Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

Resumo

Este protocolo mostra como para excisar consistentemente olhos planarian (copos óptica), sem perturbar os tecidos circundantes. Utilizando uma agulha de seringa de insulina e, de um ou ambos os olhos pode ser cauterizado para facilitar investigações sobre os mecanismos que regulam a regeneração do olho, a evolução de regeneração visual, e a base neural de comportamento induzida pela luz.

Resumo

No estudo de células estaminais adultas e os mecanismos regenerativos, vermes planarian são um grampo no sistema modelo in vivo. Isto é devido em grande parte à sua população de células-tronco pluripotentes abundante e capacidade de regenerar todos os tipos de células e tecidos após lesões que seria catastrófico para a maioria dos animais. Recentemente, planárias ganharam popularidade como um modelo para a regeneração olho. A sua capacidade de regenerar todo o olho (composto de dois tipos de tecidos: células pigmentares e fotorreceptores) permite a dissecção dos mecanismos que regulam a regeneração sistema visual. ablação do olho tem diversas vantagens sobre outras técnicas (tais como a decapitação ou furador) para examinar as vias e os mecanismos específicos do olho, o mais importante dos quais é que a regeneração é largamente restringida a tecidos oculares sozinho. A finalidade deste artigo vídeo é para demonstrar como para remover de forma fiável a taça óptica planarian sem perturbar o cérebro ou tecidos circundantes.O tratamento de vermes e manutenção de uma colónia criada também é descrito. Esta técnica utiliza uma 31 L, agulha de insulina 16/05 polegadas para colher cirurgicamente para fora a cúpula óptica de planarians imobilizados numa placa fria. Este método engloba tanto simples e dupla ablação olho, com olhos de regeneração no prazo de 1-2 semanas, para permitir que uma ampla gama de aplicações. Em particular, esta técnica de ablação pode ser facilmente combinado com (interferência de ARN) telas farmacológicas e genéticas para uma melhor compreensão dos mecanismos de regeneração e da sua evolução, células estaminais do olho e a sua manutenção, e respostas comportamentais phototaxic e sua base neurológica.

Introdução

Planárias são um poderoso organismo modelo para o estudo da regeneração mediada por células-tronco adultas. Estes vermes de água doce não-parasitárias possuem a capacidade de regenerar a quaisquer e todos os tecidos em falta, incluindo o sistema nervoso central e do cérebro ^1. Estudado, tanto para trás como os 1700s ^2, avanços tecnológicos no domínio planarian durante os últimos 10-15 anos (tais como um genoma sequenciado, hibridao in situ, imuno-histoquímica, de ARN de interferência (ARNi), e transcriptómica) ter actualizado este organismo modelo histórico . Especificamente, planárias recentemente ganhou popularidade como um modelo emergente de pesquisa olho ^3.

Planárias têm olhos prototípicas com apenas dois tipos de tecido, os neurónios fotorreceptores e células de pigmento; esta permitiu a caracterização da sua população de células-tronco olho e demonstrado que muitos dos mesmos genes regulando vertebrado de olhosenvolvimento são conservados em planarians ^{4, 5.} Os copos óptica estão localizados dorsalmente e composta dos dendritos branco, não pigmentadas dos neurónios fotorreceptores e as células de pigmento preto semi-lunar, e os olhos inervam o cérebro através de um quiasma. Além de ser um modelo para elucidar os processos regenerativos ^6, o olho planarian é bem adequado para o estudo da evolução de mecanismos visuais ^7, as respostas comportamentais a luz (planarians exibir fototaxia negativo) ^8, e a base neurológica de comportamento ^9.

