Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

Resumo

Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.

Resumo

Nos últimos anos, o diagnóstico de biomarcador tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico de doenças humanas, especialmente para o diagnóstico point-of-care. Uma plataforma fácil de usar e de baixo custo sensor é altamente desejada para medir vários tipos de analitos (por exemplo, biomarcadores, hormônios e drogas) quantitativamente e especificamente. Por esta razão, tecnologia de película seca fotorresiste - permitindo barato, fabricação fácil e elevado-throughput - foi usada para fabricar o biosensor microfluidic aqui apresentado. Dependendo o bioensaio usado depois disso, a plataforma versátil é capaz de detectar vários tipos de biomoléculas. Para a fabricação do dispositivo, eléctrodos de platina são estruturados em uma folha de poliimida flexível (PI) na etapa de processo de sala limpa apenas. A folha PI serve como substrato para os eletrodos, que são isolados com uma fotorresiste baseada em epóxi. O canal microfluídicos é posteriormente gerado pelo desenvolvimento e laminação de folhas de fotorresiste (DFR) de película seca para a bolacha de PI. Usando uma barreira hidrofóbica parar no canal, o canal é separado em duas áreas específicas: uma seção de imobilização para o ensaio enzima-lig e uma célula eletroquímica de medição para a leitura de sinal amperométrico.

A imobilização de bioensaio em-microplaqueta é executada por adsorção das biomoléculas para a superfície do canal. Enzima glicose oxidase é usada como um transdutor para geração de sinal eletroquímico. Na presença do substrato, glicose, peróxido de hidrogênio é produzido, que é detectada ao eléctrodo de platina trabalho. A técnica de stop-fluxo é aplicada para obter amplificação de sinal junto com detecção rápida. Biomoléculas diferentes podem ser medidas quantitativamente por meio do sistema introduzido microfluídicos, dando uma indicação dos diferentes tipos de doenças, ou, em relação a drogas terapêuticas, monitoramento, facilitando uma terapia personalizada.

Introdução

Nas últimas duas décadas, aplicações diagnósticas tornaram-se fundamental para estudos aprofundados sobre o desenvolvimento da saúde pública global. Tradicionalmente, ferramentas de diagnóstico de laboratório são utilizadas para a detecção de doenças. Mesmo que eles ainda desempenham um papel chave no diagnóstico de doenças, teste point-of-care (bolso) executada perto do paciente ou pelo próprio paciente tornou-se mais e mais comuns nos últimos anos. Especialmente em tais casos que requerem tratamento imediato, tais como infarto agudo do miocárdio ou monitoramento de diabetes, a confirmação rápida de uma constatação clínica é essencial. Portanto, há uma necessidade crescente de dispositivos de bolso que pode ser operado por não-especialistas e que são simultaneamente capaz de realizar testes diagnósticos precisos em vitro em um curto espaço de tempo,^1,2,3,4 .

Melhorias notáveis já foram alcançadas no domínio do bolso. No entanto, ainda existem muitos desafios a superar,^5,6,7,8. Para uma plataforma de bolso para ser lançado com sucesso no mercado e ser competitivo com o diagnóstico de laboratório, o dispositivo estritamente deve cumprir os seguintes requisitos: (i) fornecer resultados de testes precisos e quantitativos que são consistentes com o laboratório conclusões; (ii) ter curto amostra para o resultado vezes, permitindo o tratamento imediato do paciente; (iii) apresentam descomplicado e fácil manuseio, mesmo quando operado por pessoas inexperientes e requer a intervenção do usuário minimizado; e (iv) são compostos por uma unidade de sensor de baixo custo projetada para aplicações de uso único. Além disso, livre de equipamentos diagnósticos são favoráveis, principalmente em ambientes de poucos recursos,^3,4,6.

Devido a estas exigências severas, apenas dois sistemas de bolso, baseados na deteção de eletroquímica (por exemplo, sangue teste tiras de glicose) e em imunoensaios de fluxo lateral (por exemplo, testes de gravidez) tem sido lançados com sucesso ao mercado tão até agora. No entanto, ambos os sistemas sofrem desvantagens como mau desempenho (ou seja, sangue glicose monitoramento tem resultados imprecisos e ensaios de fluxo lateral apenas fornecem resultados qualitativos (positivo ou negativo) medição)^{4, 6}. Estas desvantagens dos sistemas convencionais de bolso têm levado a uma crescente demanda em explorar novas tecnologias que oferecem deteção rápida, baixo custo e quantitativa no ponto de cuidado^4,5.

Para enfrentar estes desafios frente para dispositivos de bolso, DFR tecnologia tem sido recentemente empregada para a fabricação de biosensores descartável e de baixo custo^{9,10,11,12, 13 , 14}. em comparação com materiais litográficas moles e líquidos, tais como PDMS ou SU-8, DFRs apresentam muitos benefícios: (i) estão disponíveis em uma variedade de composições e espessuras (a partir de alguns mícrons a vários milímetros); (ii) tem uma área de superfície muito áspera, o que facilita a adesão de vários materiais; (iii) uniformidade de espessura excelente recurso; (iv) oferecer fabricação barata, fácil e alta produtividade para a produção em massa; (v) são fáceis de cortar com várias ferramentas de baixo custo, como um simples par de tesouras; e (vi) permitem a criação de estruturas tridimensionais, tais como canais microfluídicos, empilhando camadas múltiplas de DFR em cima do outro.

Por outro lado, DFRs em geral têm uma resolução relativamente pobre em comparação com photoresists líquido, que é causada principalmente pela espessura do filme e pela maior distância entre a máscara e o DFR devido a película protectora, que além disso permite que a luz dispersão. Ainda, para a fabricação de biosensores microfluidic integrado, DFRs são altamente adequados para produção em massa de baixo custo.

Portanto, nós apresentamos neste trabalho a fabricação e aplicação de um biossensor microfluidic eletroquímica DFR-baseado. O protocolo detalhado descreve cada etapa de produção da plataforma de biosensor, a imobilização em-microplaqueta de um ensaio de modelo baseado em DNA e sua leitura eletroquímica, usando a técnica de stop-fluxo. Esta plataforma universal permite a detecção de vários tipos de biomoléculas, usando tecnologias de ensaio diferentes (por exemplo, genómica, cellomics e proteômica) ou formatos de ensaio (por exemplo, do competidor, sanduíche ou direta). Com base em tal uma plataforma DFR, nosso grupo anteriormente demonstrou com sucesso a quantificação rápida e sensível de vários analitos, incluindo antibióticos^13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e ß-lactâmicos), troponina¹⁷e substância P¹⁸.

Protocolo

1. fabricação da tecnologia de DFR Microfluidic Biosensor usando

1. bolachas de preparação da PI. Substrato de corte um PI
   1. em 6 - em rodada bolachas. Colocar a bolacha de PI em um forno a 120 ° C por cerca de 1h para assar uma desidratação.
2. Primeiro passo de fotolitos para o processo de decolagem.
   1. Programar a rotação-aplicador para um tempo de 30-s giro a 3.000 rpm, com uma aceleração de 2.000 rpm/s. lugar a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 2 mL de uma resist, permitindo que o processo de decolagem e iniciar o programa de centrifugação-aplicador. Retire a bolacha o spin-revestidor e macio-asse a bolacha de PI sobre uma chapa quente durante 2 minutos a 100 ° C.
   2. Ajustar a máscara desejada para padronização dos eléctrodos sobre a bolacha de PI a olho nu e expô-lo à luz de ² UV 400 mJ/cm (365 nm). Lugar a hóstia em uma tigela cheia de um desenvolvedor de correspondência de resistir em um agitador orbital e deixá-lo agite ligeiramente durante 1 min.
   3. Após a resistir em excesso é removido, usar um chuveiro para enxaguar o wafer de PI com água deionizada (DI-água) num banco molhado e seque-o depois com ar comprimido.
3. Deposição de platina para a formação dos eléctrodos.
   1. Use um processo de deposição de vapor físico padrão para depósito de 200 nm de platina para a bolacha ¹⁹.
   2. Coloque a bolacha em uma tigela. Adicionar o removedor correspondente para a tigela e retire o resistir de decolagem agitando ligeiramente a bolacha em um agitador orbital até todos platina em excesso é removida. Lave e seque a bolacha de PI, conforme descrito na etapa 1.2.3.
4. Segunda etapa de fotolitografia: formando a camada de isolamento.
   1. Colocar a bolacha de PI em um forno pré-aquecido a 120 ° C por 5 min desidratar lo
   2. Programa a primeira etapa de um giro-aplicador para 5 s de girando tempo a 500 rpm. Programa da segunda etapa por 30 s a 4.000 rpm, com uma aceleração de 700 rpm/s.
   3. Coloque a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 4 mL de um apropriado com base em epóxi fotorresiste antes de iniciar o programa de centrifugação-revestidor.
   4. Soft-asse a bolacha revestida por 3 min a 95 ° C, em uma chapa quente.
   5. Ajustar a máscara para a camada de isolamento sobre a bolacha usando as marcas de alinhamento respectivo e uma lente ocular. Expor o wafer de luz de ² UV 100 mJ/cm (365 nm).
   6. Para um Asse pós-exposição, coloque a bolacha em um prato quente pré-aquecido por 2 min em 95 ° C.
   7. Coloque a bolacha numa tigela e desenvolver a resistir com um desenvolvedor apropriado (por exemplo, 1-metoxi-2-propil-acetat por 2 min, no caso do SU-8) em um agitador orbital.
   8. Enxaguar a bolacha PI primeiro com isopropanol e depois enxaguar e secá-lo, conforme descrito na etapa 1.2.3.
   9. Hard-Asse o fotorresiste em um forno para 3h a 150 ° C.
5. Assistido por plasma limpeza dos eletrodos.
   1. Para remover os resíduos de fotorresiste, use o plasma de oxigênio com uma unidade de plasma padrão. Iniciar o programa de limpeza, usando energia de baixa frequência de 200 W com fluxo 100% O ₂, uma taxa de 250 sccm e um tempo total de 3 min.
   2. Coloque a bolacha de PI para a câmara de plasma, corrigir a bolacha na placa aterrada usando tampas de vidro e iniciar o processo de plasma.
6. Prata e deposição de cloreto de prata: criando o eléctrodo de referência em-microplaqueta. Almofadas de
   1. Passivate o contato de platina de wafer com fita adesiva sensíveis ao UV. Corte a folha 5 mm de largura e 11 cm de comprimento de listras e anexá-los para o wafer, protegendo as partes a não ser depositado com prata.
   2. Para a deposição de prata, colocou um banho sônico (35 kHz) uma hotte e introduza um recipiente de solução eletrolítica de prata (Ag, pH 12,5 100 g/L) para o banho. Definir o sonic banho à temperatura ambiente e o poder de 10%.
      Atenção: Soluções de eletrólitos prata são altamente tóxicas e devem ser manuseadas com extremo cuidado. A fumaça nunca deve ser inalada.
   3. Ligar o contato em massa dos eléctrodos de referência a uma fonte de corrente constante. Conecte o eletrodo contador, um fio de prata que está imersa na solução de Prata eletrolítica, a fonte de corrente usando cabos de conexão padrão.
   4. Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de-4.5 mA/cm ², resultando em uma taxa de deposição de prata de aproximadamente 0,3 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar durante 10 min. Enxágue a bolacha com DI-água
   5. Para a cloração do eletrodo de referência, introduza um recipiente de solução 0,1 M de cloreto de potássio (KCl) banho de sonic. Ligar o contacto em massa de wafer e um eletrodo de platina que está imersa na solução de KCl com fonte de corrente constante.
   6. Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de +0.6 mA/cm ², resultando em uma taxa de deposição de aproximadamente 0,075 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar 7,5 min.
   7. Enxagúe e seque o PI da bolacha, conforme descrito na etapa 1.2.3.
   8. Remova a fita de UV-sensíveis após um UV (365 nm) exposição de 300 mJ/cm ² e enxagúe e seque a bolacha de PI, novamente como descrito no passo 1.2.3.
7. Terceira etapa de fotolitografia: DFRs usando para criar os canais microfluídicos.
   1. Corta as camadas DFR necessárias para um tamanho semelhante do wafer (20 x 20 cm ²). Corrigir a máscara desejada para a unidade de exposição e alinhar a camada DFR para a máscara usando a olho nu. Iluminar a resistir com 250 luz de mJ/cm ² UV (365 nm).
   2. Remover a película protectora do fotorresiste e desenvolver a resistir por mais ou menos 2 min (dependendo das estruturas) em uma solução de carbonato de sódio (Na ₂ CO ₃) 1% usando um padrão banho sônico (35 kHz) pré-aquecido a 42 ° C e um poder sônico de 100%. Para parar a reação imediatamente, agite a resistir por 1 min em um banho de HCl 1% em um agitador orbital. Enxaguar e secar cada camada DFR, conforme descrito na etapa 1.2.3.
      Nota: No total, quatro camadas DFR precisam ser processadas como mencionado na etapa 1.7: um canal camada, camada de cobertura de uma e duas camadas de traseiro (impedindo o biosensor de dobra no final).
8. Camadas de laminação da DFR no substrato PI.
   1. Coloque a bolacha de PI em uma folha de aéreos de transparência e fixe-a com fita adesiva padrão. Ajustar a camada DFR canal sobre a bolacha PI sob um microscópio, usando as estruturas do respectivo alinhamento.
   2. Para a laminação, use um padrão quente rolo laminador e pré-aqueça o rolo superior a 100 ° C e o rolo inferior a 60 ° C. ajustar a pressão de 3 bar, com uma velocidade de 0,3 m/min. lugar a bolacha com a camada DFR fixa no meio do laminador e iniciá-lo; o DFR é empurrado através do Laminador. Repita a etapa após a bolacha de giro de 180°.
   3. Para evitar a dobra do biosensor, laminar as duas camadas de traseiro desenvolvidos sobre a bolacha seguindo passos 1.8.1-1.8.2.
9. Empregando uma barreira hidrofóbica parando e selando o chip.
   1. Remover a camada protetora do lado da frente do canal DFR leigosEr, colocando fita adesiva padrão em uma extremidade da DFR e puxando para cima. Use um dispensador de mão com 0,004-em tubos para dispensar pequenas gotículas de politetrafluoroetileno dissolvido em poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídicos, estratificação da camada de cobertura DFR para a camada de canal, conforme descrito na etapa 1.8.
10. Rígido de cozer o biosensor microfluidic.
    1. Remover tudo protetora folhas na capa e parte traseira camadas DFR. Corte os biossensores em tiras usando um simples par de tesouras. Curar as fichas em um forno a 160 ° C por 3 h.

2. Procedimento de imobilização do ensaio no chip

1. adsorção de avidina na área do canal de imobilização.
   1. Preparar uma solução de avidina 100 µ g/mL em 10 mM fosfato salino (PBS) a um pH de 7.4.
   2. Dispensar 2 µ l da solução para a entrada do biosensor avidina.
      Nota: O canal é preenchido por forças capilares até que o líquido atinge a barreira hidrofóbica parar.
   3. Para garantir que o fluídico continua parando na barreira durante o tempo de incubação inteira, dispensar 2 µ l de DI-água na saída do chip. Incubar o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado.
   4. Remover os reagentes em excesso através da entrada do chip pela aplicação de um vácuo. Lavar o canal com 50 µ l de tampão de lavagem (PBS com 0,05% Tween 20), dispensado na tomada enquanto o vácuo está sendo aplicado. Secar o canal por 30 s, enquanto que o vácuo está sendo aplicado.
2. Bloqueando a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica.
   1. Preparar uma solução de albumina de soro bovino (BSA) de 1% em PBS de 10mm a um pH de 7.4.
   2. Pipeta 2 µ l da solução de BSA de 1% sobre a entrada e 2 µ l de DI-água na saída do canal. Incube o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.
3. Oligos incubação do DNA marcados com biotina e 6-fam
   1. Preparar diferentes concentrações (0,001-5 µM) da solução de DNA em 10mm PBS a um pH de 7.4.
   2. Dispensar 2 µ l de uma concentração da solução de DNA na entrada e 2 µ l de DI-água na saída. Incubar o chip a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado.
   3. Repita o passo para as outras concentrações de DNA usando fichas adicionais biosensor 2.3.2.
   4. Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.
4. Imobilização de GOx-etiquetado anticorpos de 6-FAM.
   1. Formular uma concentração de 5 µ g/mL de anticorpos 6-FAM em 10mm PBS a um pH de 7.4.
   2. Introduzir 2 µ l da solução de anticorpo para a entrada e 2 µ l de DI-água para a saída do canal. Incube os anticorpos etiquetados a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso, conforme descrito na etapa 2.1.4.

3. Amperométrico sinal deteção usando a técnica de Stop-fluxo

1. preparação da solução de substrato para a deteção de eletroquímica.
   1. Formular uma solução de glicose 40mm em PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.
   2. Para o tratamento preliminar, preparar uma solução de PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.
2. Tratamento preliminar dos eléctrodos trabalho.
   1. Utilize o suporte de microplaqueta feitos sob medida para permitir a fácil colocação de chip e uma conexão elétrica e fluídico.
   2. Conectar eletricamente o biosensor para a potentiostat. Garantir o contato fluídico do canal microfluidic numa bomba e o reservatório de reagente, usando o adaptador feitos sob medida e tubos. Iniciar o laptop que está conectado para o potentiostat e iniciar o controlador de bomba de seringa, controlando o fluxo fluídico através do chip.
   3. Ligue a bomba de seringa manualmente, com PBS 0,1 M, com um caudal de 20 µ l/min. Para o eletrodo de trabalho contra o eletrodo de referência em-microplaqueta, aplicar tensão alternada de 0,8 e-0.05 V para 5 s cada 30 ciclos. Em seguida, oxidar o eletrodo de trabalho aplicando uma tensão de 0,8 V por 60 s.
3. Leitura do ensaio, usando a técnica de stop-fluxo.
   1. Para iniciar a leitura do sinal de ensaio, aguarde até que o sinal medido atual estabiliza. Parar a bomba de seringa e alternar o reagente de PBS 0,1 M, para a solução de glicose 40mm e iniciar o software para o controlador de bomba de seringa; Ele irá parar automaticamente o fluxo de 1, 2 ou 5 minutos e então irá reiniciar o fluxo novamente. Observar o pico de corrente resultante.
      Nota: Para a análise dos dados, o pico de corrente ou a carga de pico pode ser considerada, conforme descrito no modelo de uma leitura de sinal eletroquímico ( Figura 2).

Resultados

Projeto e fabricação da plataforma Microfluidic Biosensor:

A fabricação dos chips microfluídicos biosensor é realizada no nível do bolacha por técnicas padrão fotolitográfica, empregando várias camadas DFR. Esta estratégia de fabricação depende da laminação de camadas desenvolvidas de DFRs sobre um substrato de PI platina-modelados, formando os canais microfluídicos. Um breve resumo descrevendo as etapas de fabrica...

Discussão

O protocolo aqui apresentado para a fabricação de um biossensor electroquímico microfluidic permite o desenvolvimento de uma plataforma de baixo custo, compacto e fácil de usar para a detecção de biomoléculas. Dependendo o ensaio usado mais tarde no biosensor, vários biomarcadores diferentes podem ser detectados. Isto torna a plataforma muito versátil e fornece acesso aos vários domínios de aplicativos, de testes de diagnóstico padrão (por exemplo, determinar a presença de doenças específicas no ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Pyralux	DuPont	AP8525R	Used as polyimide substrate
MA-N 1420	Micro Resist Technology	MA-N1420	Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s	Micro Resist Technology	MaD533S	Developer for MA-N1420
Platinum	-	-	Electrode and contact pad material
Ma-R 404s	Micro Resist Technology	MaR404S	Remover for MA-N1420
SU-8 3005	MicroChem Corp.	SU-8-3005	Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate	Sigma-Aldrich	108-65-6	Developer for SU-8 3005
2-Propanol	VWR	8.18766.2500	Removing of the SU-8 developer
1020R	Ultron Systems Inc.	1020R	UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S	Degussa	1935	For Silver depostion on reference electrode
KCl	Methrom	62308.020	For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux	DuPont	PC1025	Dry film photoresist
Sodium carbonat	Fluka	71352	Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	30720	To top the development of the DFR
Teflon AF 1600	DuPont	AF1600	For employing the stopping barrier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PA104	Mega Electronics	-	Bubble etch tank
FED 53	Binder	9010-0018	Oven
SPIN150	APT	-	Spin coater
Präzitherm	Harry Gestigkeit GmbH	PZ 28-2	Hot plate
Hellas	Bungard Elektronik	40000	Exposure unit
Tetra30-LF-PC	Diener	-	Plasma unit
Univex 500	Leybold	-	Physical vapor deposition unit
Shaker S4	ELMI	-	Orbital shaker
Sonorex Super 10 P	Bandelin	783	Sonic bath
6221 DC and AC	Keithley	-	Current source
HRL 350	Ozatec	-	Laminator unit
Vaccum pen	EFD	-	Vacuum pen