。本研究は、GFPを発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現と偽の手術を説明する。注入は、それゆえに発現は膵臓に特異的であり、他のどの組織タイプにも発現が存在しない。

概要

膵臓は、内分泌および外分泌成分の両方を有する二機能器官である。多くの病理は、糖尿病、膵炎、および膵臓癌¹を含む膵臓を苦しめる可能性がある。これら3つの疾患はすべて、即時治療を開発するだけでなく、病態生理をよりよく理解するために、研究の活発な分野をマークします。

標的治療的送達方法は有益であろう。我々は、膵臓細胞への薬物およびウイルス送達に有効かつ選択的な方法である膵管注入技術を開発した。このモデルでは、膵管は選択的にカニューレ化され、共通の胆管は閉塞され、膵臓への送達のみを可能にする。

この技術は、膵臓の発達および病理^2、3に重要な発達経路をさらに解明するために^、特定の細胞型の系統トレースを可能に^する。ウイルスベクターにおける異なるプロモーターは、細胞株の特異的標的化を可能にし、これらの細胞株^4、5に遺伝子を導入することを可能にする。この研究は、GFPを発現するウイルスベクターと偽手術を発現するウイルスベクターの膵管注入後の膵臓内の緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を実証する。

プロトコル

すべての動物実験は、ピッツバーグ小児病院の動物研究・ケア委員会とピッツバーグ大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されました。

1. 術前準備

1. 吸入イオブルラン(1 - メンテナンス時は3%、誘導では最大5%)を鼻コーンを介して適切な麻酔レベルに投与する。鉗子とつまみつまみによって麻酔の妥当性を監視する。応答の欠如は十分であると考えられ、呼吸抑制が起こる可能性があるため、過剰に投薬しないようにしてください。
2. 動物を背中に置いて、顕微鏡の解剖ステージに置き、腹部を目的の観点から中心にします。手術用テープで動物を固定化します。麻酔下で乾燥を防ぐために、動物の目に眼科軟膏を適用します。
3. 脱毛クリームの滑らかで厚い層を適用し、3分間所定の位置に残します。小さな部分で脱毛を確認してください。クリームと髪を70%エタノール浸しガーゼでそっと拭き取ります。
4. 70%エタノール浸しガーゼ、続いてベタジン浸しガーゼで拭いて動物の腹部を浄化し、消毒します。外科的処置を通して生殖不能状態を維持する。

2. 適切な露出

1. 皮膚に中線切開を行い、皮膚の中傷をメスを用いて、キシフォイドプロセスから臍に切開します。Adson鉗子で腹を持ち上げ、はさみを使って中線に小さな穴を開けます。
2. 腹膜切開を皮膚切開の長さに伸ばし、中線(リネアアルバ)に残るように注意する。
   注:これは上の中腹腹腔内手術を生成します。
3. 一般的な胆管を露出する鈍いレトラクターで肝臓を高めます。湾曲したブルドッグの血管クランプで共通の胆管をクランプします。
   注:この操縦は、肝臓への望ましくない注入を防ぎます。

3. 膵乳頭・十二指腸切毛術の同定

1. 十二指腸を識別し、アルガ鉗子で、乳頭を表示するためにそれを大きく引き込みます。
   注:乳頭は十二指腸の第2の部分の前表面の白い斑点です。
2. 十二指腸を大きく引き込み、膵管の経過を同定することを可能にする。301/2ゲージ針で、乳頭の真向かいにある十二指腸の壁を正接的に穿刺する。
   注: 針は十二指腸に入るダクトと同じ角度に従う必要があります。

4. 輸液。

1. カテーテルがダクト内に見えるまで、ステップ3.2で作成した十二指腸切欠切を通してカテーテルを通過させます。カテーテルをダクトに1cm以下に進め、副管支流のバイパスを防ぎます。
2. 2番目の湾曲したブルドッグの血管クランプでカテーテルを所定の位置にクランプします。ポンプの電源を入れ、選択したボリュームを注入します。注入される容積は25~250μLの範囲で、理想的な体積は約150μLです。
3. 約1.5mLの腹腔内注射を行い、損失を相殺します。乾燥を防ぐために湿ったガーゼで露出した腸を覆います。
4. 注入の終わりに、カテーテルを所定の位置に保持していたブルドッグクランプを取り外す。ブルドッグクランプを使用して、膵管からカテーテルを静かに取り外します。共通の胆管からクランプを解放します。
5. 実行中の縫合糸を使用して、腹と皮膚を1つまたは2つの層で閉じます。
   注:十二指腸切剖学は、単独で封印するので、閉じる必要はありません。
6. 術後鎮痛として、処置中に5mg/kgでケトフェンの用量を投与し、翌日に1回投与する。
7. マウスが回復するまで、ヒートランプの下のケージにマウスを戻します。マウスに食べ物と水のアドリビタムを提供します。
8. 胸骨の不参せを維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。完全に回復するまで、手術を受けた動物を他の動物の会社に返却しないでください。

5. サンプルの準備

1. 動物を二酸化炭素室に入れるか、子宮頸部脱臼を行う。
2. 膵臓を収穫します, コントロールとして脾臓, 肝臓, 十二指腸.4°Cで一晩パラホルムアルデヒドで組織を固定します。 前に説明した30%のショ糖でサンプルを一晩で凍結保護する^、6.
3. サンプルをスナップフリーズします。ミクロトームを使用して、6 μmの厚さの組織を切り離します。前述の⁷のように、蛍光イメージングを用いて顕微鏡でイメージングを行う。

結果

練習と慎重な外科技術では、これらのマウスの生存率は95%を超える必要があります。注入の1週間後、所望の効果は膵臓で明らかであるべきです。10~12週齢のマウスを膵管注入に利用した。ここでは、偽の手術と比較して、CMVプロモーターを有するアデノ関連ウイルス血清型8(AAV8)を用いて緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させる。マウス膵臓は、注入の7日後に収穫した。...

ディスカッション

この研究は、膵臓に遺伝子やその他の分子を特異的かつ効果的に送達するための効果的なマウスモデルである膵管注入の背後にある方法論を詳細に説明する。さまざまなグループ間の手順の詳細におけるあいまいさは、標準化されたプロトコル^8、9、10の必要性を強調した。

処置のいくつかの重要なス...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice (25-30g, 8-12 weeks old)	Jackson Laboratory
Ketofen	Henry Schein Inc.	5487
Ethanol (70%)	Sigma-Aldrich	34923
Sterile Saline Solution	Baxter Healthcare Corp.	2B-13-00
Protective Equipment
Hair Removal Product			Nair or trimmer
Gauze Pads 2in x 2in	Fisher Healthcare	22-362-178
Needles (30.5G and 25G)	Becton Dicksinson and Co.	305106 and 305122
Syringe for Ketofen and Saline	Becton Dicksinson and Co.	309657
Syringe for Pump	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Infusion Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Infusion Catheter	World Precision Instruments	CMF31G
Curved Bulldog Clamps (2)	Roboz	RS-7439
Arruga Forceps	Roboz	RS-5163
Adson Forcep	Roboz	RS-5234
Needle Holder	Roboz	RS-7882
Scissor	Roboz	RS-5982
Cotton Tip Applicators	Physician Sales and Services	22-9988
Dissecting Microscope
Suture	Owens and Minor	SXMD1B402