プラナリアで瞳の再生を研究するための外科切除アッセイ

要約

このプロトコルは、一貫して、周囲の組織を乱すことなく、プラナリア目（光学カップ）を切除する方法を示しています。インスリン注射針と注射器を使用して、一方または両方の目のどちらかは、目の再生、視覚的な再生の進化、および光誘起行動の神経基盤を調節するメカニズムの調査を容易にするために、アブレーションさせることができます。

要約

成体幹細胞と再生機構の研究では、プラナリア扁形動物は、in vivoモデル系の主食です。これは彼らの豊富な多能性幹細胞集団と、ほとんどの動物のために壊滅的だろう怪我した後、すべての細胞や組織の種類を再生する能力に大きな部分的に起因します。最近、プラナリアは、目の再生のためのモデルとして人気を得ています。 （2つの組織タイプから成る：色素細胞及び光受容体）全体の目を再生する能力は、視覚系の再生を制御する機構の切開を可能にします。眼アブレーションは、再生だけで眼の組織に大きく制限されていることが最も重要なものの眼特異的経路およびメカニズムを調べるため（例えば断頭又は穴パンチのような）他の技術を超えるいくつかの利点を有します。このビデオの記事の目的は、確実に脳を乱すまたは組織を囲むことなく、プラナリアの光学カップを削除する方法を実証することです。ワームや確立コロニーのメンテナンスの取り扱いも記載されています。この技術は、外科的にコールドプレート上に固定化されたプラナリアの眼杯をかき出すために31 G 5/16インチのインスリン針を使用します。この方法は、アプリケーションの広い範囲を可能にする、目が1〜2週間以内に再生すると、単一及び二重の両方の目の切除を包含する。特に、このアブレーション技術は、容易に再生機構とその進化、目の幹細胞およびそれらの維持、及びphototaxic行動反応とその神経基盤のより良い理解のために、薬理学的および遺伝的（RNA干渉）スクリーンと組み合わせることができます。

概要

プラナリアは、成体幹細胞媒介再生を研究するための強力なモデル生物です。これらの非寄生淡水扁形動物は、その中枢神経系および脳¹を含む任意およびすべての不足している組織を、再生する能力を有しています。 （ インサイチュハイブリダイゼーション 、免疫組織化学、RNA干渉（RNAi）、およびトランスクリプトでは 、このような配列決定ゲノムなど）にまでさかのぼる過去10〜15年間プラナリア分野において1700年代^2、技術の進歩などの検討は、この歴史的なモデル生物を更新しました。具体的には、プラナリアは最近、目の研究の³のための新たなモデルとして人気を得ています。

プラナリアは2つだけの組織タイプ、感光体の神経細胞と色素細胞との原型の目を持っています。これは、その目の幹細胞集団の特性を有効にし、同じ遺伝子の多くは、脊椎動物の眼ドを規制することを示しましたvelopmentはプラナリア^4,5に保存されています。光学カップは視交叉を介して脳を背側に位置する感光体ニューロン及び半月黒色素細胞の白、無着色の樹状突起で構成され、目の神経支配されています。再生プロセス^6を解明するためのモデルであることに加えて、プラナリア眼は光に対して視覚的機構^7、行動反応の進化を研究に適している^8、及び行動⁹の神経学的基礎（プラナリアは、負の走光性を表示します）。

断頭^4、10以下のヘッド再生の一部として、ちょうど眼組織¹¹の切除に続いて^、12：プラナリアにおける眼の再生は、主に二つの主要な文脈で検討されています。それは単純明快であるとして、目の再生のほとんどのプラナリアの研究では、断頭メソッドを使用しています。いくつかの研究はまた、単に目（部分断頭^）15の後ろに切断術を行っているがこれまでで最も一般的なプラナリア眼の切除方法は、細かいガラス毛細管^13、14とパンチ穴を経由してきました。しかし、これらの方法の全ては、潜在的に結果の解釈を複雑に、（例えば、脳、腸、およびnephridiaなど）だけで、目以外の多くの組織の喪失を伴います。ここに提示眼アブレーションプロトコルは、眼に対してより特異的であるデータが得られた（具体的には脳を除く）眼組織への切除を制限します。また、給紙を開始するために7~14日かかる断頭ワームとは異なり、眼アブレーションワームperformeする（RNAiは食物を介して送達される）RNAi実験を可能にする、切除¹²の24時間以内に送ります同時にdは。

目のアブレーションが正常に断頭よりも実行することは技術的に難しいですが、目の切除を含む現在の研究では、その手順の詳細な手順を含めていません。このビデオの記事の目標は、一貫して基本的な脳組織を乱すし、できるだけ少ない他の組織を除去することなく、プラナリアの光学カップを削除するために、研究者を有効にすることです。この方法は、単一及び二重の両方の目の切除のために使用され、研究の広い範囲に適用可能であることができます。最も再生アッセイのような、眼の切除は、薬理学的および遺伝的（のRNAi）スクリーニング、ならびに行動研究の両方との組合せに適しています。ここでは、プラナリアコロニー、および眼のアブレーション技術自体を維持し、ワームの取り扱い方法について説明します。

プロトコル

1.動物文化と取り扱い

注：このプロトコルは、一般的に再生研究のために使用されているSchmidteaメディ 、配列決定されたゲノム¹⁶と二倍体プラナリア種^、17を使用しています。しかし、このアッセイは、Girardia tigrina及び（市販されている）Girardia dorotocephalaなどの他の種と同等に成功しています。

1. 超高純度（又は濾過脱イオン）中、0.5g / Lの海の塩から作られた「ワームの水」は、水にワームを維持します。ワームの水を保持するために、滅菌ポリプロピレンまたはガラス容器を使用します。参照してください。 補足ファイル1ワーム水の準備の詳細については、を。
   注：石鹸などの容器（または他の消耗品）をきれいに石鹸を使用しないでくださいは、虫に対して毒性です。代わりに70％エタノールで拭いて空気乾燥させ。 <オール>
2. 汚染から守るためにプラナリアと協力しながら、手袋を着用してください。
   注：ワームは、石鹸、漂白剤、シャンプー、コンディショナー、ハンドローションを含め、環境有害物質や化学物質に非常に敏感です。

蓋付きポリプロピレン製食品容器の家コロニーは、〜20°C（室温）での空気交換のために、部分的に開いたまま。 （12ウェルプレート用のウェルあたり1つのワーム）ペトリ皿（100mmの皿当たり20のワーム）、または無処理の組織培養プレートのいずれかに保管実験ワーム。ストレスを減らすために、暗闇の中でコロニーと実験の両方を保持します。
注：コロニーはワーム水1リットル当たりがない以上500〜1,000未満のワームを持っている必要があります。気流がこれらの皿に設計されているので、実験のために、所定の位置に完全に蓋を残します。

コンテナ全体の食品の滴を配置し、トランスファーピペットからピューレをドロップすることにより、ピューレ、有機牛肉や鶏肉肝臓で週に一度非実験ワームをフィード。食品を消費するワームに2時間を許可しますコンテナをクリーニングする前に、暗い（ステップ1.4を参照）。長期（数ヶ月）のためにC°、短期のために-20℃で保存ピューレ（週）を使用するか、または-80前。 （細菌が咲きやワームに害を及ぼすことができるように）再利用のためピューレを再凍結していません。
注：肝臓は何のホルモンや抗生物質を含まず、好ましくは、以前に凍結してはなりません。遠心凍結前にピューレ（または前送りする）は、空気を除去し、フローティングから食べ物を防止します。食品容器の底に沈むはずです。ピューレの1mLを500-1,000ワームのために十分です。

コロニーと実験の両方のための新鮮なワーム水で週に一度交換水。コロニーコンテナもワームを飢え週1回（そのトラップ廃棄物を粘液残留物を除去するために）無漂白紙タオルで拭き、または週二回のワームを供給するためのする必要があります（2時間2日後に再び供給した後）。バイオフィルムを保持するために、コンテナの80％以上を拭かないでください。

コンテナ（または手術setu間のワームを移動しますP）トランスファーピペットを使用して。コンテナの表面に付着した無料のワームに、表面からそれを解放するためにワームの背後に/上に水を噴出。ピペットの底インチ（薄い）部分内でワームを維持しようとしながら、ピペットにワームを吸い上げます。

1. それらを吸引する前に、ワーム少量の水とバックロードピペット。
2. ピペットでタッチして、ソフトボディのワームを引き裂く防ぐために、むしろワーム自体よりも、ワームの周りに水を移動しよう。
3. ワームを転送するか、水を交換しない限り、カバーされた実験の料理をしてください。

2.準備

1. 実験前に少なくとも1週間ワームを送り停止します。
   1. ≥1週間飼育し、長さが少なくとも5〜7ミリメートルですされていないされているワームを選択します。ウォーム水の完全なペトリ皿2/3にワームを転送し、そして皿の下に定規をスライドさせてウォームの長さを確認します。 wを測定オームズ完全に拡張し、移動しながら。
      注：その後の免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーション分析において 、より大きなワーム（8〜10 mm）を行うと作業が容易であるときに小さく（5~7 mm）の線虫が良く機能するが-特にときに切除するために学びます。
   2. ワームは、全体損傷していない、と最近再生されないことを確認してください。
      注：再生成ワームは、通常、ワームに比べてはるかに軽い（または全くない）ヘッド中の顔料及び/又はテール領域があります。
   3. ワームに対するRNAiまたは薬理学的治療を行った場合は、この時点で行ってください。ワームは、治療（RNAiのためのような）の一部として供給した場合、2.2のステップに続行する前に少なくとも7日間の最後の給餌後に待ちます。
2. 作業スペースをきれいにし、70％エタノールで顕微鏡基盤を解剖し、それが完全に乾燥させます。スコープの左側に選択されたワームの皿を置き。スコープの右に、5/16インチのインスリン針1と＃5鉗子のペア、31 Gを配置mLシリンジ、およびクリーンなトランスファーピペット。
   1. 楽器は（汚染物質を導入する可能性）ベンチに触れてから保管されていることを確認してください。クリーン鉗子、針、およびピペットを保つために（たとえば、箸置きなど）は、剛性のアイテムを使用してください。また、新鮮な茶（無漂白）ペーパータオルの上に場所の楽器。
      注：彼らは右利きの人に関係するとして、これらと後続の命令が書かれています。左利きの人は、左/右の方向を逆にする必要があります。
3. 次のワークスペースに、リントフリーのティッシュワイプのボックス、新鮮なワームの水の供給源、および（ベンチトップから保護）いくつかの余分な転送ピペットを配置します。調剤を容易にするためにプラスチック製の洗浄瓶に入れワーム水。また、切除された動物を収集するためのスコープの右側に標識された12ウェルプレート（または100 ム・ペトリ皿）を置きます。
4. ワームを固定するためにカスタムメイドペルチェプレートを使用する場合、Tの凹部にペルチェプレートを位置決め彼解剖顕微鏡のベースとペルチェプレートの作用面が十分に冷却されるまで、DC電源に出力を調整（典型的には約5 V）.Alternatively 1/2水と完全に100 ム・ペトリ皿を充填しコールドプレートを作ります少なくとも24時間凍結。蓋を捨て、解剖範囲のベースの上に100mmの皿の底に置き、次いで氷（図1A）の表面に直接逆さまに60 ム・ペトリ皿の蓋を置きます。
   1. 水が100 mmディッシュ中で凍結した後、氷の「火山」は、プレートの中央に表示されます。この問題が発生した場合、表面から任意の凹凸を取り除くために、氷のフラットをこすりするカミソリの刃を使用します。
      注：手術中に氷がアブレーションがはるかに困難に、溶けてしまいます。事前にいくつかの氷の皿を準備し、そして、すぐに60ミリメートル皿のふたが浮い始まりとしてアッセイ中のものを溶融するため、冷凍ものを交換してください。
5. 作ります手術表面。プラスチックパラフィンフィルム5cmのX 10cmの片に切断（4 cm ^2であればシャーレコールドプレートを使用）、固定装置の中心に置きます。リントフリーのティッシュを折っ平方およそ^2cm角にワイプやフィルムの上に置きます。白い濾紙1.5-2センチ²の部分をカットし、ワイプの上に置きます。図1B-1Eを参照してください。
   1. 折りたたまれたホールド手袋をはめた指で所定の位置に拭き、軽くそれが折り畳まれたままであることを保証するためにワイプ減衰させるためにワームの水を使用しています。フラットワイプロールホールピペットの側面を使用してください。
      注：冷たい温度が動くからワームを維持するのに役立ちます。作業する「乾燥」も固定化するのに役立ちます。組織は、（致死である）ワームは完全に乾燥させることなく、手術中に湿ったワームを保ち、濾紙を通して水を吸い上げるように作用するワイプ。

3.外科切除

1. 上に置くために、転送ピペットを使用してください濾紙上に電子ワームの背側アップ。上の光源の電源を入れ、光がワームに焦点を当てているように、グースネックを指示。目がはっきり見えるように（全体のワームは、ビュー内にある必要はありません）解剖スコープの焦点と倍率を調整します。 5X倍率は良い出発点です。ヘッドは、（顕微鏡の正面に向かって）研究者に向かって指摘されるように、右に、角度付き30-40度をパラフィンフィルムを回転させてウォームを方向付けます。
   1. 過剰ワームの動きを防ぐために、明るい光の使用は避けてください。プラナリアは、負の走光性を表示し、明るい光を回避しようとします。
   2. ワームは（咽頭可視開口を有する）上向き腹側に位置する場合、緩やか（目可視で）ワームの背側を再配置する鉗子の鈍い面を使用。動物を再配置する際に軟組織を通じて引き裂くの可能性を最小限にするために鉗子の鋭い先端を動物に近づいて避けてください。
   3. 目の焦点が合って明確になるように顕微鏡の焦点を調整します。また、目や周囲の頭部組織の両方が視野にあることを確認してください。
2. それは（親指と人差し指の間）のペンであるかのように右手で新鮮な針/注射器を保持します。ペルチェプレート（またはペトリ皿コールドプレート）に対する左手の親指を支える、シリンジの底部が載るれるに支点（図2A）のように左手の親指を使用します。顕微鏡を通して見て、針のベベルが表示されていることを確認してください。
   注：針は非常に鋭いです。それらを取り扱う際は注意してください。ラテックスまたはニトリル手袋を身に着けていることは、いくつかの保護を提供することができます。
   1. 手順を通して針/シリンジ安定を保持し、握手を避けるために左手の親指を使用してください。
   2. 手術の表面安定を保持するのを助けるために左手の親指と（手術表面上の人差し指で）左の人差し指で約40°の角度をなします。
3. とともに（スプーンのように）上向き針のベベルは、眼（図2B）に直角に針を配置します。穏やかに右から左にすくい、眼の眼杯（白、無着色領域）を覆う組織の薄い層を貫通する針の先端を使用します。非常にゆっくりと底に穴をあけたり、光学カップの境界を破壊しないように注意しながら、光学カップ内に配置された任意の着色された組織を除去します。
   1. ワームは手続き中の任意の時点で> 1-2分間ろ紙にされている場合は、ワームを再水和するためにワームの水の一滴を追加します。
      注：脱水は怪我をリッピングするワームの感受性を増加します。
4. 繰り返し黒色着色組織（色素細胞）の全てまでステップ3.3、ならびに光学カップ（光受容細胞の樹状突起）の白色組織の全てが除去されます。丁寧に拭くティッシュで拭いて針の端部に付着し、切除した組織を削除します。二重の目ABLAた場合ンは、所望この時点で第2の眼を切除されています。
   注：けがを避けるために、針はきれいなティッシュで針をつかんで洗浄することができ、その後、親指と人差し指から拭き取るを通じて針を引っ張るためにもう一方の手を使って、親指と人差し指で開催されたワイプ。あるいは、針は、ワイプウェットティッシュの表面上に拭い、清潔のために調べることができます。
5. 完了したら、新鮮なワームの水を含有する標識された皿にワームを移動する移送ピペットを使用。グループのデータを分析した場合、単一の100ム・ペトリに20のワームまで置きます。時間をかけて同じ個体で再生を追跡する場合は、12ウェルプレートの各ウェルに1つのワームを置きます。すべてのワームが転送されると、皿/ウェルから全てのワーム水を除去し、より新鮮ウォーム水で置換することによりワームをすすぎます。
   1. フィルタからワームを除去するために、ウォーム少量の水を有するピペットをバックロードし、ワームに水を放出します。これは、トンを持ち上げる必要がありますろ紙オフ彼ワームは、すぐに転送用のピペット内に吸引されます。
6. 光から保護〜20°C（室温）での実験をインキュベートし、再生プロセスに従ってください。
   注：ワームは、一定の温度を維持するために温度制御インキュベーター内に保存することができるが、これは厳密には必要ではありません。ほとんどの部屋の温度が再生成するワームの能力には影響しません5℃の、によってのみ異なります。
7. 所望される場合、および/またはin situハイブリダイゼーション （ 図3-4を参照）、免疫組織化学のためにワームを固定する遺伝子発現の解析。異なる固定方法は、プラナリア、免疫組織化学^18、19、20及びin situハイブリダイゼーション ^{21、22、23の}プロトコルに存在します。
8. 実験が締結され、sacrifiCEは皿からワーム水を除去し、70％エタノールで置き換えることにより、ワームを生きます。灰色がかっを溶解し、オンにするワームをチェックし、3-5分間ワームをインキュベートします。
9. 一度殺し通常の廃棄物の流れにおける非処理ワームを置きます。環境、特に非在来種へのライブワームを導入することは避けてください。

結果

最初の1-2時間後に手術のために、動物は、無傷のワーム（彼らはまだ移動するが）に比べて減少運動を示すことができます。所望であれば、ワーム（例えば、RNAiの供給のための）手術の24時間以内に食べるようになります。時間をかけて同じ個体では、目の再生を以下の場合は、手術前（未使用）にし、1時間後アブレーション（HPA）の両方で各ワームの写真を撮るよ...

ディスカッション

この眼アブレーション技術は、脳組織を除くと眼組織に主に切除を制限することによって（例えば、ホールパンチなど）現行の方法を改善します。練習では、この技術は、経験の浅いが、良心的な学部の学生にmicrosurgeriesに経験した技術者から、ほとんどの人によって行うことができます。なお、この技術は、前免疫組織化学によって、または眼のマーカー^<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional