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Resumo

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Resumo

Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno - Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).

Introdução

Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos1,2,3,4. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em concentrações ng/mL ou pg/mL, na presença de proteínas de alta-abundância, e muitos biomarcadores de candidato proteína encontradas no plasma humano são dentro desta escala5. Esse problema é causado pela maior parte pelo inerentemente ampla faixa dinâmica e complexidade do proteoma humano6.

Para superar esses desafios de deteção, foram desenvolvidos métodos imuno-MS para enriquecer o alvo proteínas ou peptídeos partir das soluções de amostra em uma superfície sólida, seguido por eluição dos analitos e MS medição7,8 , 9 , 10. através de imuno-enriquecimento, os analitos são purificados de amostras complexas e, por conseguinte, os efeitos do íon-supressão de outras moléculas são minimizados. Entre vários suportes sólidos, grânulos magnéticos são atualmente mais amplamente utilizados como eles têm as vantagens da capacidade de ligação do anticorpo alta e facilidade de manuseio. Esferas magnéticas com functionalizations diferentes e tamanhos foram desenvolvidas e comercializadas para experimentos de imunoprecipitação. Até à data, imuno-enriquecimento em grânulos tem sido interfaceado com ionização electrospray (ESI) e MALDI-MS para medição de proteínas e peptídeos. Em padrões de isótopo estável e captura pela tecnologia de anticorpos antipeptídeo (SISCAPA), proteínas nas amostras são digeridas, seguido de incubação com grânulos de anticorpo-revestido para imuno-enriquecimento. No SISCAPA "clássica", os peptídeos proteotypic capturados são eluídos dos grânulos e medidos pelo líquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), ou por infusão direta ESI-múltiplas reação monitoramento-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Imuno-enriquecimento melhorou a sensibilidade do ensaio MRM, por 3-4 ordens de magnitude, atingindo os de gama baixa ng/mL13.

Em comparação com electrospray-MS, MALDI-MS é mais rápido e não envolve a limpeza e a re-equilibração de colunas LC então não há problemas reportes e contaminação, tornando-o mais adequado para estudos de alta produtividade14. Imuno-MALDI tecnologia foi desenvolvida em nosso laboratório para combinar imuno-enriquecimento com MALDI-MS para quantificação de sensível e específica de peptídeos e proteínas (com base na quantificação de peptídeos proteotypic)15,16 ,17. Depois imuno-enriquecimento, os grânulos são depositados sobre uma placa MALDI-alvo, a solução de matriz é adicionado à grânulos e o prato está pronto para análise por um MALDI-TOF-MS após a secagem. Eluição dos peptides da missanga não é executada como uma etapa separada, mas ligados a afinidade analitos são eluídos por solução de matriz a MALDI quando ele é adicionado aos pontos do grânulo, desse modo simplificando a preparação da amostra e minimizando a perda de amostra. A tecnologia de iMALDI tem sido aplicada em uma variedade de aplicações de18,19e recentemente foi automatizada e utilizada para a medição da angiotensina eu (Ang eu) para a determinação de plasma renina atividade (PRA)20. Este protocolo irá demonstrar o procedimento utilizado para realizar um ensaio iMALDI automatizado. O ensaio PRA a tomar como exemplo, inter dias CVs de menos de 10% foram obtidos por meio da automação, com a capacidade de medir 744 amostras por dia20.

O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste manuscrito não requer digestão de proteínas, como a molécula alvo (Ang eu) é um peptídeo com um peso molecular de 1295.7 Da. Em outros ensaios, onde a digestão de proteínas é necessário e um peptídeo é usado como o substituto para a proteína intacta, o peptídeo selecionado para iMALDI deve ser exclusivo e específico para a proteína do alvo, com uma massa mais de 800 Da então que ele pode ser distinguido facilmente o c hemical ruído a partir da solução de matriz MALDI. Anticorpos antipeptídeos são necessários para o imuno-enriquecimento dos peptides. O protocolo para um ensaio de iMALDI medição PRA consiste em quatro etapas: 1) geração de Ang I em plasma humano; 2) imuno-enriquecimento de Ang I usando grânulos anticorpo-revestido; 3) transferência de contas para uma placa-alvo MALDI e adicionando solução de matriz; e 4) aquisição de sinal por uma análise de dados e MALDI-TOF-MS20.

Protocolo

as quantidades dos reagentes descritos abaixo são baseadas na medição de 20 amostras de plasma do paciente. O protocolo apresentado abaixo segue as orientações do Universidade de Victoria ' Comissão de ética de pesquisa humana s.