Regeneração olho em planarians tem sido largamente estudada em dois contextos principais: como parte de regeneração da cabeça seguinte decapitação ^{4, 10,} e após a excisão de apenas os tecidos do olho ^{11, 12} . A maioria dos estudos sobre a regeneração planarian olho têm usado o método de decapitação, como é simples e direta. O método de excisão olho planarian mais comum até à data tem sido através de perfuração com um tubo capilar de vidro fino ^{13, 14,} embora alguns estudos também realizada amputações apenas por trás dos olhos (decapitação parcial) ^15. No entanto, todos estes métodos envolvem a perda de muitas outras do que apenas o olho tecidos (tais como tumores do cérebro, intestinos, e nefrídios), potencialmente complicar a interpretação dos resultados. O protocolo de ablação olho aqui apresentada restringe a excisão para os tecidos do olho (excluindo especificamente cerebral), resultando em dados que são mais específicos para o olho. Além disso, ao contrário de vermes decapitados que levam 7-14 dias para iniciar a alimentação, olho ablated vermes irá alimentar dentro de 24 h de ablação ^12, permitindo que as experiências de ARNi (onde ARNi é entregue através dos alimentos) para ser performed concorrentemente.

Embora a ablação do olho é tecnicamente mais difícil de executar com êxito do que a decapitação, estudos atuais que envolvem a excisão olho não incluíram instruções detalhadas sobre os seus procedimentos. O objetivo deste artigo vídeo é para permitir aos investigadores para remover consistentemente o copo óptica planarian sem perturbar os tecidos cerebrais subjacentes e removendo como alguns outros tecidos quanto possível. Este método pode ser utilizado para ambos simples e dupla ablação olho e é aplicável a uma vasta gama de investigações. Como a maioria dos ensaios de regeneração, ablação olho é bem adequado para combinação com ambas as telas farmacológicas e genéticas (ARNi), bem como estudos comportamentais. Aqui nós descrevemos métodos para o tratamento de vermes, mantendo uma colônia planarian, ea técnica de ablação de olho em si.

Protocolo

1. Cultura Animal e Manuseamento

NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, uma espécie planarian diplóides com um genoma seqüenciado ^{16, 17} que é comumente usado para a pesquisa de regeneração. No entanto, o ensaio é igualmente bem sucedido com outras espécies, tais como Girardia Tigrina e Girardia dorotocephala (que se encontram comercialmente disponível).

1. Manter vermes em "água verme" feitos a partir de sais / L 0,5 g do mar em ultrapura (ou desionizada filtrada) água. Use de polipropileno ou de vidro recipientes estéreis para segurar a água sem-fim. Ver Documento Suplementar 1 para obter detalhes sobre a preparação de água worm.
   NOTA: Não utilizar sabão para limpar recipientes (ou de outras fontes) como o sabão é tóxica para vermes; em vez limpar com etanol a 70% e deixar secar ao ar.
   1. Usar luvas ao trabalhar com planaria para protegê-los de qualquer contaminação.
      NOTA: Worms são muito sensíveis às toxinas e substâncias químicas ambientais, incluindo sabão, água sanitária, xampu, condicionador e loção de mão.
2. colónias de casas em recipientes de alimentos de polipropileno, com a tampa parcialmente aberta esquerda para a troca de ar a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Loja sem-fins experimentais, nem em placas de petri (20 vermes por placa de 100 mm) ou placas não-tratados de cultura de tecidos (um sem-fim por po, para placas de 12 poços). Para reduzir o estresse, manter ambas as colônias e experiências no escuro.
   NOTA: Colonies não deve ter mais do que 500-1.000 vermes por litro de água worm. Para experiências, deixe tampas plenamente em vigor, uma vez que o fluxo de ar é projetado para esses pratos.
3. Alimentar vermes não experimentais, uma vez por semana com puré carne orgânica ou fígado de galinha, largando puré de uma pipeta de transferência, colocando gotas de alimentos ao longo do recipiente. Permitir vermes 2 h para consumir alimentos naescuro antes de limpar o recipiente (ver passo 1.4). Antes de usar, puré de armazenar a -20 ° C durante curto prazo (semanas) ou -80 ° C durante a longo termo (em meses); não recongelar puré para re-utilização (como bactérias podem florescer e prejudicar os vermes).
   NOTA: Fígado não deve conter hormonas ou antibióticos e de preferência não ser previamente congelados. Centrífuga puré antes da congelação (ou antes da alimentação) para remover o ar e impedir que o alimento flutuante. Os alimentos devem desviar para o fundo do recipiente. 1 mL de puré é suficiente para 500-1.000 vermes.
4. água troca uma vez por semana com água verme fresco para ambas as colônias e experimentos. recipientes de colónias também deve ser limpo com uma toalha de papel não branqueada (para remover os resíduos de muco que os resíduos trap) uma vez por semana para fome vermes, ou duas vezes por semana para os vermes alimentam (2 h após a alimentação e outra vez de 2 dias mais tarde). A fim de reter o biofilme, não limpe mais do que 80% do recipiente.
5. Mover vermes entre os recipientes (ou setu cirurgiap) usando uma pipeta de transferência. Para vermes livres aderidas às superfícies do recipiente, esguichar água sobre / por trás do sem-fim de libertá-lo da superfície. Em seguida, aspirar o sem-fim para a pipeta, ao tentar manter o sem-fim no interior da parte inferior polegada (mais fina) da pipeta.
   1. pipetas protelar com uma pequena quantidade de água verme antes de sugar-los.
   2. Tente mover a água ao redor do worm, ao invés do próprio verme, para ajudar a prevenir rasgando vermes de corpo mole por tocá-los com a pipeta.
   3. Manter pratos cobertos experimentais, a menos que a transferência de vermes ou substituir a água.

