潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

要約

プロトコルでは、通常の大気酸素濃度下での低酸素症が発生しているショウジョウバエ幼虫を識別する簡易測定法について説明します。このプロトコルでは、低迷や低成長などの重複する表現型を示す他の変異体と区別される低酸素の幼虫をことができます。

要約

動物の酸素の剥奪は、大気酸素の低水準への露出または酸素の流通を妨げる内部組織の損傷に起因できます。酸素感知ニューロンの異常な行動は通常酸素の存在下で酸素のような動作を誘導することが可能です。キイロショウジョウバエ、低酸素のレベルで開発の幼虫の段階で成長と低迷の動作の抑制の結果します。しかし、酸素欠乏のこれらの確立された症状は、ストレス反応や運動の成長を調整する多くの突然変異の表現型を持つかなり重なります。結果として、現在ありませんアッセイ i) 細胞低酸素症誘発突然変異または ii) 低酸素症のような行動異常の神経行動によるときを識別するために利用できます。

我々 は最近低酸素の内部検出に応えて通常酸素のレベルで発生するキイロショウジョウバエ幼虫の 2 つの特徴的な動作を識別されます。まず、すべての段階でこのような幼虫は、食品、食料源から遠く迷う頻繁に穴を掘るを避けます。第二に、柔らかい下地へのトンネル、放浪 3 齢段階で通常発生するが完全に廃止される場合は幼虫が低酸素。ここで説明アッセイは検出し、これらの行動を量的に設計されていますおよびこうして低外部酸素よりもむしろ内部損傷による低酸素症を検出する方法を提供します。寒天下地と酵母ペーストの中央プラグ アッセイ プレートは、幼虫の生活を通して動物をサポートする使用されます。位置と幼虫の状態は、3 番目の最初の齢から進行を毎日追跡されます。放浪フェーズ中に寒天の下地にトンネルの程度は、NIH ImageJ を用いた蛹化後量的に表わされます。アッセイ時低酸素血症は突然変異体の表現型のコンポーネントを決定する値の問題の遺伝子の行動の可能なサイトへの洞察を提供します。

概要

キイロショウジョウバエで利用できる分子遺伝学的ツールの高度な配列では、進化上保存された生物学的プロセスの研究のための貴重な生物です。酸素可用性レスポンスのキー分子進化を渡って節約される証明しているし、キイロショウジョウバエの先行研究は、シグナリング経路^{1,2、これらの普遍的なコンポーネントに洞察力を生成しています。 3,4,5,6}。

キイロショウジョウバエ幼虫における感覚神経機能解剖を目指す研究の一環として、通常の酸素レベル⁷で組織の低酸素によって活性化することが判明した 2 つの行動応答を識別されます。これらの食品に穴を掘るに失敗した 1 つは非常に関連・ ウィン グローブと o ' farrell ⁸によって報告された低酸素のレベルに応答しています。2 番目の現象は、後半 3 齢段階を徘徊中に柔らかい下地にトンネルに失敗がまだ識別されていない低酸素症-関連。我々 は両方これらの行動が低酸素症に属します -、いずれかによる組織の損傷や低酸素の取入口のレベルを確立、低酸素のレベルに野生型放浪幼虫を公開することでトンネル⁷下地も阻害することを決定しました。ここ幼虫孵化後すぐに観察で始まるこれら 2 つの低酸素誘発行動を量的に培った試金を記述します。

初期の幼虫の段階で低酸素応答が以前調査されていない、我々 の分析の重要なコンポーネントは、したがって幼虫の人生を通して分析を実行します。-遅い開発、貧困層の成長と運動の低迷-低酸素症の明らかな症状のほとんどは、多くの突然変異によって生成される幼虫表現型と重複します。しかし、我々 は低酸素症の 3 齢幼虫が⁷をトンネルする完全な失敗を示すことを発見しました。したがって、我々 は特定も幼虫がより成長と運動の面で当社の低酸素の幼虫よりも危険にさらさ、いくつかのトンネルを実行まだ低酸素幼虫決してトンネル⁷に対し。この試金の別の重要な要素は、低酸素血症が他のストレスや代謝の異常ではなく、多面の表現型の特定のセットのソースを確立する方法を提供することです。アッセイの例としてここで説明の気管の発現低下と幼虫の応答の特性での使用uninflatable、幼虫・ エアウェイズ⁹で機能する遺伝子。

この試金貧しい成長低迷の動作など幼虫形質の特性で従事している研究者に価値のあることを想定します。その結果、配布、使用、またはへの応答に影響を与える新しい遺伝子、体全体に酸素を識別できなかった。さらに、この試金の突然変異体のスクリーニング プロトコルを組み込む低酸素を作り出す突然変異の識別への直接ルートを提供します。この試金は、ここで説明されている低酸素状態における生得的な行動を引き出す回路の分析の貴重ななります。この型のニューラル ネットワーク解析は多くの現在の研究の焦点、キイロショウジョウバエ幼虫の単純な神経システムは自動化された動作を解剖するための貴重なシステム。幼虫酸素知覚に関与するニューロンが既に指定されて、低酸素による応答^10,11の完全な回路を定義する第一歩を提供します。さらにニューラル ネットワークのコンポーネントを区切るための明確な道筋は、GAL4 UAS システム¹²を介して神経ししてとの組み合わせで我々 の分析を使用しています。

プロトコル

1. 幼虫の準備

1. 実験目的の交差を設定、分析を開始する前に 2 つ以上の日と Wieschaus と Nusslein = フォルハルト¹³しかし 50 mL ポリプロピレンを使用してで定義されているレイアウト卵料理の組み合わせ (最小 20 女性と男性 10 例) を制御ビーカー、6.0 cm 使い捨てペトリ皿グレープ寒天を含むと酵母にまみれては、使用の直前に貼り付けます。必要になるまで室温で暗闇の中で卵置く料理にハエを保ちます。
2. ぶどう寒天レシピ-結合冷凍 100 mL 100% グレープ ジュース濃縮物、350 mL deioinized 水、5 mL 氷酢酸と 13 gショージョーバエ ・寒天 1 L ガラス ビーカーに。電子レンジで 1-2 分バースト、バースト、すべては寒天が溶けるまでの間攪拌します。数分間ソリューションを冷却し、95% エタノール 10 mL Nipagen (メチル p ヒドロキシ安息香酸) の 10% (w/v) を追加します。ミックス、使い捨て 6.0 cm シャーレにプレートあたり 7 mL のピペットをゲル 4 3 4 店のため室温で乾燥し許可ビニール袋に 0 C。
3. 酵母ペーストのレシピ-7 g の乾燥酵母、10 mL の脱イオン水、均一な整合性までヘラで混ぜます。
4. 卵実験を生成し、幼虫を制御するコレクションをタイムアウトしました。、新しい酵母を塗った、ブドウのプレートを使用して、朝の時間の間に暗闇の中で 4 時間室温で卵を収集します。これらの 4 時間コレクション プレートを取り外して、新鮮なプレート。25 で一晩 4 h コレクション プレートを孵化幼虫のほとんどが孵化したとき、次の日の午後まで⁰C。これらの最初の幼虫を収集し、それらを使用して実験を設定します。

2. アッセイ プレートを設定

1. アッセイ プレートの準備。アッセイの単一の実行、各 10 実験幼虫の 5 つのアッセイ プレートと 10 の制御の幼虫の 5 つのプレートを準備します。1.5 cm のコルクの穴あけ器を使用して、食品用の穴を作成する各板から寒天の中核を削除します。酵母ペースト (0.8 - 0.9 g) を入れ、穴と穴を充填マウンドを作るにヘラで優しくなでます。
2. 寒天培地プレート作製-2 L ガラス ビーカーで 16 gショージョーバエ ・寒天と 700 mL の脱イオン水を組み合わせて 5 分削除電子レンジからのマイクロ波し、溶液に不溶の寒天をもたらすガラス棒でかき混ぜます。10% (w/v) Nipagen 95% エタノール、ミックス、17.5 mL を追加し、30 s バーストのマイクロ波加熱後、すべて寒天が完全に溶解するまで攪拌を続行します。1 分または 2 つのクールな、ピペット 15 ml 10 cm プラスチック シャーレに。ゲル、蓋板をカバーし、数時間の常温乾燥または一晩させて寒天を許可します。18 ° C で密封されたポリ袋の店板
   1 に注意してください:余分な dessiccation のための板の表面に Nipagen 結晶の形成を避けるためには、準備は数日プレートを使用します。必要に応じて、数マイクロリットルに 95% アルコールのドロップすることによって結晶を再溶解できます。
   注 2:寒天培地のバッチが異なるゲル形成能を持つことができます。乾燥ゲル板は、タッチにしっかりと十分に弾力性のあるコルクの穴あけ器を使用して食品の穴 (上記参照) を作成する寒天のきれいで、そのまま円を削除できるようにする必要があります。
3. アッセイ プレートで幼虫を設定します。機械的圧力を使用して、プラスチック microspatula の先端を曲線と幼虫を拾うための「接着剤」を提供する酵母ペーストで先端を浸し。幼虫を個別にピックアップし、食品マウンドに近い寒天プレート上に配置。少なくとも 5 つのレプリケート プレート 10 幼虫の実験と遺伝子型のコントロールを準備します。完了したら、キャップしラベルを各プレート、プレート (蓋側を) を常温で暗い空間で設定 (当研究室では、22 の ° C)。

3. アッセイ プレート

1. 解剖顕微鏡の下で毎日プレートを確認し、食品の上にまたは寒天表面に幼虫の個体数を記録します。任意の目に見える死んでいる或いは瀕死の幼虫に注意してください。幼虫が 3 令に移動すると見られている寒天の下地へのトンネルに注意してください。蛹を形成し、蛹の異常に注意してください開始日の日付に注意してください。すべての幼虫が死亡または背地性まで毎日観察を続けます。
2. 針とブドウのプレートに転送をからかい曲げて、プレートから慎重に蛹を削除します。必要な場合は、蛹大人としてどのように多くの eclose を判断するための監視を継続します。

4 イメージング プレート試金の準備

1. 慎重を削除し、各プレートの中央の井戸からすべての酵母食品を破棄します。
2. 軽く水道水、各プレートの洪水し、ソフト アーティストのペイント ブラシを使用して慎重に寒天表面に追跡されている破片をこする。数回水を交換し、各プレートが完全にきれいになるまで、穏やかなブラッシングを続けます。プレートの脱イオン水で最終すすぎを与える、それらをキャップ、室温で乾燥するために一晩を残してください。
   注:寒天にトンネルは最も強い食品マウンドの周り (図 2 参照)。その結果、食品穴の縁は通常初期の 1.5 cm 直径を超えて拡張されます。さらに、この地域で働いていた寒天の脆弱性は、クリーニング中に穴の周囲から失われるトンネル寒天の小さな断片を引き起こす可能性があります。これらの問題を助けることができるゲルの寒天濃度を増加させるが、イメージ J 定量手順 (下記参照) で修正が可能。

