腰部後根神経節のアクセスと豚注入の椎

要約

Intraganglionic 注入の腰部後根神経節 (DRG) へのアクセスを提供する豚の椎の手法について述べる。注入の進行状況を監視するには、術中と術後後 21 日を確認します。このプロトコルは、DRG の注入を含む今後の臨床研究に使用可能性があります。

要約

後根神経節 (DRG) は、頭の下のすべての第一次感覚ニューロンが含まれている明確な解剖学的構造です。この事実は、慢性的な痛みの治療を目的とした治療薬の注入の DRG の魅力的なターゲットを作る。小動物モデルにおける各 DRG を囲む椎体骨の外科的切除が含まれるために、DRG の注入を促進する椎弓切除術を使用されています。大型動物種、すなわち、豚の腰部後根神経節の intraganglionic 注射用手法を示す.椎は、DRG 標準脳神経外科技術・機器・材料の使用への直接アクセスを許可するように実行されます。椎弓切除術を介してより広範な骨削除と比べると、後根神経節での十分なアクセスを達成しながら脊髄の解剖学を節約するために椎弓切開術を実施します。DRG 注入の術中の進行状況は、非毒性の染料を使用して監視されます。術後 21 日に安楽死、次の注入の成功は 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) intraganglionic 分布の組織によって決定されます。プロトコルを示す生物学上不活性溶液を注入しています。このメソッドは、DRG のターゲット治療解決に応用の将来的に臨床研究で可能性があります。我々 の方法論は、大型動物種で intraganglionic 小動物パラダイムの訳しをテストを容易する必要があります。さらに、このプロトコルは、これらの豚の DRG 注入の前臨床試験を計画の重要なリソースとして役立つかもしれない。

概要

後根神経節 (DRG) は、脊柱に沿って位置する解剖学的離散、神経のコレクションです。各 DRG には、特定の部位からのエンコードおよび中枢神経系 (CNS)、末梢刺激を中継する第一次感覚ニューロンが含まれています。たとえば、変形性関節症の痛みが始まるジョイント約に位置する苦痛の受容器は侵害刺激を認めるとき。このプロセスは侵害受容と呼ばれます。侵害刺激の長期的な意識は、慢性的な痛み¹に します。

慢性の苦痛は頻繁に臨床研究²学科 intraganglionic 注入³など DRG に鎮痛薬のターゲットを絞った配信するための便利なメソッドを開発する 1 つの目標があります。ただし、DRG アクセスしにくい椎間孔⁴のボニーの範囲内に存在するため。いくつかのグループは正常に齧歯動物^5,6,7,8,9,10で脊椎外科を使用してこの障害を克服しています。

クリニックで椎弓切除術は一般的な脊椎操作は、椎弓板、それにより脊柱管¹¹を治療の外科的除去を指します。DRG の直接アクセスを余裕に外科的技術の取り込みが齧歯動物^5,12で成功している、しかし、翻訳があります関連する構造体のサイズを考慮した非現実的な違いと方法に影響薬物動態学や技術的可能性^13,14。たとえば、1 つの研究は、T10 は 3.0、7.0、およびラット、ブタと人間、それぞれ¹⁵の 8.2 mm で横脊髄直径を決定しました。したがって、大型動物は良い神経構造のおおよその人間寸法をモデル化します。

豚、Raoreらは複数の脊髄内注射¹⁶頚髄へのアクセスにマルチレベル椎弓切除術を使用しました。プロシージャ名は忍容性の段階に私主導臨床試験と同等の治療成績が文書化された¹⁷をしました。これらの結果は、技術的な可能性と人間の安全性の予測因子として臨床大動物モデルの継続的な使用をお勧めします。

日には、詳細な方法について手術適応と大型動物種の DRG の注入のために存在しません。この橋渡しのギャップを絞り込むには、DRG 露出豚椎注入のためのプロトコルを報告します。標準脳神経外科技術・機器・材料を用い、現代の手術の実際を模倣するように工夫しました。腰部後根神経節の水溶液を用いた intraganglionic 注射、術後 21 日目後組織を介して配信の成功を確認します。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) メイヨー クリニックのによって承認されている

