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要約

マイクロ流体バイオ センサー プラットフォームは、設計された、様々 な検体の迅速・高感度な定量化のため低コスト ドライ フィルム現像液の技術を用いて作製しました。この単回使用システムは、ストップ フロー法による上チップ-固定化酵素試金の電気化学的読み出しができます。

要約

近年、バイオ マーカー診断ポイント ・ オブ ・ ケア診断にとって、人間の病気の診断のために欠かせないツールとなった。使いやすい、低コストのセンサー プラットフォームは、定量的かつ具体的にはさまざまな種類の分析 (例えば、バイオ マーカー、ホルモンや薬) を測定するが望ましい。このため、ドライ フィルムのレジスト技術 - 安価な安易な、高速加工 - を有効にするは、ここで紹介するマイクロ流体バイオ センサーを製造する使用されました。その後使用される生物検定によって汎用性の高いプラットフォームは、生体分子の様々 なタイプの検出が可能です。デバイスの作製、白金電極のみクリーン ルーム工程で柔軟性の高いポリイミド (PI) 箔で構成されています。PI 箔はエポキシ系フォトレジスト絶縁電極用基板として提供しています。マイクロ流路がその後開発と PI ウエハの上にドライ フィルムのレジスト (DFR) 箔の積層によって生成されます。チャネルの疎水性停止バリアを使用して、チャネルは、2 つの特定の領域に分かれています: 酵素試金のアンペロ メトリック信号の読み出しのための電気化学的測定セル固定セクション。

チャネル表面への生体分子の吸着によるオンチップ生物検定の固定化が実行されます。グルコース酸化酵素酵素は、電気化学信号のトランスデューサーとして使用されます。基板、グルコースの存在下でこれがプラチナの作用電極で検出された過酸化水素が生成されます。ストップ フロー法は、迅速な検出と信号増幅を得るに適用されます。異なる生体分子は、病気のまたは監視、パーソナライズされた療法を促進する治療薬に関しては、さまざまな種類の指標を与えて導入マイクロ流体システムによる定量的測定できます。

概要

過去二十年以上診断アプリケーションは世界の公衆衛生の開発に関する詳細な研究の基礎になっています。伝統的に、病気の検出実験室の診断ツールを使用します。にもかかわらず、彼らはまだ病気の診断に重要な役割を再生、ポイント ・ オブ ・ ケア ・ テスト (POCT) 患者の近くを実行または患者自身によって近年ますます一般的になっています。急性心筋梗塞や糖尿病のモニタリングなど、すぐに治療を必要とするような場合に特に臨床知見の迅速な確認が欠かせません。したがって、POCT 機器非専門家を運営することができ、同時に短時間1,2,3,4 で正確な体外診断テストを実行することが可能である必要があります。.

顕著な改善は、POCT の分野ですでに達成されています。しかし、まだ5,6,7、8を克服するために多くの課題があります。POCT プラットフォーム市場を正常に起動して実験室の診断と競合するデバイスは厳密に次の要件を満たす必要があります: (i) は研究所と一致している正確で定量的なテスト結果を提供します。調査結果;(ii) 患者の即時の処置を有効にする時間の短いサンプル結果があります。(iii) 未熟な個人によって動作する場合でも、シンプルで簡単な処理を機能し、最小のユーザー介入を必要とします。(iv) 単一用途のために設計された低コストのセンサー ユニットを構成します。さらに、無料の設備診断、資源の乏しい環境3,4,6を中心に、有利です。

これらの厳しい要件のため電気化学検出 (例えば、血ブドウ糖テスト ストリップ) と側方流動免疫測定 (例えば、ホーム妊娠検査) に基づいてのみ 2 つの POCT システム開始されている正常に市場にそうこれまで。しかし、両方のシステムはパフォーマンスの低下などの欠点に苦しむ (不正確なテスト結果をすなわち、血ブドウ糖の監視と横の流れの試金は質的 (正または負) の測定結果を提供するだけ)4、 6。従来の POCT システムのこれらの欠点は、介護4、5の時点で高速、低コスト、および定量的な検出を提供する新しい技術の探索の需要の増加につながっています。