5. トンネルの定量

1. プレートをイメージします。各プレートを黒の背景に明るい白い線のように寒天でトンネルを表示するように撮影のイメージを準備します。
   注:一般的にこのステップの DNA ゲルの画像に使用されるシステムを用いて (テーブルの材料および試薬を参照)。適当な画像を生成する画像処理システム、デジタル カメラや携帯電話のカメラなどの tiff ファイルを生成することができる代替を調節できます。
2. パブリック ドメイン プログラム NIH イメージ J を使用して、幼虫トンネル量的に表わします。Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html からプログラムをダウンロードします。プログラムの詳細については http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html を参照してください。
   注: その他のイメージング システムは、トンネルを量的にされる可能性があります。以下の手順は、NIH イメージ j. に適用します。
3. トンネル プレートの tiff ファイル イメージを開いたら全体寒天表面を表しますが、プレートのプラスチック製のエッジをトリミングを定量化するための領域を定義するのに楕円形ツールを使用します。
4. 黒い線として表示されているトンネルで、板の逆のイメージを生成する自動しきい値を適用します。トンネルではなく、寒天に損傷を表す黒の領域をカラー ピッカーと白にペイント ブラシ ツールを使用します。
5. [分析] プルダウン メニューの [セット スケール選択 |スケールの除去をクリックしてし、(分析) の下でまた測定の設定ウィンドウでは、エリア、制限のしきい値を確認します。
6. Cntrl キー + M ピクセルの黒の領域 (トンネル) を表示するキーを押します。
7. コピーと貼り付け各プレートのピクセル値は、定量分析を可能にする (Excel) などの表計算プログラムにです。
8. 中央の穴は、この地域で強烈なトンネルによる通常拡張されます。量的不足しているトンネルを「しきい値を制限する」を外してから、選択ツールを使用して中央の穴を定義します。Cntrl キー + M この領域のピクセル値を取得するキーを押します。この値から 1.5 cm の穴のピクセル値を減算し、5.6 のステップで取得したトンネルの値に違いを追加します。
9. いくつかのプレートの中央の穴がuntunneled寒天培地の穴に隣接する地域を含むトンネル寒天片をされない場合があります。これらのプレートの使用のための中央の穴を量的に表わすときカラー ピッカーとペイント ブラシのトンネル領域を定義し、定量から非トンネル化領域を除外する欠損領域全体に黒いバーを追加するためのツール。
   1 に注意してください:実験の幼虫は、任意のトンネリングを実行、この定量はトンネル プレートのセットとコントロールの統計的な比較の値と実験値の平均の計算を許可します。

結果

この試金の価値のデモンストレーションとして我々 は遺伝子の機能障害を伴う幼虫の潜在的な低酸素症を調査するそれを使用しているuninflatable (uif) 気管内。uif幼虫気管細胞の頂端表面上が強く表現されて大規模な膜貫通型タンパク質をエンコードします。Uifの変異体は、気管の機能不全⁹による組織低酸素症を示す可能性がある異常な現象が発生する以前注意されました。我々 は具体的には Gal4 UAS システムを使用して幼虫の気管にuif式を抑制しました。2 Gal4 線が用いられた: i)息(btl)-ii、萌芽期の開発の初めから気管で強く表現される Gal4)カット(ue)-Gal4 の小さい後方領域の式を開始します。胚発生の終わりに背側幹線気管幼生生命⁷を通してこの地域で強い表現を続けています。UA-uif RNAi ラインは、ウィーンのショウジョウバエ研究センター (VDRC ID #1050) から得られました。

上記のプロトコルに従って、5 は新たに孵化した初齢幼虫に対して設定された 4 つの十字の通りのプレートをレプリケートします。

実験 1
1) コントロール 1 -カット(ue)-Gal4 カントン-S (+) x
2) 実験 1 -カット(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi

実験 2
3) 制御 2 - btl-Gal4 カントン-S (+) x
4) 実験 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi

カット(ue) の動作-Gal4 > 実験 1 の UAS -uif RNAi 幼虫だったコントロールカット(ue) に匹敵する-Gal4 > + 穴を掘る、トンネリングと蛹化 (図 1 の生存の面で動物と図 2)。対照的に、気管システムから開発 (実験 2) の早い段階で全体にuif式のダウン規制は著しく異なる応答を作り出した。Btl-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫組織低酸素症-の両方の行動症状を表示されます食品穴を掘ると下地 (図 1 と図 2 のの幼虫の生命に後でトンネルの総不在を削減).実験の幼虫は著しく小さく、薄くよりコントロール (図 3) よりも低迷もあったし、アッセイのコースの間に高い死亡率を示した。前述したように、低成長、停滞、個体死で幼虫の低酸素症の症状が知られています。さらに、制御の幼虫は背地性後蛹化の試行に失敗し、残った実験の幼虫のほとんどは、長い幼虫として第三令しています。いくつかの幼虫は、最終的に pupating (図 1 a) なし死ぬ前に 15 日以上を生き残った。実験の幼虫のいくつかが蛹しようが、すべてのケースで異常な蛹が形成された実行可能な大人を生成しませんでした。

図 1。食品の穴居性と幼虫の開発の定量。
(A) 4 つの遺伝子型の食品古墳外ライブ幼虫の割合はここで学んだ。各遺伝子型の使用 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。Btlの 〜 70% を孵化後 3 日目-Gal4 > 食品外や他の 3 つの遺伝子型の寒天培地の表面に幼虫が検出されないに対し、食品の外 UAS uif RNAi 幼虫にあった。Btl-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫死ぬ日 4-20 ~ 15% とそれらがまだ生きているの間ゆっくりと孵化後 15 日間。X 軸に沿って黒い矢印と (B) では、3 つの他の遺伝子のすべての幼虫は背地性で日を示します。
(B) 死んだ幼虫 4 つの遺伝子型のための食糧の外部で参照の割合です。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。死んだbtl-Gal4 > UAS uifの RNAi の幼虫は、ほとんど死にかけていると時間をかけて蓄積食品外。蛹化する他の遺伝子型すべてが生き残るため
4 つの遺伝子型の蛹化率 (C) 生存を検討しました。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートの平均が表示されます。Btlの通常の蛹-Gal4 > UAS uif RNAi 遺伝子型が生産されませんでした。図中の誤差範囲を表す SEMs。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2。幼虫トンネリングの定量。
(A) すべての 4 つの遺伝子型のアッセイ プレートの例としては、定量をトンネリングの準備の後勉強しました。Btlのトンネリングの完全な欠如を注意してください-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫。アッセイ プレートが 10 cm ペトリ プレートです。
(B) 定量のトンネルは、4 つの遺伝子型画像 J から派生します。各遺伝子型の 5 アッセイ プレートのピクセルの平均値。トンネルにられなかったbtl-Gal4 > UAS uif RNAi 幼虫。誤差 = SEMs。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3。Btlの比較-Gal4 > UAS uif RNAi とbtl-Gal4 > + 幼虫
Btlのための同じような年齢 (孵化後 6 日目) の幼虫-Gal4 > UAS uif RNAi (A) およびbtl-Gal4 > + (B) 遺伝子型。赤い矢印は、背のトランク気管をポイントします。両方の幼虫は同じ倍率でイメージを作成します。スケール バー = 0.5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

我々 はここでキイロショウジョウバエ幼虫組織低酸素症を検出するために設計された簡易測定法を提案しました。診断は、幼虫の初期の人生と幼虫の人生の後半トンネリングの下地の不在で食品塚に減らされた穴を掘るに基づいています。食料源から早期の移行を引き起こすことができます幼虫密度、アッセイの 1 つの重要な側面は幼虫の数が少ないが大過剰の食品の存在下で試金されます。寒天プレートに殺菌剤メチル p ヒドロキシ安息香酸 (Nipagen) を含めることも分析中にカビの生育を防ぐために不可欠です。

我々 は、寒天がアッセイにおける変動性の源をすることができますを見つけます。通常、両親の異なるバッチまたは別の幼虫のコレクションからは、同じ遺伝子の幼虫はアッセイでの行動の比較的限られた変化を表示します。対照的に、寒天は別の日に作ったまたは寒天の別のバッチとトンネリングの違いをもたらすことができます。したがって、1 つの規定にはそのコントロールと実験の幼虫すべて試されるバッチと同じ準備から寒天を使用します。ゲル化力は、さまざまなメーカーから寒天培地または同じメーカーからも出荷によって異なります、ので最適なゲルを達成するためにここで使用される 2.2% から上向きに寒天濃度の調整をする必要があります。我々 は、野生型幼虫が 3% 寒天ゲルによって容易に穴を掘ることができますを発見しました。

この試金の値を示すために我々 は抑制機能を持つ幼虫における潜在的な組織の低酸素を調査するそれを使用しているuninflatable .気管内我々 の調査結果はこの遺伝子の気管の表現の損失が低酸素を作り出すことができること仮説の強いサポートを提供: btl-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫を示した食品と下地の間にトンネルの完全な欠如に穴を掘るに失敗3 齢。先行研究が他の遺伝子型の私たち、我々 は低酸素状態における損失食品穴を掘るの下地のトンネリングの損失およびbtlとして完全ではありません,-Gal4 > 同じように振舞った UASuifの RNAi の幼虫はここで学んだ。このアッセイの失敗したトンネル コンポーネントしたがって、低酸素症の最も強い表示を提供します。

ただし、 btl-Gal4 > uif RNAi 幼虫は示した行動特性をカット(ue) 低酸素血症の診断-Gal4 > UAS-uif RNAi これらの異常は見られませんでした。Btlとカット(ue) Gal4 ドライバーは、さまざまな段階で、幼虫の気管内の異なるパターンで表されます。Btl-Gal4 ドライバーは胚発生におけるその展開から始まって、幼虫の生活を通して継続気管システム全体で表されます。対照的に、カット(ue) から Gal4 式-Gal4 ドライバーのみ、気管の形態形成後萌芽期の生命の終わりに始まる、背側のトランクの主要な縦血管の極端な後部セクションに限られます気管システム。Gal4 行uifノックダウンは、したがってuif式を減らすことができないこの試金の測定動作をトリガーするために必要な低酸素症のいくつかのしきい値レベルを生成するのに十分十分に早く、あるいは広く。

事前調査は、3 齢幼虫 (10%) の酸素の低水準への露出が減らされた成長を示すことを発見し、pupariation ¹⁴の発症を遅延しました。Btl-Gal4 > ここで学んだ UAS -uif RNAi 幼虫が 3 齢に進んで、彼らの成長、蛹化率に及ぼす影響が顕著であったより: 彼らがかなり下のほとんどの脂肪組織を持つコントロールよりも小さい、表皮 (図 3) とマイナーな一部分 (~ 10%) だけは、pupariation を試みた。これらの違いは、 btlを提案する-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫は気管uifの打撃の全体の幼虫たちの生活を通して存在していたか、それはより生産ため低酸素症の大きい程度を経験しました。3 齢で重篤な酸素欠乏。気管でuif関数の損失可能性があります酸素輸送に与えるようには不明この時点で。Btlの気管-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫はキューティクル (図 3)、示すこと彼らは空気に含まれている、機能、流体のエントリに妥協点がない被害を受けたを通じて容易に表示されていた。したがって正式に可能です低酸素がむしろいくつか他の欠陥トンネルを阻害するuif機能の損失によって作成された気管損傷が発生しません。以前勉強した遺伝子型、トンネルに失敗は、後半 3 齢幼虫¹⁵LDH mRNA⁷のレベルが上昇、解糖作用、酸素の標準インジケーターに関連付けられていることを調べた。Btlのため低酸素症のため、最終確認-Gal4 > UASuifの RNAi の幼虫 (と幼虫が将来的に検討のこの試金の使用) の LDH mRNA のレベルまたは測定する市販インジケーターの使用を評価するために RT-PCR 法を伴うだろう細胞内の酸素のレベル (たとえばを参照してください¹⁶)。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification