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要約

自動免疫 MALDI (iMALDI) 技術を使用して複雑な体液でプロテインの定量のためのプロトコルが表示されます。

要約

質量分析 (MS) は、各ターゲット分子の質量電荷比の直接検出の結果として優秀なアッセイの特異性と複雑な試料中のタンパク質を定量化するための最も一般的に使用される技術の一つです。しかし、他のほとんどの分析技術のような MS ベースのプロテオミクスは高豊富な検体を測定への偏り、検出限界は低い ng/mL のまたは pg/mL で複雑なサンプル、およびこれは多くの濃度範囲を達成するために困難ですのでひと血漿など生体の疾患関連蛋白質。低豊富な検体の検出を支援するには、免疫強化を集中し、MS の測定、アッセイの感度が大幅に向上する前に検体を浄化するアッセイに統合されています。この作品で、免疫-マトリックス レーザー脱離イオン化 (iMALDI) 技術がタンパク質及びペプチドの生体の定量化のために提示はビーズに免疫強化に基づく、事前の溶出なし MALDI MS 測定が続きます。抗ペプチド抗体は磁気ビーズの官能基化、サンプルと孵化させます。洗浄後、ビーズは MALDI ターゲット プレート上に直接転送し、マトリックス ソリューションがビーズに適用された後、飛行 (MALDI-TOF) 計器の MALDI 時間は信号を測定します。その他免疫 MS の試金に比較サンプルの準備の手順を簡略化し、MALDI の測定は高速。改善された分析の再現性と高スループット処理システム、液体全体サンプル準備が自動化されます。この記事で iMALDI 試金はペプチド アンジオテンシンを決定するため使用される私 (Ang 私) 原発性アルドステロン症 (PA) のスクリーニングのため血漿レニン活性の読み出しとして臨床的に使用されている血漿中濃度。

概要

質量分析法による定量的プロテオミクスにおける必要不可欠なツールとなっています。質量分析法は、ターゲット蛋白質またはペプチッドの固まりを判断できます、したがって得られた試料信号することができます非常に具体的イムノアッセイと比較しています。エレクトロ スプレーと MALDI は、2 つのイオン化方法は、タンパク質・ ペプチド1,2,3、4を検出するためによく使用されます。MS を用いたタンパク質定量における大きな課題は、高豊富な蛋白質の存在下で ng/mL または pg/mL の濃度で複雑な試料中の低豊富なタンパク質の検出、ひと血漿中発見多く候補蛋白質バイオ マーカーこれの範囲の5を実行します。この問題は、本質的に広いダイナミック レンジおよび人間の proteome6の複雑さが主原因です。

ターゲット蛋白質または固体表面上にサンプル ソリューションからペプチドを豊かにする方法が免疫 MS 検出課題を克服するために開発されて、検体と MS 測定7,8の溶出順,9,10します。 複雑なサンプルから濃縮、免疫を介して、検体を精製し、他の分子からイオン抑制効果を最小化するため。固体の様々 なサポートの中では、扱いやすさと高い抗体結合能力の利点を有するので磁気ビーズは最も広く使用現在。別の functionalizations とサイズの磁気ビーズを開発し、免疫沈降実験のため商品化します。日には、ビーズに免疫強化をエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) と MALDI MS タンパク質およびペプチドの測定のためインターフェースされてが。安定同位体標準および抗ペプチド抗体 (SISCAPA) 技術による捕獲は、免疫強化のための抗体をコートしたビーズと孵化によって続いて、試料中のタンパク質は消化されます。「古典的な」SISCAPA でキャプチャ proteotypic ペプチドが、ビーズから溶出し、測定による液体クロマトグラフィー-MS (LC-MS)、または直接注入 ESI 複数反応モニタリング MS (ESI MRM MS)11,12。免疫強化は、ng/mL の低範囲13に達する 3-4 桁 MRM アッセイ感度を向上します。

エレクトロ スプレー MS と比較して、MALDI MS の高速、かつを含まない洗浄と LC カラムの再平衡持ち越しと汚染の問題がないのでより高スループット研究14に適しています。ペプチッドおよび蛋白質 (proteotypic ペプチドの定量に基づく) の特異的かつ高感度定量 MALDI MS と免疫強化を結合する当研究室で開発した免疫 MALDI 技術15,16 ,17。免疫濃縮後 MALDI ターゲット プレートにビーズを堆積、マトリックス ソリューション ビーズに追加されます、乾燥後プレートは MALDI TOF MS による分析の準備ができて。ビーズからペプチドの溶出は別のステップとして実行されませんが、アフィニティ バインド analytes は MALDI のマトリックス ソリューションによって溶離されるビード スポット、サンプル準備を簡素化し、サンプルの損失を最小限に抑えることに追加するとき。IMALDI 技術適用されているさまざまなアプリケーション18,19で、最近自動化されアンジオテンシンを測定するために使用私 (Ang 私) 血漿レニン活性 (PRA)20を決定します。このプロトコルは、自動 iMALDI 分析を実行するための手順を説明します。例については、10% 未満の間日 CVs としてプラ アッセイを取って日20あたり 744 のサンプルを測定する機能を備えた、自動化によって達成されています。

本稿で示した iMALDI プラ アッセイはターゲット分子としてのタンパク質消化を必要としない (アン私) 1295.7 Da の分子量のペプチドです。C とそれを簡単に区別できるように 800 Da 以上の質量を持つ、ターゲット蛋白質に固有にする必要があります iMALDI の選択したペプチドその他試金蛋白質消化が必要あり、ペプチドはそのまま蛋白質の代理として使用される、MALDI のマトリックス ソリューションから 2・3 のノイズ。抗ペプチド抗体、ペプチドの免疫強化に必要です。PRA を測定 iMALDI 試金のためのプロトコルは 4 つのステップで構成されています: 1) アンの世代人間プラズマで2) 免疫-豊かなアンの私は抗体をコートしたビーズ; を使用して3) ビーズの MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションへの転送・ 4) 信号集録 MALDI TOF MS とデータ解析20。

プロトコル

下記試薬の量は 20 の患者血漿検体の測定に基づいています。プロトコルはビクトリア大学のガイドライン以下提示 ' s 人間研究倫理委員会.

1 アン世代ひと血漿中私

  1. 血漿検体を解凍 (≥ 200 μ l) の部屋で温度水は 5 分のお風呂と、完全に解凍するまで氷の上にサンプルを置く。
    2. 。
  2. 1.1 mL ディープウェル プレート (サンプル プレート) の井戸を分離し、遠心分離機の 2 ° C および 1278 x g で 10 分間遠心でプレートに手動で各血漿サンプルの転送 200 μ l
  3. リキッドハンド リング システムを使用して、連続希薄と鶏卵白アルブミン 6 校正ソリューションを準備する 500 fmol/μ L Ang I NAT の標準溶液 (0.1、0.2、0.6、1.9 5.7, 17.2 fmol/μ L).
    4. サンプル プレートに
  4. 世代のも、125 μ L を各キャリブレータのピペット 200 μ L バッファーします
    。 注: CEWA のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファーは実験の日に新たに作成される必要があります
    5. 。
  5. リキッドハンド リング システムを使用して、新しいプレートのミックス プラズマの培養上清中の 125 μ L または 125 μ L の PBS の CEWA のアンの 25 μ L で私世代バッファー 1 M トリス、0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 mM を含む特異フッ化物 (PMSF).
    注: 準備、Ang 私 1 M トリス/0.2 mM EDTA 水系バッファーをミキシングによって生成バッファー (pH 5.5 に調整酢酸を使用して) そして PMSF ソリューション (メタノール 100 mM)。両方のソリューションで、実験の日に 4 ° c. のミックス 2 つのソリューションで 1 ヶ月格納できます
    6. 。
  6. は、96 ウェル プレート、1 ソリューションにつき 3 複製、34 μ L/ウェルにソリューションを自動的に転送します。3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい

2。アンの免疫強化私を使用して抗体をコートしたビーズ

  1. 蛋白質 G 磁気ビーズに抗体の共役
    注: ビーズを抗体の共役が 3 h アンの中に手動で実行される私の発生期、実験の日。その他の検体の共役ビーズ プロパティおよび抗体の安定性に応じて 3 ヵ月以上、4 ° C で 0.015% チャップス (きて) を含む PBS バッファーに格納することができるかもしれない。
    1. (20 のサンプルを測定し、6 点の標準曲線を作る十分な) ビーズ スラリーの転送 110 μ L 1.5 mL チューブに。ビーズ 7 回 1 mL 25% アセトニ トリル/きてときて 1 mL で 3 回洗います。各洗浄工程間ビーズをペレットにマグネット スタンドを使用します。最後のワシントン州後に洗浄バッファーを削除
      注意: 洗浄 7 回 25% アセトニ トリル/きてはビーズ スラリー、Tween 20 MS 互換性のない添加物を除去するため重要です。選択したビーズではこのような添加剤は、この広範な洗浄工程必要がありますできません
      2. 。
    2. きて、110 μ のビードを再停止しなさい、反中央の 110 μ L を追加私抗体 (最終的な抗体濃度: 100 μ g/mL)。ミックス ビーズとソリューションをピペッティングと、それらを 8 rpm で回転、1 時間室温でインキュベートします
      3. 。
    3. 3 回きて、1 mL でビーズを洗ってきて 1100 μ で再懸濁します
      。 注: 場合はビード ソリューションは、インキュベーション中にチューブのキャップに流れ込んできた、スピンダウン 2680 x g にベンチトップ遠心分離機を使用して、ソリューション
    4. は、96 ウェル プレート (ビーズ標準プレート) にビーズ ソリューションを手動で転送します。リキッドハンド リングの因数にシステム 120 μ L/ウェル同じ 96 ウェル プレートにビーズを使用して、
  2. ビーズの免疫強化
    1. 後 3 h アン発生期培養プレートに。アン I. の生成を終了する 10 分の氷
    2. は自動的に SIS ペプチド原液 (10 pmol/μ L) を 100 倍希釈 PBS で、バッファーに格納し、自動的に更に因数 96 ウェル PCR プレートに安定した isoptope 標準的なペプチド希釈。培養プレートの各ウェルに 1.5 μ L (100 fmol 含む) 安定同位体標準 (SIS) ペプチド溶液を転送し、血漿検体または PBS バッファーで CEWA ミックスします
      3. 。
    3. ビーズのソリューションは、ウェルあたり 10 mL に培養プレートの内容を転送、ミックスを自動的にします
      4. 。
    4. 1 h 4 ° C でプレートを 8 回転で回転させながらインキュベートします
      5. 。
    5. ビーズにて 3 回洗浄自動的に 5 mM 重炭酸アンモニウム (アンビック) ソリューションでは、100 μ L/ウェル洗浄あたり。最後の洗浄後 5 mM 各ウェルに碧のソリューションの 7 μ L でビーズを再懸濁します。最後のワシントン州の後下部にビーズをプルする磁石を使用

3。MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションにビーズの転送

  • 2,600 のスポット サイズと MALDI ターゲット プレートの上に自動的にビーズ スラリーの転送 7 μ
      μ m。ビーズが乾くみましょう
      。 注: 小型 USB 電源ファンはビーズ乾燥過程を加速するため使用できます。
    1. は自動的に α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (HCCA) の 2 μ L を追加-各サンプル ターゲット プレート上のスポットにはうまく行列から行列ソリューション (3 mg/mL HCCA、クエン酸アンモニウム 1.8 mg/mL、70% アセトニ トリル、0.1% トリフルオロ酢酸を含む).

    4。MALDI TOF MS とデータ解析による買収を信号

    正反射モードを使用して MALDI-TOF 楽器
    1. 分析サンプル スポット。内部校正、データの平滑化、およびベンダー固有のソフトウェアで自動的に基線の減算を実行します
      。 注: (正/負、線形/リフレクター) 選択したモード MALDI-TOF 測定対象のペプチッドまたは蛋白質によって異なります
      2. 。
    2. 相対応答比 (Nat/SIS 強度比) を計算して、アンの私を決定する標準的なカーブに各サンプルの濃度を比較すること。計算式 (1) を使用して、プラ Δt アン私世代 Ang i. の生成に使用される時刻を表す
      プラ = [アン私]/Δt アン私世代 (1)

    • 結果

    アンを測定するための自動 iMALDI 手順は図 1にされます。ターゲット ペプチド (内因性ペプチドまたは消化タンパク質由来のペプチド)、抗ペプチド磁気ビーズの濃縮し、MALDI 測定用ターゲット プレートにビーズを転送するし。追加ペプチド溶出のステップを必要とする他の免疫 MS 技術と比較して、全体の手順を簡略化します。IMALDI アッセイの?...

    ディスカッション

    従来の MS を用いたタンパク質定量と比較して、iMALDI は、分析検体を豊かにし、したがって、それはタンパク質またはペプチド低濃度を定量化することが可能、複雑なサンプルからそれらを浄化する抗体を使用します。IMALDI プロトコルの重要なステップは、ターゲット ペプチドの免疫強化です。このため、高い特異性と親和性の抗体を選択してください。SISCAPA、内 10-9 M 以上で抗体?...

    開示事項

    C.H.B は、iMALDI 技術の特許を保持しています。

    謝辞

    ゲノム技術革新ネットワーク (ジン) をゲノム カナダ、操作 (204PRO) および技術開発 (214PRO) のゲノム ブリティッシュ コロンビア州からの資金援助に感謝いたします。撮影用飛行時間測定器の使用のマギル大学健康センター研究所薬剤発見プラットフォームをありがちましょう。H.L. 国立科学工学研究協議会のカナダ (レベル) からポスドク研究員プログラムからサポートに感謝です。C.H.B は最先端基金基金 (葉っぱ) からのサポートに感謝しています。えざるはマギル大学 (モントリオール, ケベック州, カナダ) 分子腫瘍学のシーガル マギル椅子からのサポートに感謝します。M.X.C. とえざるがユダヤ人の総合病院 (モントリオール, ケベック州, カナダ) にウォーレン Y. ソーパー慈善信託とアルヴィン シーガル家族財団から支援に感謝。

    資料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Healthy control human plasmaBioreclamationHMPLEDTA2
    Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
    Ammonium citrate dibasicSigma Aldrich09833
    CHAPS (>=98%)Sigma AldrichC9426
    Albumin from chicken egg white (>98%)Sigma AldrichA5503
    Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichEDS
    Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma Aldrich70990
    Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417
    Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma Aldrich78830
    Trifluoroacetic acidThermo Fisher Scientific85172LC-MS grade
    acetonitrileFluka34967LC-MS grade
    waterFluka39253LC-MS grade
    acetic acidFluka320099LC-MS grade
    Tris(hydroxymethyl)aminomethaneRoche Diagnostics3118169001
    Dynabeads Protein G magnetic beadsThermo Fisher Scientific10003D2.8 μm, 30 mg/mL
    anti-Ang I goat polyclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7419
    Nat and SIS Ang Isynthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
    Automated liquid handling systemAgilent16050-102Agilent Bravo robotic workstation
    MagnetThermo Fisher Scientific12321DInvitrogen DynaMag-2 magnet
    Tube rotatorTheromo Scientific400110QLabquake Tube Rotator
    MagnetThermo Fisher Scientific12027DynaMag-96 side skirted magnet
    MagnetVP Scientific771RM-1used to pull the beads to the bottom of the well
    MALDI-TOFBrukerBruker Microflex LRF instrument

    参考文献

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    2. Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
    3. Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
    4. Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
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