DFR 技術 POCT 機器が直面する課題を満たすためには、使い捨て・低コストのバイオ センサー9,10、11,12,の作製の最近採用されています13,14. DFRs PDMS や SU-8 などのソフトと液体のリソグラフィ材料に比べて多くの利点を提示: (i) 発行しております様々 な組成と厚さ (から数ミリ、数ミクロン);(ii) 各種材料への接着を容易に非常に大まかな表面領域があります。(iii) 機能優れた膜厚均一性;(iv) 量産の安易な安い、高スループットの作製を提供します。(v) ではさみ; シンプルなペアのような様々 な低コストのツールで簡単にカット(vi) 互いの上に複数の DFR 層を積層することによりマイクロ流路などの三次元構造の作成を可能にします。

その一方で、DFRs の一般マスクと保護箔、さらに光を可能にするため DFR の増加の距離の膜厚によって主に引き起こされる液体のフォトレジストと比較して解像度が比較的低いがあります。散乱。まだ、統合されたマイクロ流体バイオ センサーの製造、DFRs が低コストで量産に最適です。

したがって、私たちはこの存在は DFR に基づく電気化学マイクロ流体バイオ センサーの作製と機能します。詳細なプロトコルでは、バイオ センサー プラットフォームの各生産段階、オンチップの固定化 DNA ベースのモデル分析とストップ フロー法を用いたその電気化学的読み出しをについて説明します。この普遍的なプラットフォームは、さまざまな分析技術 (例えばゲノミクス、cellomics、およびプロテオミクス) またはアッセイ フォーマット (例えば、競争力のある、サンドイッチ、または直通) 生体分子の多数の種類の検出を有効。 にします。このような DFR プラットフォームに基づいて、私たちのグループ以前実証抗生物質13,15,16 (テトラサイクリンを含む、様々 な検体の迅速・高感度定量プリスチナマイシンと β-ラクタム系抗生物質)、トロポニン私17、およびサブスタンス P18。

プロトコル

1 マイクロ流体バイオ センサーを用いた DFR 技術の作製

  1. ウェーハの PI の準備。。
    1. カット PI 基板 6 にウェーハをラウンドします。脱水焼くに約 1 時間の 120 の ° C のオーブンで PI ウェーハを置く
      2. 。
  2. リフトオフ プロセス用フォトリソグラフィまず。
    1. 3,000 rpm、2,000 rpm の加速時 30 の回転するスピン コーターをプログラム/s の場所スピンコーター PI ウエハーと真空を適用する、それを修正します。リフトオフ プロセスを可能に、レジスト 2 mL を分注、スピンコーター プログラムを開始します。スピンコーターからウェハを削除し、ソフト焼く 100 で 2 分間ホット プレート上の PI ウェーハ ° C
    2. 肉眼で PI 基板上の電極をパターニングのため目的のマスクを調整し、400 mJ/cm 2 UV 光にそれを露出する (365 nm)。わずか 1 分の場所ボウルにウェハ軌道シェーカーでレジスト マッチング開発者でいっぱいそれを振る
    3. 余分なレジストを除去した後は、濡れたベンチに脱イオン水 (純水) で PI ウエハを洗浄し、乾燥後、圧縮空気を使用してシャワーを使用します
      4. 。
  3. プラチナ電極の形成のための蒸着。
    1. 預金 200 標準物理蒸着法を使用してウェーハ 19 にプラチナの nm
      2. 。
    2. は、ウェハをボウルに配置します。ボウルに一致する除去を追加し、すべての余分なプラチナが削除されるまで軌道シェーカーでウェハを少し振りながらリフトオフ レジストを除去します。1.2.3 のステップで説明したように PI ウェーハを乾燥をすすいで
      3. 。
  4. 2 番目写真平版ステップ: 断熱層を形成します。
  5. それを脱水する 5 分の 120 ° C に予熱したオーブンで PI ウェーハを置く
      6. 500 rpm 時の回転の
    1. プログラム最初ステップ スピン コーターの 5 s。30 の 2 番目のステップをプログラムに 4,000 回転, 700 rpm/s の加速を持つ s
    2. PI ウェーハ スピン コーターに置き、真空を適用する、それを修正します。スピンコーターのプログラムを開始する前に適切なエポキシ系フォトレジストの 4 mL を分注します
      3. 。
    3. ソフト焼くホット プレート上 95 ° C で 3 分間コーティング ウェハ
      4. 。
    4. は、それぞれアライメント マークと眼のレンズを使用してウェーハ上の絶縁層のマスクを調整します。100 mJ/cm 2 UV 光にウェーハを公開 (365 nm).
    5. 露光後ベークの 95 で 2 分間予熱したホット プレート上のウェハを配置 ° C
    6. ボウルにウェハを置き、軌道のシェーカーに適して開発者 (例えば 1-メトキシ-2-プロピル-acetat SU 8 本の場合、2 分間) とレジストを開発
      7. 。
    7. イソプロパノールでまず PI ウェーハを洗い流しし、すすいで 1.2.3 のステップで説明するよう、それを乾燥します
      8. 。
    8. ハード焼く 150、3 時間オーブンでフォトレジスト ° C
  6. 電極の洗浄プラズマ援用します。
    1. 標準プラズマ装置酸素プラズマを使用して、フォトレジスト残留物を除去します。100% O 2 の流れ、250 sccm の割合 3 分の合計時間と 200 W 低周波電源を使用して、洗浄プログラムをスタート
    2. プラズマ室に PI ウェーハを置いて、ガラス蓋を使用して接地板にウェハを修正、プラズマ プロセスを開始します
      3. 。
  7. 銀・塩化銀沈着: オンチップ参照電極を作成する。 紫外線に敏感な粘着テープによるウエハの
    1. Passivate プラチナ接触パッド。5 mm 幅と 11 cm 長いストライプに箔をカットし、銀と供託すべきではない部分を保護するウェハに結び付けます
      2. 。
    2. 銀蒸着のシリカフューム戸棚に超音波槽 (35 kHz) を入れて、お風呂に銀電解液 (100 g/L Ag、pH 12.5) のコンテナーを挿入します。ソニックのお風呂を部屋の温度と電源を 10% に設定します
      。 注意: 銀電解質溶液は毒性が高く、慎重に処理する必要があります。煙を吸入しない必要があります
      3. 。
    3. は、参照電極の一括コンタクトを定電流源に接続します。カウンター電極、標準接続ケーブルを使用して現在のソースに、銀の電解質溶液に浸漬銀線を接続します
      4. 。
    4. DC に-4.5 の電流密度に電流源を設定 mA/cm 2 の銀蒸着速度約 0.3 μ m/分のソニックのバスを開始させ 10 分・ ディ ・水ですすぎ、ウェーハが実行現在ソース
    5. 参照電極の塩素処理、超音波浴に 0.1 M 塩化カリウム (KCl) 溶液の容器を挿入します。ウェハと定電流源による KCl 溶液中浸漬白金電極の一括接触を接続します
      6. 。
    6. +0.6 の電流密度と dc 電流源を設定 mA/cm 2、約 0.075 μ m/分の沈着率の結果ソニックのバスを開始し、電流 7.5 分の実行
    7. 水洗、乾燥、PI ウェーハ、1.2.3 のステップで説明したようします
      8. 。
    8. UV 後 UV 感光性テープを削除 (365 nm) 300 mJ/cm 2 ・ リンス ドライに記載されているステップ 1.2.3 として再度、PI ウエハーの露光します
      9. 。
  8. 3 番目の写真平版ステップ: マイクロ チャネルを作成する使用して DFRs。
    1. は、ウエハース (20 × 20 cm 2) のようなサイズに必要な DFR レイヤーをカットしました。露出ユニットに必要なマスクを修正し、肉眼を使用してマスクに DFR のレイヤーを整列します。250 mJ/cm 2 UV 光でレジストを照らす (365 nm).
    2. は、フォトレジストの保護紙をはがすし、42 ° C とソニック パワーに予熱 (35 kHz) の標準的なソニックのバスを使用して 1% 炭酸ナトリウム (Na 2 CO 3) 溶液を約 2 分間 (構造) によってレジストを開発100%。反作用をすぐに停止し、軌道のシェーカーで 1% 塩酸風呂に 1 分のレジストをシェイクします。1.2.3 のステップで説明したように、DFR 各層を乾燥をすすいで
      。 注: 必要合計では、4 つの DFR 層 1.7 の手順に記載されているように処理する: 1 つのチャネル層、1 つのカバー層および (端曲げからバイオ センサーを防ぐため) 2 つの裏面レイヤーします
      3. 。
  9. 、DFR のラミネーション層 PI 基板上。
    1. は、透明オーバーヘッド箔に PI ウェーハを置き、標準の粘着テープを使用してそれを修正します。それぞれの配置構造を用いた顕微鏡下で PI ウェーハ上チャネル DFR 層を調整します
      2. 。
    2. 、ラミネート用標準圧延ラミネーターと予 100 ° c 上のロールおよび下部ロール 60 ° C 圧設定 3 バー、0.3 m/分の場所の前方速度、ラミネーターの真ん中に固定の DFR 層とウェハと開始します。民主は、ラミネーターがプッシュされます。180 ° でウェハを回転後の手順を繰り返します
      3. 。
    3. バイオ センサーの曲げを防ぐため、次の手順 1.8.1-1.8.2 ウエハの上に 2 つの開発裏面層を積層します
      4. 。
  10. 疎水性停止バリアを採用・ チップを封止します。
    1. 削除 DFR チャンネルのフロント側からの保護の層を置く

結果

設計とマイクロ流体バイオ センサー プラットフォームの試作:

ウエハー レベルで複数 DFR 層を用いた標準写真平版の技術によりマイクロ流体バイオ センサー チップの作製を実現します。この製作方法は、マイクロ流路の形成、プラチナ パターン PI 基板 DFRs の先進層の積層に依存します。作製手順を描いた短い概要は、

ディスカッション

マイクロ流体電気化学バイオ センサーの作製はここで説明したプロトコルにより、生体分子の検出のための低コスト、コンパクト、簡単に使用できるプラットフォームの開発。バイオ センサーでその後使用されるアッセイ、に応じていくつかの異なるマーカーを検出できます。これは、プラットフォームは、非常に汎用性とポイント ・ オブ ・ ケア アプリケーションに標準的な診断テスト...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、ドイツ研究振興協会 (DFG) 許可番号 UR 70/10-01 と UR 70/12-01 下でこの作業を部分的に資金調達のために感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
PyraluxDuPontAP8525RUsed as polyimide substrate
MA-N 1420Micro Resist TechnologyMA-N1420Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533sMicro Resist TechnologyMaD533SDeveloper for MA-N1420
Platinum--Electrode and contact pad material
Ma-R 404sMicro Resist TechnologyMaR404SRemover for MA-N1420
SU-8 3005MicroChem Corp.SU-8-3005Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetateSigma-Aldrich108-65-6Developer for SU-8 3005
2-PropanolVWR8.18766.2500Removing of the SU-8 developer
1020RUltron Systems Inc.1020RUV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna SDegussa1935For Silver depostion on reference electrode
KClMethrom62308.020For chloridation of the silver reference electrode
PyraluxDuPontPC1025Dry film photoresist
Sodium carbonatFluka71352Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich30720To top the development of the DFR
Teflon AF 1600DuPontAF1600For employing the stopping barrier
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PA104Mega Electronics-Bubble etch tank
FED 53Binder9010-0018Oven
SPIN150APT-Spin coater
PräzithermHarry Gestigkeit GmbHPZ 28-2Hot plate
HellasBungard Elektronik40000Exposure unit
Tetra30-LF-PCDiener-Plasma unit
Univex 500Leybold-Physical vapor deposition unit
Shaker S4ELMI-Orbital shaker
Sonorex Super 10 PBandelin783Sonic bath
6221 DC and ACKeithley-Current source
HRL 350Ozatec-Laminator unit
Vaccum penEFD-Vacuum pen

参考文献

  1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
  2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
  3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
  4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
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  6. Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
  7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
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  13. Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
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  19. Mattox, D. M. . Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , (2010).

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