1. geração de Ang I em Plasma humano

  1. descongelar amostras de plasma (≥ 200 µ l) em uma sala de temperatura água banho por 5 min e em seguida, colocar as amostras no gelo até completamente derretido.
  2. Transferência de 200 µ l de cada amostra de plasma manualmente para separar poços de uma placa de poço profundo 1,1 mL (placa da amostra) e centrifugar a placa em uma centrífuga para 10 min a 2 ° C e g. de x 1278
  3. Usar um líquido automatizado sistema de manipulação para diluir em série 500 fmol / µ l Ang I NAT solução padrão para preparar seis soluções de Calibrador com albumina de ovo de galinha (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).
  4. Pipetar 200 µ l de cada Calibrador para um bem e 125 µ l da geração buffer para a placa da amostra.
    Nota: O CEWA no buffer de solução salina tamponada (PBS) precisa ser preparado no dia do experimento de fosfato.
  5. Usando um líquido automatizado sistema de manipulação, em um novo prato misture 125 µ l de plasma sobrenadante ou 125 µ l de CEWA em PBS com 25 µ l de Ang eu buffer de geração, que contém 1 M Tris, ácido de 0,2 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 1 mM fluoreto de phenylmethylsulfonyl (PMSF).
    Nota: Preparar o Ang eu buffer de geração através da mistura de um 1 M Tris/0.2 mM EDTA aquosa de tampão (ajustar o pH 5.5 usando ácido acético) e uma solução PMSF (100mm em metanol). Ambas as soluções podem ser armazenadas 1 mês em soluções de mistura os dois 4 ° C. no dia do experimento.
  6. Automaticamente transferir as soluções para uma placa de 96 poços, 3 repetições por solução, 34 µ l por bem. Incubar a placa a 37 ° C por 3 h.

2. Imuno-enriquecimento de Ang eu grânulos revestidos usando anticorpo

  1. conjugação do anticorpo em grânulos de proteína G magnéticos
    Nota: conjugação do anticorpo com os grânulos é executada manualmente durante a 3h Ang eu período de geração na dia do experimento. Para outros analitos, os grânulos conjugados podem ser capazes de ser armazenado no buffer PBS contendo 0.015% CHAPS (PBSC) em 4 ° C, durante três meses ou mais, dependendo das propriedades e estabilidade do anticorpo.
    1. µ L 110 de transferência de dejetos de talão (o suficiente para medir 20 amostras e fazendo uma curva padrão de 6 pontos) em um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos sete vezes com 1 mL de acetonitrila/PBSC de 25% e três vezes com 1 mL de PBSC. Use um suporte magnético para granular os grânulos entre cada etapa de lavagem. Retire o tampão de lavagem após a última lavagem.
      Nota: Lavar 7 vezes com 25% acetonitrila/PBSC é crítica para a remoção dos aditivos incompatível com a MS no chorume do grânulo, tais como Tween-20. Se não houver nenhum desses aditivos em grânulos selecionados, esta etapa de lavagem extensa pode não ser necessária.
    2. Resuspend os grânulos no 110 µ l de PBSC e adicionar 110 µ l de anti-Ang eu anticorpo (concentração do anticorpo final: 100 µ g/mL). Misture a solução e grânulos pipetando e então eles incubar à temperatura ambiente durante 1 h, girando a 8 rpm.
    3. Lave os grânulos 3 vezes com 1 mL de PBSC e Resuspenda em µ l 1100 de PBSC.
      Nota: Se qualquer solução de grânulo fluiu na tampa do tubo durante a incubação, spin para baixo a solução usando uma centrífuga de bancada em 2680 g. x
    4. Transferir a solução de talão manualmente para uma placa de 96 poços (grânulo placa padrão). Usar o líquido automatizado sistema de alíquota de manipulação as contas para a mesma placa de 96 poços, 120 µ l por bem..
  2. imuno-enriquecimento em grânulos
    1. após a 3h Ang período de geração, coloco a placa de incubação na gelo durante 10 minutos terminar a geração de Ang I.
    2. Automaticamente diluir a solução-mãe SIS peptídeo (10 pmol/μL) 100-fold com PBS buffer e ainda mais automaticamente alíquota a diluição do padrão de peptídeo isoptope estável para um prato PCR de 96 poços. Transferência de 1,5 µ l de uma solução de peptídeo de padrões (SIS) isótopo estável (contendo 100 fmol) em cada poço da placa de incubação e misture com as amostras de plasma ou a CEWA nos buffers de PBS.
    3. Automaticamente transferir o conteúdo da placa de incubação para a solução do grânulo, 10 mL por bem, misturar a.
    4. Rodando a 8 rpm, incubar a placa a 4 ° C, durante 1 h.
    5. Lave os grânulos três vezes automaticamente com solução de bicarbonato de amónio (AmBic) de 5 mM, 100 µ l por alvéolo por lavagem. Após a última lavagem, resuspenda os grânulos em 7 µ l de solução AmBic em cada poço de 5 mM. Use um ímã para puxar os grânulos para o fundo após a última lavagem.

3. Transferência de contas em um prato de alvo de MALDI e adicionando a solução de matriz

  1. transferência 7 µ l do chorume grânulo automaticamente em um prato de alvo MALDI com um tamanho de ponto de 2.600 µm. Deixe secarem os grânulos.
    Nota: Um pequeno ventilador alimentado por USB pode ser usado para acelerar o processo de secagem de talão.
  2. Automaticamente adicionar 2 µ l de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (HCCA)-solução de matriz (contendo 3 mg/mL HCCA, citrato de amónio de 1,8 mg/mL, acetonitrilo 70% e 0,1% o ácido trifluoroacético) da matriz bem para cada amostra local sobre a placa-alvo .

4. Aquisição por uma MALDI-TOF-MS e análise de dados de sinal

pontos
  1. analisar a amostra com um instrumento de MALDI-TOF usando modo positivo refletor. Executar a calibração interna, suavização de dados e subtração de base automaticamente com o software específico do fornecedor.
    Nota: O modo (linear/positivo/negativo, refletor) selecionado para medição de MALDI-TOF depende a peptídeos alvo ou proteínas.
  2. Calcular a taxa de resposta relativa (relação de intensidade de Nat/SIS) e compará-lo com a curva padrão para determinar do Ang eu concentração em cada amostra. Calcular PRA usando a equação (1), onde Δt Ang eu geração representa o tempo usado para a geração de Ang I.
    PRA = [Ang eu] / Δt Ang eu geração (1)

Resultados

Um procedimento iMALDI automatizado para medição de Ang é mostrado na Figura 1. Peptídeos de alvo (endógenos ou peptídeos de proteínas digeridas) são enriquecidos em grânulos magnéticos antipeptídeos, e em seguida as contas são transferidas para uma placa-alvo para a medição de MALDI. Todo o processo é simplificado em comparação com outras tecnologias de imuno-MS que exigem etapas de eluição de peptídeo adicionais. Automação do ensaio iM...

Discussão

Comparado a quantificação de proteína convencional baseada em MS, iMALDI utiliza anticorpos para enriquecer os analitos e purificá-los de amostras complexas, portanto, tornando possível quantificar proteínas ou peptídeos em baixas concentrações. Um passo crítico no protocolo iMALDI é o imuno-enriquecimento dos peptides alvo. Para este efeito, devem ser selecionados anticorpos com alta especificidade e afinidade. Em SISCAPA, relatou-se que seriam necessários para atingir alta sensibilidade em baixa ng/mL

Divulgações

C.H.B detém a patente sobre a tecnologia iMALDI.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio financeiro de Canadá do genoma e genoma da Colúmbia Britânica para operações (204PRO) e desenvolvimento de tecnologia (214PRO) através de rede de inovações o genoma (gim). Agradecemos a plataforma de descoberta de drogas do Instituto de pesquisa do centro de saúde de Universidade McGill para a utilização do instrumento MALDI-TOF para as filmagens. H.L. é grato pelo apoio de uma bolsa de pós-doutorado do nacional de ciência e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). C.H.B é grato pelo apoio de fundo de dotação a Leading Edge (Lopes). C.H.B. é grato pelo apoio da cadeira McGill Segal em Oncologia Molecular da McGill University (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. e C.H.B. estão gratos pelo apoio de Warren Y. Soper Charitable Trust e o Alvin Segal Family Foundation para o Hospital Geral judaico (Montreal, Quebec, Canadá).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Healthy control human plasmaBioreclamationHMPLEDTA2
Ammonium bicarbonateSigma Aldrich09830
Ammonium citrate dibasicSigma Aldrich09833
CHAPS (>=98%)Sigma AldrichC9426
Albumin from chicken egg white (>98%)Sigma AldrichA5503
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichEDS
Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma Aldrich70990
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417
Phenylmethanesulfonyl fluorideSigma Aldrich78830
Trifluoroacetic acidThermo Fisher Scientific85172LC-MS grade
acetonitrileFluka34967LC-MS grade
waterFluka39253LC-MS grade
acetic acidFluka320099LC-MS grade
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneRoche Diagnostics3118169001
Dynabeads Protein G magnetic beadsThermo Fisher Scientific10003D2.8 μm, 30 mg/mL
anti-Ang I goat polyclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7419
Nat and SIS Ang Isynthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre
Automated liquid handling systemAgilent16050-102Agilent Bravo robotic workstation
MagnetThermo Fisher Scientific12321DInvitrogen DynaMag-2 magnet
Tube rotatorTheromo Scientific400110QLabquake Tube Rotator
MagnetThermo Fisher Scientific12027DynaMag-96 side skirted magnet
MagnetVP Scientific771RM-1used to pull the beads to the bottom of the well
MALDI-TOFBrukerBruker Microflex LRF instrument

Referências

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