In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

要約

この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。

要約

テロメアの長さを測定するには、それぞれに長所と短所があります。従来のアプローチであるテロメア制限フラグメント（TRF）解析は、ゲノムDNAサンプルを制限酵素で消化し、テロメアDNAリピートといくつかのサブテロメリックDNAを残すDNAハイブリダイゼーション技術を利用しています。これらをアガロースゲル電気泳動で分離し、フィルター膜に移し、テロメア制限断片を視覚化するために化学発光または放射能のいずれかで標識されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。このアプローチは、PCRのような他の技術よりも多量のDNAを必要とするが、細胞集団のテロメア長分布を測定することができ、絶対キロベースで表される測定を可能にする。この原稿は、テロメアの長さを決定するための修飾されたDNAハイブリダイゼーション手順を実証している。まずゲノムDNAを制限酵素（切断しないテロメア）、アガロースゲル電気泳動で分離した。次いで、ゲルを乾燥させ、DNAを変性させ、放射標識オリゴヌクレオチドプローブにその場でハイブリダイズさせる。このin situハイブリダイゼーションにより、テロメアDNAの消失が回避され、シグナル強度が改善されます。ハイブリダイゼーション後、ゲルを蛍光スクリーンを利用して画像化し、テロメア長をグラフプログラムを用いて定量する。この手順は、Drsの研究所によって開発された。テキサス大学南西部^{1,2 での} Woodring WrightとJerry Shay。ここでは、いくつかの変更を加えて、この手順の詳細な説明を示します。

概要

テロメアは、染色体の末端に位置し、細胞遺伝情報を保護するのに重要な役割を果たす配列TTAGGG（ヒト染色体上）のヌクレオチド反復である^3,4,5 。テロメアは、数千塩基対の長さであり、DNA複製の間、染色体の残りの部分の完全性を保護するのに役立つ。染色体の複製は完全ではないので、染色体の末端が完全にコピーされない。この複製の非効率性は「複製終了の問題」と呼ばれ、複製の各ラウンド^6,7の間にいくつかのテロメア反復の損失をもたらす。テロメア長は、失われたテロメア配列^8,9を置換する酵素であるテロメラーゼによる細胞分裂後に回復することができる。しかし、テロメラーゼは、ほとんどのヒト体細胞において活性化され、結果として、時間の経過と共にテロメアが短くなり、最終的に細胞の老化が起こる。テロメア短縮のために、テロメアは加齢および加齢性疾患のリスクのバイオマーカーとみなされている^11,12 。さらに、テロメアの長さは、テロメアの長さが毒物学的、疫学的および行動学的研究におけるバイオマーカーとしての役割を果たすことができることを示す、遺伝的、環境的、および生活習慣因子および酸化的ストレスなどの他の刺激によって影響され得る13,14,15。

この記事では、Mender and Shay ²およびKimura et al。から適応された改変されたターミナル制限フラグメント（TRF）分析を用いてテロメア長を測定する技術を示す。 ¹⁶ 、Herbert、Shay、Wrigに似ていますht ¹とHaussmannとMauck ¹⁷ 。伝統的に、TRF分析はサザンブロット手順を含む。サザンブロットは、テロメアの長さを研究するための「ゴールドスタンダード」と考えられ、疫学研究では白血球テロメアの長さを調べるために積極的に使用されている¹⁸ 。このTRF分析は、消化したゲノムDNAを用いてテロメア反復を残す。その後、DNA断片をゲル電気泳動により分離し、変性させてニトロセルロース膜に転写する。テロメア配列は、テロメアオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。分離したテロメアを膜に転写するのではなく、他のTRF技術はDNAの変性の有無にかかわらずゲル内ハイブリダイゼーション技術を使用する。いくつかの種で報告されている間質性テロメアの検出を考慮する場合、変性の包含は重要である¹⁹ 。変性工程がない手順では、一本鎖DNAは末端テロメアにオーバーハングし、間質テロメア配列には結合しない¹⁸ 。

TRF分析の他に、テロメアの長さを測定するためのいくつかの他の方法があり、それぞれに長所と短所があります。 Flow-FISH法は^、フローサイトメトリー16,20を用いて別個の細胞型の個々の細胞の平均テロメア長を測定することができる。 Flow-FISHは高価で、効率が悪く、新鮮なサンプルと高度な技術を必要とする技術者を必要とし、疫学研究の能力が限られています¹⁶ 。さらに、この方法は、細胞集団における染色体数の潜在的変化を説明していない。別の技術、qPCRは、疫学研究のためのテロメア長の測定手段として広く受け入れられている ^{16であり、他の方法と比較してDNAの量が少なくて済み、高スループットで低コストであることが要求されます。しかしながら、qPCRは、単一のコピー遺伝子に対する平均テロメアDNA含量のみを測定することができ、したがって、平均テロメア長の間接的推定である。また、サザンブロットと比較して、比較研究において高いばらつき係数が得られ、疑わしい精度21につながる。}

TRF手続きには、いくつかの研究での使用を制限する独自の欠点があります。 TRF法は、他の方法と比較して大量のDNAを必要とする（サンプルあたり2〜3μg）。これは、十分なゲノムDNAを収集することができ、分解されたDNAサンプルに使用することができない臨床サンプルのテロメア長を調べることへのこの技術の適用を制限する。さらに、TRF分析は費用がかかり、労働集約的であり、結果を得るのに4~5日を要する。しかし、TRFは、低い分散係数をもたらすその再現性を付与する。このプロトコールは、従来のサザンブロット（ in situゲルハイブリダイゼーションを利用する ）とは異なるが、2つの技術は基本的に同じである。

ここに示す技術は、サザンブロットとイン・ゲルハイブリダイゼーションの組み合わせである。サザンブロットからのDNA変性工程をイン・ゲル・ハイブリダイゼーションと関連付ける工程。この組み合わせは、サザンブロットと比較して改善されたプローブシグナル強度の利点を有し、我々の研究室で定量可能な結果を​​一貫して得ている。さらに、化学発光プローブではなく放射能プローブを使用することにより、シグナル強度が高くなり、蛍光イメージング装置による可視化と定量が可能になり、TRFの分析がユーザーフレンドリーになります。

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プロトコル

ゲノムDNA抽出

1. 製造者の指示に従って市販のDNA抽出キットを用いて分析されるべき細胞（ここでは細胞株BJ-hTERT）からゲノムDNA抽出を行う。
2. 分光光度計でDNA濃度を測定する。 DNA濃度が100μg/ mL未満の場合、DNAをエタノールで沈殿させ、TE緩衝液（10mM Tris-Cl; 0.1mM EDTA（Ethylenediaminetetraacetic Acid）; pH8.0）に再懸濁して、 100-600μg/ mL）。

2. DNA完全性評価

注記：このプロトコールの部分は、11cm×14cmのゲルを有するゲル電気泳動システムを用いたDNA完全性評価の概要を示している。他のシステムおよびゲルサイズも使用することができるが、電圧およびDNA移動時間は変化し得る。

1. 100mLの1×TAE緩衝液（40mMのTr（登録商標））中で1gの電気泳動等級アガロースを混合することによって1％アガロースゲルを調製する。is-base; 20mM酢酸; 2mM EDTA;アガロースが溶解され、そして溶液が透明になるまで、マイクロ波（pH8.5）およびマイクロ波で混合する。室温で50℃（約15-20分）になるまで溶液を冷却する。
2. アガロース溶液が冷却されている間、キャスティングトレイにキャスティングエンドゲートを追加してゲルキャスティングトレイを準備します。アガロースの漏出を防ぐため、キャスティングトレイに取り付ける前にエンドゲートを4℃に冷却してください。
3. アガロース溶液が50℃に冷却されたら、10μLのエチジウムブロマイド（dH ₂ O中10mg / mL）を添加し、アガロース溶液をゲルキャスティングトレーに注ぐ。キャスティングトレイに櫛を追加します。
4. アガロース溶液を室温で45分間硬化させる。
5. 1x TEバッファーを使用してゲノムDNA 25ngを最終容量9μLに希釈することにより電気泳動用のDNAサンプルを調製し、10倍ローディング色素（0.25％（w / v）ブロモフェノールブルー、0.25％（w / v）キシレンシアノFF、30％（v / v）グリセロール）。よく混ぜます。
6. 緩衝液レベルがゲルの数ミリメートル上になるように、電気泳動システムに1×TAE緩衝液を充填することにより、DNA移動のためのゲル電気泳動システムを調製する。 DNAサンプルの全体をゲルのウェルにロードする。単一のウェルに5μLのDNAラダーを添加する。
7. 約2時間、またはブロモフェノールブルー染料がゲルのほぼ中間まで100VでDNAを移動させます。
8. 紫外線トランスイルミネーターまたは等価物を用いてゲルを画像化する。
   注：良好な完全性を有するDNA試料は、（剪断されたまたはDNA破壊された）スメアリングのない高分子量バンドを有する。 DNAバンドが塗抹された場合、これらのバンドは完全性が低く、サザンブロット分析には適さず、DNAは新鮮な細胞で再単離されなければならない。

3.ゲノムDNA消化

1. ゲノムDNAの消化を20〜40μLの最終容量で行います。
   注：ボリュームが大きい40μL以上ではアガロースゲルのウェルがオーバーフローします。
   1. マイクロチューブ内で最終濃度が1倍になるように3μgのゲノムDNAと適切な量の10x DNA消化緩衝液（制限酵素とともに供給）を合わせる。 1μLのRsaI制限酵素（10,000U / mL）と1μLのHinfI制限酵素（10,000U / mL）を各チューブに加える。滅菌脱イオンH ₂ Oを用いて最終容量を調整する。よく混合する。短時間（16,000 xgで10-15秒）遠心分離して、すべての成分がチューブの底にあることを確認します。
2. 消化を37℃で16時間以上インキュベートする。消化後、必要に応じて消化したDNAを4℃または-20℃で2日間以上保管してください。

ゲノムDNAゲル電気泳動

注記：このプロトコールの部分は、20cm×25cmのゲル電気泳動システムを使用する手順を概説しています。異なるゲル電気泳動システムを使用することができるが、電圧、移動時間、および最適な結果を得るためにシステムに添加される電気泳動バッファの量を含むいくつかの変数を変更する必要があり得る。

1. 2.25gのゲル電気泳動等級アガロースと375mLの電気泳動緩衝液（1×TAEまたは0.5×TBE（110mMトリス塩基; 90mMホウ酸; 2.5mM EDTA; pH8.3）との0.6％アガロース溶液を調製する。
   注：8000 kB未満のテロメアの場合は0.5 x TBEが推奨されますが、テロメアの場合は1 x TAEが8,000 kBと20,000 kB ^1の間で推奨されます。
2. アガロースが溶解し溶液が透明になるまで溶液をマイクロ波で照射する。室温で15〜20分間、またはアガロースが50℃に達するまで溶液を冷却させる。
3. アガロース溶液が冷却されている間、ステップ2.2で説明したゲルキャスティングのためのゲル電気泳動システムを調製する。アガロースゲル溶液をゲルキャスティングトレーに注ぎます。櫛を入れるゲル。ゲルを室温で45分間覆って硬化させる。
4. 消化したDNAサンプルを電気泳動用に調製する。 40μLの反応のために、0.4μLの10×ローディング色素を消化したDNAの各サンプルに加える。簡単に遠心分離（10-15秒、16,000×g）して、すべての溶液がチューブの底にあることを確認します。
5. DNA移動のためのゲル電気泳動システムを準備する。ゲルからエンドゲートとくしを取り除きます。 1x TAEまたは0.5x TBEでゲル電気泳動システムを充填ラインに充填し、ゲルが完全にバッファーに沈められるようにします。
6. サンプル間にブランクウェルがあるようにDNAサンプルをゲルのウェルにロードします。気泡の発生やゲルの穿孔を避けてください。 10μLのDNAはしごをゲルの反対側のウェルのウェルに加える。
   注記：DNAラダーのタイプは、テロメアの長さによって異なります。テロメアの長さは人によって異なり、細胞の供給源によって異なります。
7. 1でゲル電気泳動を行う。DNAをゲル中に迅速に移動させるために50Vで30分間;電圧を57 Vに調整し、18〜24時間運転してください。

5.ゲル蛍光イメージングおよびハイブリダイゼーション

1. 18-24時間後、ゲル電気泳動電源を切る。電気泳動緩衝液からゲルを含むゲルキャスティングトレーを取り出す。ゲルの右上コーナーをスライスして、ゲルの配向の基準となるようにする。
2. ゲルよりもやや大きなサイズになるように紙を切断して濾紙を準備します。フィルターペーパーをキャスティングトレイのゲルの上に置き、紙がゲル上の余分な溶液を浸すのを許します。フィルターペーパーとゲルの間の気泡を注意深く取り除き、ローラーとしてピペットを使用して、側面から泡を押し出す。
3. 紙がゲルの下に来るようにゲルとろ紙をひっくり返して、キャスティングトレイからゲルを取り出します。ろ紙でゲルをゲル乾燥機に移し、プラスチックラップ付きゲル。ピペットをローラーとして使用して、プラスチックラップとゲルの間の気泡をすべて除去します。
4. ゲルを50℃で2時間乾燥する。
5. 乾燥したら、プラスチックラップを取り出し、250mLの脱イオン水を含むガラス皿にゲルおよび濾紙を移す（ゲルを覆うのに十分）。慎重に濾紙を取り出し、室温で15分間ゲルをインキュベートする。ゲルは薄く、しっかりしていて、裂けることなく操作するのが簡単です。
6. 脱イオン水中で5×SSC溶液（750mM NaCl; 75mMクエン酸ナトリウム）を調製する。
7. ゲルをナイロンメッシュ（12インチx 12インチ）の上に置きます。ナイロンメッシュをロールし、ゲルが一緒に接触していないことを確認してください。ハイブリダイゼーションチューブ（ 例えば 、直径1.5インチのチューブに12本）にメッシュとゲルを入れます。
   注：適切にロールアップすると、ゲルはナイロンメッシュの両側に接触します。
8. 100mLの5×SSCと12μLの緑色蛍光核酸を混合する。シード染色し、ハイブリダイゼーションチューブに入れます。溶液を光から保護し、回転しながらハイブリダイゼーションオーブン中で42℃で30分間インキュベートする。
9. ハイブリダイゼーションチューブからナイロンメッシュ/ゲルを取り出し、250mLの脱イオン水を含むガラス皿に平らに置き、ナイロンメッシュを静かに取り除きます。蛍光イメージング装置を用いてゲルをイメージングする。蛍光の設定を使用してください：520 BP、40青、488 nm。光電子増倍管（PMT）を375に、焦点面を+3 mmに、感度を通常に設定します。イメージをファイルに保存します。

6.ハイブリダイゼーション

1. 放射性テロメアプローブを準備する。
   1. テロメアプローブ（5-（CCC TAA） ₄ 3 '）2μL（2ng）、10xポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液2.5μL、γ32 P-dATP（6,000Ci / mmol）3μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびDNアーゼを含まない滅菌脱イオン水を、マイクロリットルで20μLの最終容量遠心チューブ。
      注意：放射能を使用する際は施設の放射能安全性および規制に従ってください。
2. 簡単に遠心分離（16,000×gで10-30秒）し、37℃の水浴中で1時間インキュベートする。 16,000×gで10-30秒間遠心分離し、65℃で20分間インキュベートして反応を停止する。
3. G-25クロマトグラフィーマイクロスピンカラムを用いてカラムの内容物をボルテックスで混合し、次いで室温で700×gで1分間遠心分離する。ろ液を捨てる。
4. 放射性プローブ溶液をG-25クロマトグラフィーカラムにロードし、700 x gで2分間遠心分離する。ろ液を保存します。
   注：これには放射性テロメアプローブが含まれているので、ろ液を保持してください。放射性プローブは必要に応じて4℃で保存することができます。
5. 滅菌脱イオン水中の1.5M NaClおよび0.5M NaOHからなる変性溶液250mLを調製する。
6. 250mLの変性溶液を含むガラス皿にゲルを入れ、インキュベーションする室温で15分間おいた。変性溶液を除去し、250mLの滅菌脱イオン水と交換する。室温でオービタルシェーカー（40〜50rpm）で10分間インキュベートする。
7. 1.5 NaClおよび0.5Mトリス - 塩酸（pH 8.0）からなる中和溶液250mLを滅菌脱イオン水中で調製する。
8. 脱イオン水を除去し、250mLの中和溶液と交換し、室温で15分間インキュベートする。
9. 中和溶液中でのインキュベーションの間、5×SSC、5×デンハルト溶液（0.1％非イオン性合成ポリマー; 0.1％ポリビニルピロリジン; 0.1％ウシ血清アルブミン）、10mMリン酸二ナトリウム（Na ₂ HPO ₄ ）および1mMピロリン酸ナトリウム四塩基性10水和物（Na ₄ P ₂ O ₇・10H ₂ O）を滅菌脱イオン水に溶解した。
10. ゲルをナイロンメッシュに入れ、ハイブリダイゼーションチューブに入れる（ステップ5.7）。ハイブリダイゼーション溶液20 mLを添加し、42℃で10分間ハイブリダイゼーションオーブン中でインキュベートする。
11. ハイブリダイゼーション溶液を除去し、20mLの新鮮なハイブリダイゼーション溶液と交換する。テロメアプローブ全体を加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションオーブン中でインキュベートする。

7.ゲル洗浄、蛍光体スクリーン露光、およびラジオイメージング

1. 滅菌脱イオン水中の2xSSC溶液（300mM NaCl; 30mMクエン酸ナトリウム）500mLを調製する。
2. 脱イオン水中の0.1x SSC（15mM NaCl; 1.5mMクエン酸ナトリウム）および0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）250mLを調製する。
3. ハイブリダイゼーションチューブからゲルおよびメッシュを取り出し、250mLの2×SSCを含むガラス皿に入れる。ナイロンメッシュを展開して取り出します。ガラス皿をオービタルシェーカーに置き、室温で15分間インキュベートする。
4. 2x SSCを取り外し、250mLの0.1x SSCおよび00.1％SDS溶液に溶解し、室温でオービタルシェーカーで15分間インキュベートする。
5. インキュベーションの間、蛍光体スクリーンを画像消しゴムに15分間暴露する。
6. 0.1×SSCおよび0.1％SDS溶液を除去し、250mLの2×SSCと交換する。オービタルシェーカーで15分間インキュベートする。
7. ゲルを2×SSC溶液から取り出し、ゲルをプラスチックラップに包んだり、ヒートシール可能なポーチに入れてください。ゲルとプラスチックラップまたはプラスチックパウチの間にあるすべての気泡とエアーポケットを取り除きます。 Phopshorスクリーンを用いてゲルを露光カセットに入れる。蛍光体スクリーンをゲルに一晩さらす。
8. 蛍光イメージャを使用して、露出した蛍光体スクリーンをイメージングする。

テロメア長の定量化

1. 緑色蛍光核酸染色ゲルの蛍光イメージを含むphosphorimagerファイルを開きます（ 図1 ）。
2. 「ツール」を選択し、次に「ピクセル距離9;マウスを使用して、ゲルの底から最初のマーカーバンドの中央に線を引いて距離を記録します。各マーカーバンドに対してこの手順を繰り返します（ 図2 ）。これらの距離は、後述のグラフ作成プログラムで使用されます。
3. 放射標識されたゲルのリン光画像を開きます （ 図3 ）。 「オブジェクトマネージャ」を選択し、次に「グリッド」を選択します。 Gridを1列150行に設定します。ゲルの上部からゲルの底まで伸びるようにグリッドを調整します。グリッドの幅を、レーンの幅に合わせて調整します。グリッドの端をクリックし、グリッドの幅をドラッグしてレーンの幅に等しくします。
4. このグリッドをコピーして（ボックスの幅と高さが同じになるように）、2番目のグリッドを空のレーンに移動します（バックグラウンド目的）。追加のサンプルレーンのために追加のグリッドをコピーして移動し続けます。
   注：終了したら、各標本レーンのグリッドと背景の空のレーンの1つのグリッド（ 図4 ）。
5. [分析]、[ボリュームレポート]の順に選択します。レポートのすべてのグリッドを選択します。ボリュームレポートが表示されたら、レポートをダブルクリックしてスプレッドシートプログラムをアクティブにします。 'Volume'レーンの下に表示されます。
6. 適切なグラフ作成プログラムを開き、新しいデータとテーブルを作成します。 'Y：各点に1つのY値を入力してプロット'を選択し、次に '作成'を選択します。
7. 最初の列（列X）に「測定距離」とラベルを付け、2番目の列（列Y）に「分子量」とラベルを付けます。列Yに各マーカーバンドのマーカー分子量を入力します。各分子量マーカーに対応するステップ8.2で得られた移動距離を入力します。
8. 「分析」に行き、「分析」を選択してから「非線形回帰（カーブフィット） 'を選択し、「OK」を選択します。次の画面で、「指数関数」を選択し、次に「1位相減衰」を選択します。 「範囲」タブを選択し、「曲線を定義する点の数」に「150」を入力し、「曲線を別のプログラムにエクスポートまたはコピーするXY座標の表を作成」にチェックを入れます。
   注記：「データ1の非線形フィット」の結果は、Y行の各距離の分子量を含みます。
9. サンプルレーンの分析のために、実際のテロメアバンドの上下の分析領域を選択します。レーンの全長を使用しないでください（ 図5 ）。各レーンの分析領域のグリッド位置を決定する。
10. 'ファイル'、 '新規'、 '新しい表とグラフを作成'を選択します。 'Y：各点に1つのY値を入力してプロット'を選択し、次に '作成'を選択します。スプレッドシートファイルから背景レーンのボリューム値（強度値）をコピーして貼り付けます。サンプルレーンから第1列Yへの第1列（X）およびボリューム値（強度値）に変換する。複数のサンプルレーンがある場合、スプレッドシートファイルからのボリューム値の各セットをグラフ作成プログラムの追加のY列にコピーするファイル。
11. 手順8.8で決定された分析領域外のバックグラウンド列（X）および各サンプルレーン（Y）から値を削除します。
    注記：データテーブルには、分析領域に対応するグリッド位置に値のみを含める必要があります。
12. 分析を選択してから、「分析」および「変換」を選択します。 [OK]をクリックします。 「Y = YXを使用してY値を変換する」を選択します。これは、データ2（変換された強度値（Y）=サンプル強度（Y） - バックグラウンド強度（X））のデータを変換する。
    1. [分析]、[分析]、[列分析]、[列統計]を選択します。 [OK]を選択します。結果タブのCol。データの変換の統計2 ''Sum'行の下で、Σ（Int _i ）。
13. 「ファイル」、「新規」、「新しい表とグラフを作成」を選択します。 'Y：各点に1つのY値を入力してプロット'を選択し、次に '作成'を選択します。結果ページの「データ1、曲線のノンリンクフィット」のY列データをコピーして新しいX列に貼り付けます。結果ページの「データ2の変換」のY列データをコピーして新しいY列に貼り付けます。分析を選択してから、「分析」および「変換」を選択します。 [OK]をクリックします。 'Y = Y / Xを使用してY値を変換する'を選択します。
    1. [分析]、[分析]、[列分析]、[列統計]を選択します。 [OK]を選択します。結果タブのCol。データ3の変換の統計は、「合計」行の下に、Σ（Int _i / MW _i ）を示す。 MW =分子量。
14. 各サンプルの平均テロメア長（TL）を計算するには、式TL =Σ（Int _i ）/Σ（Int _i / MW _i ）。

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結果

細胞株BJ-hTERT（テロメラーゼ不死化ヒト包皮線維芽細胞） ²²およびヒト末梢血単核細胞（PBMC）から単離された3つの濃度のDNA（1,2および3μg）をテロメア長について分析した。 表1は、各DNAサンプルのレーン割り当てを示す。 図1は、ゲルの核酸蛍光染色を示す。分子量標準がはっきりと見える。ゲルの上部から各分?...

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ディスカッション

電気泳動後、ゲノムDNAスミアは800bpより高い。これは、制限酵素が欠損している場合、または（上記のような）追加の酵素が必要な場合に発生する可能性があります。もう一つの可能​​な説明は、タンパク質が依然としてDNAに結合していることである。分光光度計によりDNA濃度を決定する場合、260/280比は約1.8であるべきである。この比が<1.5である場合、制限酵素消化を妨害し得るタンパ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0167S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Hinf1, restriction enzyme	New England Biolabs, Inc	R0155S	10,000 U/mL, DNA digestion.  Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	electrophoresis grade agarose
Optikinase	affymetrix	78334X 500 UN	T4 Polynucleotide Kinase
SYBR Green Nucleic Acid Stain I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		Custom ordered DNA oligonucleotide
Gamma-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	Radioisotope
Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit	Qiagen	13323	DNA extraction kit
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	For purification of readioactive oligo probe
Ficoll 400			non-ionic synthetic polymer
Equipment/Software
Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel electrophoresis
Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel electrophoresis
Nylon mesh, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE Storage Phosphor Screens	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
Phosphor Screen Exposure Cassette	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp Hybridzation Incubator	Fisher Scientific	13-247-20Q
Cylindrical hybridization tubes	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer orbital shaker	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	Orbital shaker
Typhoon 9400	ABI		For imaging of gels and phosphor screens
GraphPad Prism 6	GraphPad	Version 6.05	Graphing Program
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	Spreadsheet program
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	Spectrophotometer