。

1 前提条件の厳しさと再現性

設計の厳しさを確保するため、良い研究所プラクティスはすべての回で、任意の動物の前に IACUC (または同じような委員会) の内部承認の国家基準に従うに

1. 。実験で関与します
   。 注: このプロトコルは、臨床的に忠実なアプローチを維持するために設計されました。したがって、材料・機器・技術は、ヒトでの最高臨床基準と同一の方法で説明します。たとえば、厳密な無菌が続いて、期限切れの材料を使用しないでください
。 実験の設定でこの手法の再現性をサポートする
2. 内部標準の運用手順を開発し、豚の品種、体重、性別、および別のコホート間の年齢の変動性を制御します
   。 注: このプロトコルの設計は 38-53 キロの重量を量る豚の使用に基づいていた

2。術前動物愛護

1. 手続きの前に 1 日 5 mg/kg で与えられる予防の筋肉 (IM) セフチオフルを管理します
。
2. 固体食糧の動物を高速し、美容トリートメント、オイルの浴室 つまり、前の手順 12 h から動物を制限します
。
3. IM チレタミンとチレタミン、5 mg/kg で IM キシラジン、2 mg/カットで与えられる Telazol として与えられるを使用して、プロシージャの 1 h 内誘導全身麻酔
4. 誘導、一度管理 0.18 mg/カットで与えられた皮下 (SC) 持続ブプレノルフィン リリース (SR)
5. 耳静脈カテーテルを置き、急速なシーケンス挿管気管内チューブを配置するを実行します
。
6. 、パルスオキシメータの心拍数監視機能酸素濃度と心拍数を監視する舌に付います
。
7. は腹臥位で動物を置き電気クリッパーを使用して背部に皮膚をクリップします。正中線のコロナの平面、正中矢状面と縦肩甲骨の棘、仙骨アペックスからの拡張の大きな二国間の領域上の髪をクリップします。粘着テープを使用して髪とフローティング皮膚削除します
。
8. 暖かい水と石鹸で最大 3 回のクリップされた領域をスクラブし、乾燥肌を糸くずなしのタオルを使用しています
。
9. マーク二国間の解剖学的ランドマークは、外科用マーカーを使用しています。最後の肋骨、腸骨稜、棘突起、横突起をマークします
   。 注: 最後の肋骨、腸骨稜および横突起をマークすることによって腰椎が画定、スーペリアー、劣っていると横方向の境界に沿ってそれぞれ。このプロトコルは、アクセスと関心の任意の腰部後根神経節の注入を導くために設計されています。参考のため優れた腸骨稜に揃えて L3 または L4 椎
。
10. 手術のスイートへの輸送のための暖かい毛布と動物をカバーします
。

3。手術群位置決め

1. 優しくリフトと変更された大規模な動物愛護動物に位置しやすい動物スリング パッドを入れられた腹部の開口部と
   。 注: 腹部の開口部により、腹部圧力の低減のため背骨の人間の手術中に使用するウィルソン フレームのよう。ターンでは、これは脊髄の血管から術中出血を減少します。スリングは、足は末梢神経衝突から動物を保護するパッド入りの開口部を通して自由にハングできるため便利です。ただし、スリング フレームは金属製、ので、絶縁電気短絡および不注意な動物焼跡を避けるためにパディングされます必要があります。ブランケッ トロールは動物の大きさによって、快適なポジションで頭と首の位置に配置できます
。 1-3% を使用して
2. 維持麻酔吸入効果に滴定 (IH) イソフルラン。眼軟膏で目を湿らせて、軽くテープでシャット ダウンします
。
3. ドキュメント体温、血圧、心拍数、酸素にバイタル サインを監視するための場所のライン。カプノグラフィーによる換気を監視します
。
4. 左または右の肩甲骨上接着剤、使い捨て電気分散電極を配置します
。
5. 管理温めて一日リンガー ' 耳静脈カテーテルを通してメンテナンス流体として s。5-10 mL/kg の割合で水分を与える/h.
6. 胸部と頸部領域に強制空気地球温暖化装置を置き、最後の肋骨が隠れないようにします
。

4。左サイドの注入のため術野の無菌調製

注: このポイントから厳密な滅菌方法で進む

。

1. 、メーカーによると、0.7% ヨウ素 povacrylex と 74% イソプロピル アルコールの幅広いアプリケーションで腰椎始まるを覆う皮膚の準備 ' の指示。ガイド針を滅菌方法で配置後でできるためには、過去のマークの横突起正中線のコロナの平面に向かって消毒を拡張することによって投入の側にアプリケーションをえ
。
2. マーク腰椎棘突起に沿って正中線を越える予定切開部位の概要と長方形の方法で使い捨て手術用タオルを配置します
。
3. 適用接着剤抗菌切開手術のタオルの上に羽織るし、肌を露出しました。場所でカーテンをクランプし、術野をカーテンの端を拡張します
。
4. スリングの頭で術野と監視の技術者間の極に縦のドレープをセキュリティで保護します
。
5. セキュア ライン吸引と滅菌ドレープをクランプで術野内スネア。滅菌フィールドからチューブ、ワイヤの端を渡します
。

5。皮膚の切開し、骨膜下郭清

1. 正中線に沿って腰椎棘突起を触診し、3 連続する椎体のレベルを識別します
。
2. では、#15 メスを使用して、棘突起に直接後方切開ドレープを 8-12 cm 正中矢状切開を開きます。ガーゼ タンポナーデとモノポーラ電気を使用して止血を維持します
   。 注: これは傍脊柱筋群からの出血を制限されているため、切開は前方方向で先進的な正中線から逸脱していない注意する必要があります。棘突起の定期的な触診は、進歩を促進します。Weitlaner、Meyerding、または Gelpi のリトラクターを自己保持可能性がありますが配置され、解体を容易にするために必要に応じて位置を変更します。吸引は可視性を維持するために使用されます
。
3. は、皮下組織、胸腰部の筋膜に達するまでモノポーラ電気を使用して脂肪を解剖します。腰部の筋膜に深く棘突起を触診し、棘突起と棘上靭帯スパニングを公開する正中線に沿って筋膜をカットします
   。 注: 胸腰部の筋膜は、内側方向に横、斜めに起こして結合組織粒組織、腱の鞘として識別されます。この時点で、切開は郭清、フィールドの中央に配置されます両側棘突起と棘突起の 3 が完全に表示されるようにする優れたまたは下の方向に延ばされるかもしれない
。
4. は、棘上靱帯を介して 2 mm 深矢状切開を各棘突起の後方に配置するのに #15 のブレードを使用します。棘突起の後面の左 3 分の 1 に沿って各切開を配置します
。
5. 優しくリリース各株式会社に沿って、各レベルで棘上靱帯5 mm より自由なエレベーターを使用して ision
。
6. 骨膜下の平面を識別し、各棘突起の外側面に沿ってその平面内で解剖します
。
7. 骨膜下郭清を行うように穏やかな並行でそれぞれの棘突起でも郭清を実現します
。
8. 切開骨膜下郭清とのコンサートでモノポーラ電気を使用して棘間のスペースに沿って傍脊柱筋の添付ファイル
。
9. 各レベルのラミナを識別し、横 3 露出した脊椎を接続 2 椎間関節の外側の縁に到達して、パルスと呼ばれる関節間板の外側の縁に到達する骨膜下郭清を続ける間部
   。 注: 重量挙げ、前記、後根神経節が存在する椎間孔の後縁。時折、小静脈は板の後面にある孔から発生します。これらの静脈は、骨膜下の解剖時に破裂する傾向を持っています。バイポーラ電気手術と孔に適用される骨ワックスの組み合わせを使用して簡単に止血します
。

6。シングル レベル椎

1. の間に位置し、2 椎間関節の内側、両側板として椎弓切開術のターゲットを識別します
。
2. 尾椎間関節のポイントだけ連続する下関節突起の内側に、下の端まで板をトレースします
。
3. 薄層や中央運河の caudalmost エッジの間の遷移を触診して 5 mm より自由なエレベーターやキュレットを使用しています
   。 注: 硬膜嚢と脊髄の連絡先がこの前触診の楽器が無理に注意です。豚の脊髄腰椎 ¹⁸ を超えることに注意。触診を容易にするためにこの領域を覆う軟部組織の追加を削除する椎間板 rongeur を使用できます
。
4. 使用、2 mm をかむ癖、45 度 Kerrison rongeur 層状堆積方法で骨を抽出します。レベルだけ茎の尾表面に尾を上方に棘突起の基本に沿って骨を外し、横方向をその完全な範囲にします
。
5. 使用角度、骨骨の除去を支援する rongeurs です。ままに、椎弓切開術は主に完了までの場所で板に接続されていた下関節プロセス
。
6. では、椎間関節包だけで、下関節プロセスは自由に携帯電話と接続されていることを確認してください。#15 または #11 刃を使用してカプセルを切開します
。
7. 層状堆積方法で下関節プロセスを削除、隣接する関節突起をそのまま
   。 注: 椎弓切開術が完了すると、止血がバイポーラ電気手術で実行されます。モノポーラ電気は神経構造の近接のため使用されません。露出した骨からの出血のサイトに沿って骨ワックスを配置できるし、吸収性ゼラチン スポンジを使用して、軟部組織に近い止血を取得できます。Cottonoid は芯漿液と解剖から血液に有用なツールです
。

7。後根神経節の解剖

1. 避難区分的硬膜外脂肪表面から深い内側を開始し、横方向に進みます。6-10 フランス ・ フレージャー吸引ヒントとバイポーラ鉗子や吸引を使用して穏やかな郭清によって脂肪を削除します
   。 注: ルーペの拡大や解剖顕微鏡の使用は有用で安全に硬膜外脂肪を避難し、バイポーラ電気手術を用いた硬膜外静脈叢の細心の止血を達成するために必要な詳細レベルを提供します
。
2. は、superoinferior の方向は、皮膚切開の軸に平行に実行している正中線に沿って硬膜嚢を識別します。硬膜神経根の袖に上昇を与えるため硬膜嚢を見ることができるまで、硬膜嚢に沿って硬膜外脂肪を削除します
。
3. トレース硬膜袖横と下方に硬膜外脂肪避難によってそれが DRG の周りを拡大して見られるまで
   。 注: は、楕円形のオレンジ色への黄色 DRG を識別します。半ば腰椎 DRG、通常 4-6 mm のサイズで、横方向の内側で一番長い位置で直接下またはそのそれぞれの椎弓根の内側 2-3 mm。茎を優しく触診して神経の鈍い、直角フックを使用できます
。
4. 避難硬膜外脂肪横方向に, 過去の後根神経節、隣接する脊髄神経が見られるまで
   。 注: 痛覚が発生した場合それを修復 6-0 ナイロン縫合糸と滑らかなマイクロ針ドライバーを使用して単純な実行中のスティッチの水密の閉鎖で
。

8。DRG の注入

1. 22 g 脊髄針の使用 32 ゲージ対流強化配信 (CED) 針の弾道を導くため。皮膚と傍脊柱筋を通して 22 ゲージ ガイド針を穿刺します
   。 注: CED 針、組織、またとして知られている一括フロー、圧力勾配 ^{19 , 20} のための流体の対流を達成するために設計されています
。
2. DRG の長手方向軸線に近い解剖フィールドの傍脊柱の横壁から飛び出す針の先端で抑えたり、軌道に沿ってガイド針を目指します
。
3. 罰金を調整し針パス針の内腔に DRG の中央に揃えます
   。 注: DRG に連絡するガイド針を許可ことがない必要があります
。
4. 滅菌注射器に滅菌注入液を作成し、滅菌点滴チューブに注射器を接続します
。
5. は、CED 針にチューブを固定し、滅菌フィールドからシリンジを手します。プログラム可能なシリンジ ポンプに注射器を接続します
   。 注: チューブが不稔性と機動性を維持するために 5 フィートの長さを用意しています。また、それが重要ソリューションに導入される空気の泡がない
。
6. CED 針先から式が見られるまで、注入液を進める
。
7. は、ガイド針の内腔内の CED 針を置き、ガイド針の先端から現れるまで CED 針をゆっくりと進みます。DRG は針配置の間に穴を開けられないことを確認します
。
8. CED 先端の最終的な位置を決定するため、軌道の長軸に沿ってガイド針の位置の微調整をします
。
9. 針と深さとガイドと CED 針の配置が達成されれば連動針ハブを使用して一緒に CED ニードル ガイドをセキュリティで保護します
。
10. 射出装置のすべての接続がしっかりと、ガイド針、CED 針など、注入液と接続チューブが読み込まれることを確認します
。
11. のおおよその CED 針先と後根神経節に長い軸ガイド針を進める
。
12. CED 針先に DRG を穿刺します
。
13. は、DRG の三次元中心に CED 針の先端を沈めます <。br/> メモ: DRG は変数のサイズと形状の三次元構造、DRG 露出 DRG の真の中心で CED 針の先端を正確に配置するために完了しなければなりません。真の後根神経節の中心は 3 つの解剖学的な軸の交点に位置する、すなわち、前方、後方に横に内側と下軸に優れてします
。
14. 卒業率、3 つのステップのボリュームを使って CED による注入液の提供 100 μ L.
15. 2 で提供 4 μ μ L/分最初のステップ。2 番目の手順の 4 μ L/分で 8 μ L を実現します。3 番目と最後のステップの 8 μ L/分で 88 μ L を提供します
    。 注: 手順と圧平衡を許可する最後のステップ後 3 分一時停止を許可します
。
16. 最終注入ステップと滑らかな、穏やかな動きでその長い軸に沿って 3 分一時停止後に噴射装置を撤回します
    。 注: 無色が注入されたソリューションには濃度 0.1% 重量/体積注入液配布 ¹² の視覚的評価支援するために、溶液中の着色された染料が含まれます。また、重要な染料 4 '、研究デザイン注入液配布 ⁵ の組織学的評価が必要な場合、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) は 0.25 μ g/μ L の濃度でソリューションに含まれる
。

9。閉鎖

1. を動員し、フラッシュ、すなわち 骨片の破片のサイト閉鎖前に手術部位に温かい生理食塩水灌漑の適用 3 ラウンド。生理食塩水と破片を回復する吸引を使用します
   。 注: 灌漑は明確に残るとき、綿密な止血が保証されます。止血剤 (ゼラチン スポンジ) と cottonoid は、この時点で削除されます。さらに、全ての材料や道具は、閉鎖前に切開部位からクリアされていることを確認します
。
2. 閉鎖のため 3 層の手法を使用します
。
3. は、単純な, 中断, ロック ファッションで 0 縫合糸を使用して腰部の筋膜を縫合します。水密の閉鎖を達成するスティッチ 5 8 ミリメートルのすべてを配置します
。
4. 縫合糸のステッチでシンプルで中断、逆方法で 2-0 縫合糸を使用して皮下組織配置すべて十分な強度を達成するためには 5-8 mm です
。
5. 実行しているシンプルで 0 縫合糸を使って皮膚を閉じるかファッションを中断します
。
6. 行方不明シャープがないことを確認するため針カウンターを使用先決
7. 生理食塩水で皮膚を洗浄、乾燥肌、および粘着性の包帯ストリップを切開部に垂直に配置します
。
8. ストリップ、包帯の上にガーゼや最終的な接着剤の抗菌薬の添付場所切開ドレープ
。

10。術後動物ケア

1. Extubate、暖かい毛布でカバーし、回復には、動物を輸送します
。
2. 術後監視および生存の手術からの回復の標準機関の操作手順に従います。最低限、動物の観察 15 分毎意識、完全麻酔回復が達成されるまでは 1 時間、1 日 2 回のリターンまでその後
。
3. IM または経口カルプロフェン術後 0 日目から 5 日間、1 日 1 回 4 mg/kg で投与をすることによって術後疼痛管理を提供します。術後 2 日目に一度 0.18 mg/kg、与えられた SC ブプレノルフィン、SR を管理します
。
4. 術後 4 日目に 1 回 5 mg/kg で与えられた IM セフチオフルを与えることによって術後の消毒、管理します
。
5. 術後 5-7 日目に包帯を削除します。創傷治癒が完了したら、通常術後 10-14 日で抜糸します
。
6. 人道的標準制度運用手順に従って動物を安楽死させる研究のエンドポイントに到達します
。

結果

注入液の広がりの組織学的評価
注入液の後根神経節への配信成功は、広がる DAPI の組織学的評価によって決定されます。このテクニックは、DRG の三次元中心部に針の先端を位置決めを伴います。したがって、正常に配信は、針の先端を両方 (中央 DRG セクション) の近くと遠く (末梢 DRG セクション) を組織切片から汚す DAPI の程度を評価することによって決定されます。

ディスカッション

我々 は後根神経節を介して椎と健康的な大型動物種における intraganglionic 注入の手術手技の方法を説明しようとする具体的には、豚。齧歯類で、同様の方法は詳細な¹²をされており、DRG を^8,10やウイルスベクター ^6,7,9,12従来の薬?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large humane animal sling	Britz & Company	002539	Modified to include abdominal aperture
Adhesive patient return electrode - 9 inch	Medtronic	E7506	-
Ranger blood & fluid warming system	3M	24500	-
Lactated Ringer's fluid	Hospira	0409-7953-09	-
Force air warming device	3M	77500	-
Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol)	3M	8630	-
Sterile disposable surgical towels	Medline	MDT2168286	-
Ioban 2 incise drape	3M	6651EZSB	-
Disposable suction canister and tubing	Medline	DYND44703H	-
Button switch electrosurgical monopolar pencil	Medtronic	E2450H	-
Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch	Bovie	A826	-
#15 blade	Miltex	4-315	-
#11 blade	Miltex	4-311	-
4 x 4 surgical gauze	Dynarex	3262	-
Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch	Miltex	11-618	-
Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch	Sklar	42-2078	-
Gelpi self-retaining retractor, 7 inch	Sklar	60-6570	-
Freer elevator, 5 mm	Medline	MDS4641518F	-
Bone wax	Ethicon	W31G	-
Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm	Sklar	42-2852	-
Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm	Medline	MDS4052802	-
Leksell angled rongeur, 2 mm	Sklar	40-4097	-
Gelfoam, size 50	Pfizer	AZL32301	-
Cottonoid patty	Medtronic	8004007	-
Frazier suction tip, 6 Fr	Sklar	50-2006	-
Frazier suction tip, 10 Fr	Sklar	50-2010	-
Dandy blunt right angle nerve hook	Medline	MDS4005220	-
Nylon suture, 6-0	Ethicon	697G	-
Castroviejo smooth micro needle holder	Medline	MDG2428614	-
22 gauge Quinke point spinal needle	Halyard Health	18397	-
32 gauge CED needle with locking Luer hub	See comments	n/a	As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014).
Polyethylene tubing, 5 feet	Scientific Commodities	BB31695-PE/05	-
Monoject syringe, 3 mL	Kendall	SY15352	-
NanoJet syringe pump	Chemyx	10050	-
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	-
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	-
Bulb irrigation syringe	Medline	DYND20125	-
Fine-toothed Adson forceps	Medline	MDS1000212	-
Vicryl suture, 0	Ethicon	J603H	-
Vicryl suture, 2-0	Ethicon	J317H	-
Needle counter	Medline	NC20FBRGS	-
Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch	3M	R1547	-