Infusione del dotto pancreatico: un metodo efficace e selettivo di somministrazione di farmaci e virus

Riepilogo

L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. Qui viene presentata una tecnica di infusione del dotto pancreatico per la somministrazione di farmaci e virali alle cellule pancreatiche.

Abstract

Il pancreas è un organo bifunzionale con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia. Ci sono pochi strumenti per promuovere queste aree di studio. L'infusione del dotto pancreatico è una tecnica importante che può consentire il tracciamento del lignaggio, l'introduzione del gene e il targeting specifico della linea cellulare. La tecnica richiede l'intricata dissezione della seconda porzione del duodeno e dell'ampolla, seguita dall'occlusione del dotto biliare e dalla cannolazione del dotto pancreatico. Sebbene la tecnica sia tecnicamente impegnativa all'inizio, le applicazioni sono miriadi. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standard. Questo lavoro descrive l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio. L'infusione e quindi l'espressione è specifica per il pancreas, senza espressione presente in nessun altro tipo di tessuto.

Introduzione

Il pancreas è un organo bifunzionale, con componenti sia endocrini che esocrini. Un certo numero di patologie possono affliggere il pancreas, tra cui diabete, pancreatite e cancro al pancreas¹. Tutte e tre queste malattie segnano aree di studio attive, non solo per sviluppare una terapia immediata, ma anche per comprendere meglio la loro fisiopatologia.

Un metodo di somministrazione terapeutica mirato sarebbe utile. Abbiamo sviluppato una tecnica di infusione del dotto pancreatico che è un metodo efficace e selettivo per la somministrazione di farmaci e virus alle cellule pancreatiche. In questo modello, il dotto pancreatico è selettivamente cannulato e il dotto biliare comune è occluso, consentendo la consegna esclusivamente al pancreas.

Questa tecnica può consentire il tracciamento del lignaggio di specifici tipi di cellule per chiarire ulteriormente le vie di sviluppo importanti per lo sviluppo pancreatico e la patologia^2,3. Diversi promotori nei vettori virali consentono il targeting specifico delle linee cellulari e l'introduzione di geni in queste linee cellulari^4,5. Questo lavoro dimostra l'espressione di una proteina fluorescente verde (GFP) all'interno del pancreas dopo l'infusione del dotto pancreatico di un vettore virale che esprime GFP rispetto a un intervento chirurgico fittizio.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la ricerca e la cura degli animali presso l'Ospedale pediatrico di Pittsburgh e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh.

1. Preparazione preoperatoria

1. Somministrare isoflurano per via inalatoria (1 - 3% per il mantenimento e fino al 5% per induzione) attraverso un cono nasale ad un livello anestetico appropriato. Monitorare l'adeguatezza dell'anestesia con il pizzico della dita con una pinza. La mancanza di una risposta è considerata adeguata e assicurarsi di non sovramedicare, poiché può verificarsi depressione respiratoria.
2. Posiziona l'animale sulla schiena sullo stadio del microscopio di dissezione, con l'addome centrato in vista dell'obiettivo. Immobilizzare l'animale con nastro chirurgico. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
3. Applicare uno strato liscio e spesso di crema deolazione e lasciarlo in posizione per 3 minuti. Controllare una piccola area per la depilazione. Pulire delicatamente la crema e i capelli con una garza imbevuta di etanolo al 70%.
4. Pulire e disinfettare l'addome dell'animale pulendolo con una garza imbevuta di etanolo al 70% seguita da una garza imbevuta di betadine. Mantenere condizioni sterili durante la procedura chirurgica.

2. Esposizione corretta

1. Fai un'incisione della linea mediana nella pelle dal processo xifoide all'ombelico usando un bisturi. Sollevare il peritoneo con pinza Adson e fare un piccolo foro nella linea mediana usando le forbici.
2. Estendere l'incisione peritoneale fino alla lunghezza dell'incisione cutanea, avendo cura di rimanere sulla linea mediana (linea alba).
   NOTA: Questo produrrà una laparotomia addominale della linea mediana superiore.
3. Elevare il fegato con riavvolgitori smussati per esporre il dotto biliare comune. Blocca il dotto biliare comune con un morsetto vascolare bulldog curvo.
   NOTA: Questa manovra impedisce l'infusione indesiderata nel fegato.

3. Identificazione della Papilla Pancreatica e Della Duodenotomia

1. Identificare il duodeno e, con la pinna di Arruga, ritrarlo caudalmente per visualizzare la papilla.
   NOTA: La papilla è una macchia bianca sulla superficie anteriore della seconda porzione del duodeno.
2. Ritrarre il duodeno caudalmente, consentendo l'identificazione del decorso del dotto pancreatico. Con un ago calibro 301/2, perforare la parete del duodeno tangenzialmente, direttamente di fronte alla papilla.
   NOTA: l'ago deve seguire lo stesso angolo del condotto quando entra nel duodeno.

4. Infusione.

1. Passare il catetere attraverso la duodenotomia creata nel passaggio 3.2 fino a quando il catetere è visibile all'interno del condotto. Far avanzare il catetere nel condotto non più di 1 cm per evitare il bypass degli affluenti duttali minori.
2. Bloccare il catetere in posizione con un secondo morsetto vascolare bulldog curvo. Accendere la pompa e infondere il volume selezionato. Il volume infuso può variare da 25 a 250 μL, con un volume ideale di circa 150 μL.
3. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di circa 1,5 ml di soluzione salina per compensare le perdite. Coprire l'intestino esposto con una garza umida per prevenire l'essiccazione.
4. Al termine dell'infusione, rimuovere il morsetto del bulldog che teneva il catetere in posizione. Utilizzare il morsetto bulldog per rimuovere delicatamente il catetere dal dotto pancreatico. Rilasciare il morsetto dal dotto biliare comune.
5. Chiudere il peritoneo e la pelle in uno o due strati usando una sutura in esecuzione.
   NOTA: non è necessario chiudere la duodenotomia, poiché si sigilla da sola.
6. Come analgesia postoperatoria, somministrare una dose di ketofene a 5 mg/kg durante la procedura e una il giorno successivo.
7. Riportare il mouse nella sua gabbia sotto una lampada di calore fino a quando non si riprende. Fornire al mouse cibo e acqua ad libitum.
8. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinata sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.

5. Preparazione del campione

1. Posizionare l'animale in una camera di anidride carbonica o eseguire la lussazione cervicale.
2. Raccogli il pancreas, con la milza, il fegato e il duodeno come controlli. Fissare i tessuti in paraformaldeide durante la notte a 4 °C. Crioproteggere il campione in saccarosio al 30% durante la notte, come descritto in precedenza⁶.
3. Snap-freeze i campioni. Sezionare il tessuto ad uno spessore di 6 μm utilizzando un microtomo. Eseguire l'imaging su un microscopio con imaging a fluorescenza, come descritto in precedenza⁷.

Risultati

Con la pratica e un'attenta tecnica chirurgica, il tasso di sopravvivenza di questi topi dovrebbe essere superiore al 95%. Una settimana dopo l'infusione, l'effetto desiderato dovrebbe essere evidente nel pancreas. I topi a 10-12 settimane di età sono stati utilizzati per le infusioni del dotto pancreatico. Qui usiamo un sierotipo 8 del virus adeno-associato (AAV8) con un promotore CMV per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), rispetto a un intervento chirurgico fittizio. I pan...

Discussione

Questo lavoro descrive in dettaglio la metodologia alla base dell'infusione del dotto pancreatico, un modello murino efficace per la consegna di geni e altre molecole in modo specifico ed efficace al pancreas. L'ambiguità nelle specifiche della procedura tra i vari gruppi ha evidenziato la necessità di un protocollo standardizzato^8,9,10.

Ci sono diversi passaggi critici della procedura, a partire da...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice (25-30g, 8-12 weeks old)	Jackson Laboratory
Ketofen	Henry Schein Inc.	5487
Ethanol (70%)	Sigma-Aldrich	34923
Sterile Saline Solution	Baxter Healthcare Corp.	2B-13-00
Protective Equipment
Hair Removal Product			Nair or trimmer
Gauze Pads 2in x 2in	Fisher Healthcare	22-362-178
Needles (30.5G and 25G)	Becton Dicksinson and Co.	305106 and 305122
Syringe for Ketofen and Saline	Becton Dicksinson and Co.	309657
Syringe for Pump	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Infusion Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Infusion Catheter	World Precision Instruments	CMF31G
Curved Bulldog Clamps (2)	Roboz	RS-7439
Arruga Forceps	Roboz	RS-5163
Adson Forcep	Roboz	RS-5234
Needle Holder	Roboz	RS-7882
Scissor	Roboz	RS-5982
Cotton Tip Applicators	Physician Sales and Services	22-9988
Dissecting Microscope
Suture	Owens and Minor	SXMD1B402