2. Preparação

1. Suspender a administração vermes pelo menos uma semana antes das experiências.
   1. Selecione vermes que não foram alimentados durante pelo ≥1 semana e são pelo menos 5-7 mm de comprimento. Transferir os vermes para uma placa de Petri de 2/3 cheio de água sem-fim, e confirmar comprimento sem fim por uma régua de deslizamento debaixo do prato. Meça wORMs enquanto totalmente estendida e em movimento.
      NOTA: Embora menor (5-7 mm) vermes funcionam melhor quando se realiza imunofluorescência posterior e em análises de hibridização in situ, vermes maiores (8-10 mm) são mais fáceis de trabalhar com - especialmente quando aprender a ablação.
   2. Certifique-se de que os vermes são inteiro, intacto, e não recentemente regenerar.
      NOTA: Regeneração vermes terá muito mais leve (ou não) do pigmento na cabeça e / ou a região da cauda, ​​em comparação com vermes normais.
   3. Se realizar ARNi ou tratamentos farmacológicos em vermes, fazê-lo neste momento. Se vermes foram alimentados como parte do tratamento (como por RNAi), esperar, pelo menos, 7 dias após a última alimentação, antes de continuar para o passo 2.2.
2. Limpar a base do microscópio de dissecção e o espaço de trabalho com 70% de etanol e deixar secar completamente. Coloque o prato de vermes selecionados para a esquerda do escopo. Para a direita do âmbito, colocar um par de fórceps # 5, uma agulha 31 G 5 de insulina / 16 polegadas com um 1ml de uma seringa, e uma pipeta de transferência limpa.
   1. Certifique-se de que os instrumentos são mantidos de tocar o banco (o que poderia introduzir contaminantes). Utilizar um produto rígido (tal como um resto pauzinho) para manter a pinça, agulha, pipeta e limpo. Alternativamente, instrumentos lugar na parte superior de um castanho (não branqueada) toalha de papel fresca.
      NOTA: Estas e subsequentes instruções são escritas em que dizem respeito a indivíduos destros. indivíduos canhotos devem reverter as direções Direita / Esquerda.
3. Ao lado do espaço de trabalho, colocar uma caixa de lenços de tecido sem fiapos, uma fonte de água fresca verme, e algumas pipetas de transferência extra (protegidas da bancada). água verme lugar em um frasco de lavagem de plástico para facilitar a distribuição. Também colocar uma placa marcada de 12 poços (ou 100 milímetros placa de Petri) para a direita da margem para recolher animais ablação.
4. Se estiver usando uma placa Peltier feitos sob medida para imobilizar vermes, posicione a placa de Peltier na depressão em tele base do microscópio de dissecação e ajustar a saída da fonte de energia DC até que a superfície de trabalho da placa de Peltier é suficientemente frio (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fazer uma placa fria por enchimento de uma placa de Petri de 100 mm cheia com água ½ e congelar durante pelo menos 24 h. Descartar a tampa e colocar a parte inferior da placa de 100 mm na base do escopo de dissecação, em seguida, colocar a tampa de um prato de 60 mm Petri de cabeça para baixo directamente sobre a superfície do gelo (Figura 1A).
   1. Depois de congelada a água na placa de 100 mm, de um "vulcão" de gelo pode aparecer no centro da placa. Se isto acontece, utilizar uma lâmina de barbear para raspar o plano de gelo, para remover quaisquer irregularidades da superfície.
      NOTA: Durante cirurgias o gelo vai derreter, fazendo ablações muito mais difícil. Prepare vários pratos de gelo com antecedência, e substituir os congelados para derreter queridos durante o ensaio, logo que a tampa do prato 60 milímetros começa flutuante.
5. Prepare osuperfície cirurgia. Cortar um pedaço de 5 cm x 10 cm de película de plástico de parafina (4 cm ^2, se utilizar a placa de petri placa fria) e colocá-lo sobre o centro do dispositivo de imobilização. Dobre um tecido que não solte fiapos limpar em uma praça a cerca de 2 ^cm2 e colocá-lo no topo do filme. Cortar um pedaço de papel de filtro branco 1,5-2 ^cm2 e colocá-lo em cima da toalhita. Ver Figura 1B-1E.
   1. Segure o dobrado acabar no lugar com um dedo de luva, e usar água worm para umedecer levemente o pano para garantir que ele permaneça dobrado. Utilizar o lado de uma pipeta de transferência para rolar a limpar plana.
      NOTA: temperatura fria ajuda a manter os vermes de se mover. Trabalhando "seco" também ajuda a imobilização. O lenço de papel age de pavio de água através do papel de filtro, mantendo o verme húmido durante a cirurgia sem permitir vermes a secar completamente (que é letal).

3. ablação cirúrgica

1. Use uma pipeta de transferência para colocar emlado e verme dorsal para cima sobre o papel de filtro. Ligue a fonte de luz e dirigir as goosenecks para que a luz é focada no worm. Ajuste o foco escopo dissecar e ampliação para que os olhos são claramente visíveis (todo o worm não precisa ser à vista); 5X é um bom ponto de partida. Orientar o verme ao rodar o filme de parafina de forma que a cabeça é apontada em direcção ao investigador (na direcção da frente do microscópio), em ângulo de 30-40 graus para a direita.
   1. Evitar o uso de luz brilhante para prevenir o excesso de movimento sem-fim. Planárias exibir fototaxia negativos e tentará fugir luz brilhante.
   2. Se o sem-fim está posicionada lado ventral para cima (com faríngea abertura visível), utilizar o lado opaco do fórceps para reposicionar suavemente lado do sem-fim dorsal para cima (com olhos visíveis). Evitar a aproximar-se do animal com a ponta afiada da pinça para minimizar a possibilidade de rasgar através dos tecidos moles, quando o reposicionamento do animal.
   3. Ajuste o foco do microscópio para que os olhos são claramente em foco. Também garantir que ambos os olhos e tecidos circundantes cabeça estão à vista.
2. Realizar uma nova agulha / seringa na mão direita, como se fosse uma caneta (entre o polegar e o dedo indicador). Prepare o polegar esquerda contra a placa de Peltier (ou placa de Petri placa fria), e utilizar o polegar esquerdo como um ponto de apoio sobre a qual a parte inferior da seringa vai descansar (Figura 2A). Olhe através do microscópio, e certifique-se o bisel da agulha é visível.
   NOTA: As agulhas são muito afiadas. Seja cauteloso ao lidar com eles. Vestindo látex ou nitrilo podem oferecer alguma proteção.
   1. Use o polegar esquerdo para ajudar a segurar a agulha / seringa constante durante todo o procedimento e evitar apertando as mãos.
   2. Faça um ângulo de aproximadamente 40 ° com o polegar esquerdo e dedo indicador esquerdo (com o dedo indicador sobre a superfície da cirurgia) para ajudar a segurar o estável superfície cirurgia.
3. Como bisel da agulha voltada para cima (como uma colher), a posição da agulha em ângulos rectos para o olho (Figura 2B). Utilizar a ponta da agulha para penetrar suavemente a fina camada de tecido que cobre o copo óptica (branco, região não pigmentado) do olho, escavando a partir da direita para a esquerda. Muito gentilmente remover qualquer tecido pigmentado localizado dentro do cálice óptico, tomando cuidado para não perfurar a parte inferior ou destruir as fronteiras do cálice óptico.
   1. Se o sem-fim tem sido no papel de filtro durante> 1-2 min a qualquer momento durante o procedimento, adicionar uma gota de água sem-fim de re-hidratar o sem-fim.
      NOTA: A desidratação irá aumentar a susceptibilidade do worm a lesões rasgando.
4. Repetir o passo 3.3 até que todos os tecidos pigmentados de preto (células de pigmento), bem como todos os tecidos brancos do copo óptica (dendritos das células fotorreceptoras), são removidos. Remover tecidos excisados ​​preso à extremidade da agulha, limpando cuidadosamente com um lenço de papel. Se abla dupla olhoção é pretendida, ablação do segundo olho neste ponto.
   NOTA: Para evitar ferimentos, as agulhas podem ser limpos por agarrar a agulha com um tecido limpo toalhete realizada com o polegar e o indicador, em seguida, usando a outra mão para puxar a agulha através da enxugar do polegar e o indicador. Alternativamente, a agulha pode ser varrida sobre a superfície de um tecido de esfregão húmido e examinados para limpeza.
5. Quando terminou, utilizar uma pipeta de transferência para mover o sem-fim a um prato marcado contendo água fresca sem-fim. Se a análise de dados de grupo, coloque até 20 vermes em um único 100 milímetros placa de Petri. Se rastreamento de regeneração nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, coloque 1 verme em cada poço de uma placa de 12 poços. Uma vez que todos os vermes são transferidos, enxaguar vermes, removendo toda a água sem-fim dos pratos / poços e substituindo com mais água fresca sem-fim.
   1. Para remover vermes do filtro, protelar a pipeta com uma pequena quantidade de água sem-fim e libertar a água para o sem-fim. Isso deve levantar tele verme fora do papel de filtro, para ser imediatamente sugado para dentro da pipeta para transferência.
6. Incubar experiências a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidas da luz e acompanhar o processo regenerativo.
   NOTA: Worms pode ser armazenado em uma incubadora com temperatura controlada para manter uma temperatura constante, mas isso não é estritamente necessário. A maioria das temperaturas ambientes variam apenas por 5 ° C, o que não irá afectar a capacidade do sem-fim de regenerar.
7. Se desejado, corrigir vermes para imuno-histoquica (ver Figuras 3-4) e / ou em análises de hibridação in situ da expressão do gene. Existem diferentes métodos de fixação para imuno-histoquímica planarian ^{18, 19, 20} e a hibridização in situ ^{21, 22, 23} protocolos.
8. Na celebração dos experimentos, sacrifice viver vermes através da remoção de água sem-fim do prato e substituindo com etanol a 70%. Incubar vermes para 3-5 min, a verificação de vermes para lisar e transformar acinzentada.
9. Coloque vermes não tratados no fluxo de resíduos normal uma vez que sacrificado. Evitar a introdução de vermes vivos no ambiente, particularmente espécies não-nativas.

Resultados

Para o primeiro 1-2 h após a cirurgia, os animais podem apresentar movimento diminuiu em comparação com vermes intactos (no entanto, eles ainda se move). Se desejado, vermes vai comer dentro de 24 horas após a cirurgia (por exemplo, para a alimentação de RNAi). Ao seguir a regeneração olho nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, certifique-se para tirar uma fotografia de cada verme tanto antes da cirurgia (intacto) e em 1 h após ablação (HPA). Ao fim de 4 dias após a ablaç...

Discussão

Esta técnica de ablação olho melhora sobre os métodos correntes (tais como furador) por excluindo os tecidos cerebrais e restringindo excisão principalmente para os tecidos do olho. Com a prática, esta técnica pode ser realizada pela maioria dos indivíduos, de técnicos experientes em microcirurgias para estudantes de graduação inexperientes, mas de consciência. Recomenda-se que esta técnica ser praticadas muitas vezes antes de usar ablações em experimentos, incluindo (quando possível) confirmação de re...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional