Хирургическая абляция Анализ для изучения Регенерации глаз в планарии

Резюме

Этот протокол показывает, как последовательно акцизный планарии глаз (оптические чашки) без нарушения окружающих тканей. С помощью иглы и шприца инсулина, либо один или оба глаза могут быть абляции, чтобы облегчить расследование механизмов, регулирующих регенерацию глаз, эволюцию визуальной регенерации, а также нейронную основу светоиндуцированного поведения.

Аннотация

В исследовании взрослых стволовых клеток и регенеративных механизмов, планарии плоских черви являются одним из основных продуктов в естественных условиях модельной системы. Это связано в значительной степени с их обильной плюрипотентных популяции стволовых клеток и способность к регенерации всех типов клеток и тканей после травм, которые были бы катастрофическими для большинства животных. В последнее время планарий завоевал популярность в качестве модели для регенерации глаз. Их способность к регенерации всему глаза (состоит из двух типов тканей: пигментные клетки и фоторецепторов) позволяет рассечения механизмов, регулирующих визуальную регенерации системы. Глаз абляция имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами (такими как обезглавливание или перфорация) для изучения глазных конкретных путей и механизмов, наиболее важными из которых является то, что регенерация в основном ограничиваются только тканями глаза. Цель этого видео статьи является показать, как надежно удалить планарии оптической чашки, не нарушая мозг или окружающие ткани.Обработка червей и поддержания установленной колонии также описана. Эта методика использует 31 г, 5/16-дюймовый инсулина иглы хирургическим путем выкопать оптический чашку планарий, иммобилизованных на холодную пластину. Этот метод включает в себя как одиночный и двойной абляции глаза, с глазами регенерирующих в течение 1-2 недель, что позволяет в широком диапазоне применений. В частности, этот метод абляции можно легко сочетать с фармакологическими и генетическими (РНК-интерференции) экраны для лучшего понимания регенеративных механизмов и их эволюции, стволовых клеток глаза и их содержание, а также phototaxic поведенческих реакций и их неврологической основе.

Введение

Планарии являются мощным модельным организмом для изучения клеточной регенерации взрослых стволовых. Эти непаразитарных пресноводные плоские черви обладают способностью регенерировать любые и все недостающие ткани, в том числе их центральной нервной системы и головного мозга ^1. Училась еще в 1700 - х годах ^2, технологические достижения в области планарий в течение последних 10-15 лет (например, виртуализированного геном, гибридизация, иммуногистохимии, РНК - интерференции (иРНК), и транскриптомика в) обновили эту историческую модель организма , В частности, планарий недавно приобрел популярность в качестве новой модели для исследования глаза ^3.

Планарии имеют прототипический глаз только с двумя типов тканей, фоторецепторы нейронами и пигментными клетками; это позволило охарактеризовать ее глаз стволовых клеток населения и показал, что многие из тех же генов, регулирующих позвоночный глаз деvelopment сохраняются в планарии ^{4, 5.} Оптические чашки расположены дорсально и состоят из белых, окрашенных пигмента дендритов нейронов фоторецепторов и пол-лунным черного пигмента клеток, а глаза иннервируют мозг с помощью зрительного перекреста. Помимо того , что модель для выяснения регенеративных процессов ^6, планарии глаз хорошо подходят для изучения эволюции зрительных механизмов ^7, поведенческие реакции на свет (планарий отображать отрицательный фототаксис) ^8, и неврологическую основу поведения ^9.

Глаз в регенерации планарий была в значительной степени изучена в двух основных контекстах: в качестве части головки регенерации следуя обезглавливание ^{4, 10,} и после иссечения только тканей глаза ^{11, 12} . Большинство планарий исследования по регенерации глаз использовали метод обезглавливание, как это просто и понятно. Наиболее распространенный метод планарии глаз иссечения до настоящего времени был через отверстие пуансон с тонким стеклянной капиллярной трубкой ^{13, 14,} хотя некоторые исследования также проводили ампутации только позади глаз (частичная декапитации) ^15. Тем не менее, все эти методы предполагают потерю многих других, чем просто глаз тканей (например, мозга, кишечника, и нефридиев), потенциально усложняет интерпретацию результатов. Протокол глаз абляции, представленный здесь ограничивает иссечение в ткани глаза (в частности, за исключением головного мозга), в результате чего данные, которые являются более специфическими для глаз. Кроме того, в отличие от обезглавленных червей , которые принимают 7-14 дней , чтобы начать кормление, глазные абляции черви будут кормить в течение 24 часов абляции ^12, что позволяет RNAi эксперименты (там , где иРНК доставляется через пищу) , чтобы быть performed одновременно.

Хотя глаз абляция технически сложнее, чтобы успешно выполнить, чем обезглавливание, в настоящее время исследования с участием глаз иссечение не включены подробные инструкции по их процедур. Цель этого видео статьи позволит исследователям, чтобы последовательно удалить планарии оптической чашки, не нарушая основные ткани мозга и удаления, как несколько других тканей, как это возможно. Этот метод может быть использован как для одиночного и двойного абляции глаза и применимо к широкому кругу исследований. Как и большинство анализов регенерации, глаза абляция хорошо подходят для комбинации с обеими фармакологическими и генетическими (RNAi) экранами, а также поведенческими исследованиями. Здесь мы опишем методы для обработки червей, поддерживая планарии колонию, а сама техника глаз абляции.

протокол

1. Культура животных и регулировать

Примечание: Этот протокол использует Schmidtea Mediterranea, диплоидные планарии видов с виртуализированным геномом ^{16, 17} , который обычно используются для исследования регенерации. Тем не менее, этот анализ в равной степени успешный с другими видами, такие как Girardia Tigrina и Girardia dorotocephala (которые являются коммерчески доступными).

1. Поддерживать червь в «червячной воде» , изготовленной из 0,5 г / л морской соли в сверхчистом (или фильтрованной) деионизированной воде. Используйте стерильные полипропиленовые или стеклянные контейнеры для хранения червя воды. См Дополнительный файл 1 для дополнительной информации о подготовке червяк воды.
   Примечание: Никогда не используйте мыло для очистки контейнеров (или других материалов), как мыло является токсичным для червей; вместо того, чтобы уничтожить 70% -ным этанолом и дают высохнуть на воздухе. <ол>
2. Надевайте перчатки при работе с планарии, чтобы защитить их от загрязнения.
   Примечание: Черви очень чувствительны к окружающей среде токсинов и химических веществ, включая мыло, дезинфицирующие, шампунь, кондиционер и лосьон для рук.

Дом колонии в контейнеры для пищевых продуктов из полипропилена, с крышкой влево частично открыта для обмена воздуха при ~ 20 ° С (комнатная температура). Хранить экспериментальные черви либо в чашках Петри (20 червей в мм блюда 100) или необработанные ткань-культуральные планшеты (1 червь на лунку, для 12-луночных планшетов). Для того, чтобы уменьшить стресс, держать обе колонии и эксперименты в темноте.
Примечание: Колонии должны иметь не более 500-1000 червей на литр воды червя. Для экспериментов, оставьте крышки полностью на месте, так как воздушный поток разработан в эти блюда.

Поток неэкспериментальных червей один раза в неделю с пюре из органической говядины или куриной печенью, понижая пюре из пипетки передачи, помещая каплю пищи в баллоне. Разрешить Worms 2 ч, чтобы потреблять пищу втемный перед очисткой из контейнера (см шаг 1.4). Перед использованием, хранить пюре при -20 ° С в течение кратковременных (недели) или -80 ° С в течение длительного времени (месяцы); не замораживать пюре для повторного использования (как бактерии могут цвести и вредят червь).
ПРИМЕЧАНИЕ: Печень не должна содержать гормоны или антибиотики, и предпочтительно не быть предварительно заморожено. Центрифуга пюре перед замораживанием (или перед подачей), чтобы удалить воздух и предотвратить пищу из плавающих. Пища должна опуститься на дно контейнера. 1 мл пюре достаточно для 500-1000 червей.

Обмен воды один раз в неделю со свежей водой червяка для обеих колоний и экспериментов. Colony контейнеры также следует протереть с небеленой бумажным полотенцем (чтобы удалить остатки слизи, что ловушка отходов) один раз в неделю для голодающих червей, или два раза в неделю для кормления червей (2 ч после кормления и снова через 2 дня). Для того чтобы сохранить биопленки, не вытирают более чем на 80% емкости.

Перемещение червей между контейнерами (или хирургии сетур) с помощью пипетки передачи. Для свободных червей, прилипших к поверхности контейнера, впрыскивает воду на / за червем, чтобы освободить его от поверхности. Затем сосет червь в пипетку, при попытке сохранить червь в пределах нижнего дюйма (тоньше) части пипетки.

1. Backload пипетка с небольшим количеством воды до червячной сосать их.
2. Попробуйте переместить воду вокруг червя, а не сам червя, чтобы помочь предотвратить разрывая мягкотелые червь, касаясь их с помощью пипетки.
3. Храните экспериментальные блюда не распространяется, если передача червей или замены воды.

2. Подготовка

1. Хватит кормить червей , по крайней мере за одну неделю до начала экспериментов.
   1. Выберите червей, которые не кормили в течение ≥1 недели и являются по крайней мере, 5-7 мм в длину. Передача червей на чашку Петри 2/3 полной червь воды, и подтвердить длину червячной сдвинув линейку под блюдо. Мера жORMs пока полностью выпрямлены и перемещение.
      Примечание: В то время как меньше (5-7 мм) черви работают лучше при выполнении последующей иммунофлюоресценции и в гибридизация анализов, крупные червей (8-10 мм) , легче работать - особенно при обучении абляции.
   2. Убедитесь, что черви целы, неповрежденные, а не в последнее время регенерации.
      Примечание: Восстанавливающий черви будет иметь намного более легкий (или нет) пигмента в головке и / или хвостовой области по сравнению с нормальными червями.
   3. При выполнении RNAi или фармакологических методов лечения червей, сделать это на данном этапе. Если черви подавались как часть лечения (как и для RNAi), подождите, по крайней мере 7 дней после последнего кормления, прежде чем перейти к шагу 2.2.
2. Очистите рабочее пространство и рассекает микроскоп базу с 70% этанолом и дайте ему полностью высохнуть. Поместите блюдо из выбранных червей в левой части области. Справа от сферы, разместить пару # 5 щипцов, 31 G 5/16-дюймового инсулин иглы с 1мл шприц, и чистые пипетки передачи.
   1. Убедитесь в том, что инструменты удерживаются от прикосновения к скамейке (который может ввести загрязняющие вещества). Используйте жесткий элемент (такие как палочки покой), чтобы держать щипцы, иглу и пипетки чистыми. В качестве альтернативы, место инструменты на верхней части свежего коричневого (небеленой) бумажным полотенцем.
      Примечание: Эти и последующие инструкции написаны как они относятся к праворуким лицам. -Левша люди должны поменять местами правый / левый направления.
3. Рядом с рабочим местом, поместите коробку безворсовых салфеток ткани, источник пресной воды червя, а также некоторые дополнительные пипетки передачи (защищенные от поверхности стола). Место червь воды в пластиковой бутылке мытья для облегчения дозирования. Кроме того, место меченого 12-луночного планшета (или 100 Мм Петри Петри) справа от объема для сбора ABLATED животных.
4. При использовании на заказ Пельтье пластины для иммобилизации червей, поместите пластину Пельтье в углубление в тон основание рассекает микроскопа и корректировать выходной сигнал от источника питания постоянного тока, пока рабочая поверхность пластины Пельтье не достаточно круто (обычно ~ 5 В) .Alternatively, сделать холодную пластину, заполняя 100 Мм Петри Петри с половиной полный с водой и заморозить в течение по крайней мере 24 ч. Удалите крышку и поместите в нижней части 100 мм тарелки на основании рассекает объема, а затем поместить крышку тарелки 60 Мм Петри верхней стороной вниз непосредственно на поверхности льда (фиг.1А).
   1. После того, как вода замерзла в 100 мм блюдо, «Вулкан» льда может появиться в центре пластины. Если это происходит, используйте лезвие, чтобы скоблить ровный лед, чтобы удалить любые неровности с поверхности.
      Примечание: Во время операции лед растает, что делает абляции гораздо сложнее. Приготовьте несколько ледяных блюд заранее, и заменить замороженные для плавления те, в процессе анализа, как только крышка 60 мм блюда начинается с плавающей.
5. Подготовкахирургия поверхности. Вырезать 5 см х 10 см кусок пластиковой парафиновой пленки (4 см ² при использовании Петри холодной пластины) и поместите его в центре иммобилизации устройства. Fold безворсовой ткани протереть в квадрат примерно-см ² и поместить его в верхней части пленки. Вырезать кусок белой фильтровальной бумаги 1,5-2 см ² и поместите его в верхней части салфетки. Смотрите рисунок 1В-1Е.
   1. Держите сложенный протирать место с пальцем в перчатке, и использовать червячный воду слегка смочить салфетку, чтобы убедиться, что она по-прежнему сложена. Используйте сторону переноса пипетки свернуть салфетку плоским.
      Примечание: Холодная температура помогает держать червь двигаться. Работа «сухой» также помогает в иммобилизации. Ткани протереть акты впитывать воду через фильтровальную бумагу, держа червь влажным во время операции, не позволяя черви полностью высохнут (которая является летальным).

3. Хирургическая аблации

1. Использование передачи пипетки поместить нае червяк спинной стороной вверх на фильтровальную бумагу. Включите источник света, и направить Гуснекс так, что свет фокусируется на червя. Отрегулировать рассекает фокус области действия и увеличение таким образом, чтобы глаза четко видны (весь червь не должен быть в поле зрения); 5X увеличение является хорошей отправной точкой. Сориентируйте червь, вращая парафиновую пленку так, чтобы голова направлена ​​в стороне исследователя (по направлению к передней части микроскопа), под углом 30-40 градусов вправо.
   1. Избегайте использование яркого света, чтобы предотвратить избыточное движение червя. Планарии отображение отрицательного фототаксиса и будут пытаться уклониться от яркого света.
   2. Если червяк установлен вентральная сторона вверх (с глоточным открытием видимыми), используйте тупую сторону пинцета аккуратно переставить червячные спинную сторону вверх (с глазами видимыми). Избегайте приближается животное с острым кончиком пинцета, чтобы свести к минимуму вероятность разрыва через мягкие ткани, когда репозиционирование животное.
   3. Отрегулируйте фокус микроскопа так, что глаза четко в фокусе. Кроме того, убедитесь, что оба глаза и окружающие ткани голов находятся в поле зрения.
2. Удерживая свежую иглу / шприц в правой руке , как если бы это была ручка (между большим и указательным пальцами). Brace большой палец левой руки по отношению к пластине Пельтье (или чашки Петри холодной пластины), а также использовать большой палец левой руки в качестве опоры , на которой нижняя часть шприца будет покоя (рис 2A). Посмотрите через микроскоп, и убедитесь , что скос иглы виден.
   Примечание: Иглы очень острые. Будьте осторожны при обращении с ними. Надев латексные или нитриловые перчатки может предложить некоторую защиту.
   1. Используйте большой палец левой руки, чтобы помочь держать иглу / шприц устойчивый в течение всей процедуры и избегать рукопожатий.
   2. Сделайте угол около 40 ° с большим пальцем левой рукой и левым указательным пальцем (с указательным пальцем на поверхности хирургии), чтобы помочь провести операцию поверхность STABILE.
3. Сскос иглы, обращенной вверх (как ложка), расположить иглу под прямым углом по отношению к глазу (фигура 2В). Используйте кончик иглы, чтобы мягко проникают в тонкий слой ткани, покрывающей зрительный чашку (белый, непигментированный область) глаза, черпая справа налево. Очень осторожно удалите пигментированные ткани , расположенные внутри глазного бокала, следя за тем, чтобы не проколоть дно или уничтожить границы глазного бокала.
   1. Если червь был на фильтровальную бумагу для> 1-2 мин в любой момент во время процедуры, добавьте одну каплю воды червя регидрировать червя.
      Примечание: Обезвоживание увеличит восприимчивость червя до риппинга травм.
4. Повторите шаг 3,3 до всех черных пигментированных тканей (пигментные клетки), а также всех белых тканей глазного бокала (дендриты фоторецепторных клеток), удаляются. Удалить вырезанные ткани застряли на конце иглы, осторожно обтирать с тканью салфеткой. Если двойной Abla глазции желательно, абляции второго глаза в этой точке.
   Примечание: Для того, чтобы избежать травм, иглы могут быть очищены путем захвата иглы с чистой тканью протирать провел с большим и указательным пальцами, затем другой рукой, чтобы вытащить иглу через салфетку от большого пальца и указательного пальца. В качестве альтернативы, игла может быть стерт на поверхность влажной ткани вытереть и исследуют на чистоту.
5. Когда закончите, используйте пипетки передачи для перемещения червяка с меченым блюдом с пресной водой червя. При анализе данных группы, разместить до 20 червей в одном 100 Мм Петри Петри. Если отслеживание регенерации в тех же самых индивидуумов с течением времени, 1 место червя в каждую лунку 12-луночного планшета. После того, как все черви передаются, полоскание червей, удаляя всю червячную воду из чашек / скважин и замены с большим количеством свежей водой червя.
   1. Чтобы удалить червь из фильтра, backload пипетки с небольшим количеством воды и червячной выпустить воду на червь. Это должно поднять тон червяк от фильтровальной бумаги, чтобы немедленно всасывается в пипетку для переноса.
6. Инкубируйте эксперименты при ~ 20 ° C (комнатная температура) в защищенном от света и следовать процесс регенерации.
   Примечание: черви могут быть сохранены в инкубаторе с контролируемой температурой для поддержания постоянной температуры, но это не является строго необходимым. Большинство комнатная температура изменяются только при + 5 ° С, что не влияет на способность червя к регенерации.
7. При желании, исправить червь для иммуногистохимии (см рисунков 3-4) и / или в гибридизация анализ экспрессии генов. Существуют различные способы фиксации для планарии иммуногистохимии ^{18, 19, 20} и на месте гибридизации ^{21, 22, 23} протоколов.
8. Когда эксперименты пришли к выводу, sacrifiсе червей живут путем удаления червя воду из чашки и замена 70% -ным этанолом. Выдержите червь в течение 3-5 мин, проверяя червь лизировать и превратить сероватый.
9. Поместите необработанные червь в потоке обычных отходов, как только жертвенном. Избегайте введения живых червей в окружающую среду, особенно неместных видов.

Результаты

Для первой 1-2 ч после операции, животные могут обладать уменьшились движение по сравнению с интактными червями (однако, они все равно будут двигаться). При желании, черви будут есть в течение 24 часов после операции (например, для кормления RNAi). Когда после регенерации гл?...

Обсуждение

Эта техника глаза абляции улучшает современные методы (например, перфорация) путем исключения тканей мозга и ограничения иссечения в основном для тканей глаза. С практикой, эта техника может быть выполнена большинством людей, от опытных техников в микрохирургических для неопытных, но ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional