Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt einen einfache Assay Drosophila Melanogaster Larven zu identifizieren, die Hypoxie unter normalen atmosphärischen Sauerstoffniveaus durchleben. Dieses Protokoll ermöglicht hypoxische Larven zu unterscheiden von anderen Mutanten, die überlappende Phänotypen wie Trägheit oder langsames Wachstum zeigen.

Zusammenfassung

Sauerstoffmangel bei Tieren führt, von Aussetzung zu den niedrigen atmosphärischen Sauerstoffniveaus oder interne Gewebeschäden, die mit Sauerstoff Verteilung stört. Es ist auch möglich, dass abweichendes Verhalten der Sauerstoff-abfragenneuronen Hypoxie-ähnliches Verhalten in Anwesenheit von normalen Sauerstoff-Niveaus führen könnte. Entwicklung bei niedrigen Sauerstoffgehalt ergibt in D. MelanogasterHemmung des Wachstums und der trägen Verhalten während der larvalen Phasen. Jedoch überschneiden sich diese etablierten Manifestationen der Sauerstoff Defizit erheblich mit der Phänotypen von vielen Mutationen, die Wachstum, Stressreaktionen oder Fortbewegung zu regulieren. Als Ergebnis gibt es derzeit keine Probe zur Verfügung, um (i) zelluläre Hypoxie induziert durch eine Mutation oder (Ii) Hypoxie-ähnliches Verhalten, wenn durch abnorme neuronalen Verhalten zu identifizieren.

Wir haben vor kurzem zwei charakteristische Verhaltensweisen in D. Melanogaster Larven identifiziert, die bei normalem Sauerstoffgehalt als Reaktion auf interne Erkennung von Hypoxie auftreten. Zunächst vermeiden solche Larven in allen Phasen, Wühlen in Essen, oft weit entfernt von einer Nahrungsquelle verirrt. Zweitens ist Tunneln in eine weiche Unterlage, die normalerweise auftritt, während die wandernden dritte Instar Stufe vollständig abgeschafft wenn Larven hypoxischen sind. Der hier beschriebene Test wurde entwickelt, um zu erkennen und diese Verhaltensweisen quantitate und damit eine Möglichkeit, Hypoxie induziert durch innere Schäden eher als geringe Sauerstoffversorgung zu erkennen. Assay-Platten mit einer Agar-Substrat und Zentralstecker Hefe Paste werden verwendet, um Tiere durch Larven Leben zu unterstützen. Die Positionen und den Status der Larven werden täglich verfolgt, wie sie vom ersten bis zum dritten Instar Vorgehen. Das Ausmaß der Tunnelbau in den Agar Substrat wandernde Phase ist nach der Verpuppung NIH ImageJ mit quantitated. Der Assay wird der Wert bei der Bestimmung, wenn Hypoxie ist eine Komponente eines mutierten Phänotyps und damit Einblick in die möglichen Standorte der Aktion des betreffenden Gens.

Einleitung

Die anspruchsvolle Auswahl an molekulare genetische Werkzeuge in D. Melanogaster machen es einen wertvollen Organismus für das Studium der evolutionär konservierte biologische Prozesse. Wichtigsten molekularen Reaktionen auf Sauerstoffverfügbarkeit erwiesen sich in der Evolution konserviert werden und frühere Studien in D. Melanogaster haben Einblicke in die universellen Komponenten dieser Signalisierung Wege ^{1,2erzeugt, 3,4,5,6}.

Im Rahmen einer Studie, die darauf abzielen, sezieren sensorischen Neuron Funktion in D. Melanogaster Larven identifizierten wir zwei Verhaltensreaktionen, die bewiesen durch Gewebehypoxie bei normalen Sauerstoff Niveaus ⁷aktiviert werden. Eine davon, die Nichtbeachtung bohren sich in Essen, ist die Reaktion auf niedrigen Sauerstoffgehalt von Wingrove und O' Farrell ⁸berichtet sehr verwandt. Das zweite Verhalten, Nichtbeachtung der tunnel in eine weiche Unterlage während der späten dritten Instar wandernde Phase, war nicht früher als im Zusammenhang mit Hypoxie identifiziert worden. Wir festgestellt, dass hemmt auszusetzen Wildtyp wandernden Larven zu niedrigen Sauerstoffgehalt auch Substrat Tunnelbau ⁷, damit, dass beide diese Verhaltensweisen Hypoxie entspringen-entweder durch Gewebeschäden oder sauerstoffarmen Aufnahmemengen induzierten zu etablieren. Hier beschreiben wir eine Probe, die wir entwickelt haben, um diese zwei Hypoxie-induzierten Verhaltensweisen, quantitate, die mit Beobachtungen sofort nach dem Larven schlüpfen beginnt.

Hypoxische Antworten in den frühen Larvenstadien wurden bisher nicht untersucht und daher die Durchführung einer Analyse Larven lebenslang ist ein wertvoller Bestandteil unserer Assay. Die meisten der offensichtlichen Manifestationen der Hypoxie – langsame Entwicklung, schlechtes Wachstum und Bewegungsorgane Trägheit – überschneiden sich mit Larven Phänotypen, die durch viele Mutationen produziert. Aber wir haben festgestellt, dass nur dritte Instar Larven mit Hypoxie einen völliger Fehlschlag ⁷Tunnel zeigen. So haben wir festgestellt, dass sogar Larven mehr in Bezug auf Wachstum und Fortbewegung als unsere hypoxischen Larven noch durchgeführt einigen Tunneln, während hypoxische Larven nie ⁷getunnelt. Ein weiterer wertvoller Bestandteil dieser Assay ist somit, dass es eine Möglichkeit bietet, wenn Hypoxie die Quelle für einen bestimmten Satz von pleiotrope Phänotypen, im Gegensatz zu einigen anderen Stress oder metabolische Störung ist zu etablieren. Eine Demonstration des Assays, hier beschreiben wir ihre Verwendung bei der Charakterisierung der Antworten der Larven mit reduzierten trachealen Ausdruck der uninflatable, ein Gen, das in die Larven Airways ⁹Funktionen.

Wir uns vorstellen, dass dieser Test für Forscher engagiert bei der Charakterisierung von Larven Phänotypen, die schlechtes Wachstum und trägen Verhalten von Wert sein wird. Infolgedessen wurden neue Gene, die die Verteilung, Nutzung oder Antworten auf, konnten Sauerstoff durch den Körper identifiziert werden. Darüber hinaus würde Einbeziehung dieser Assay in eine Mutante screening Protokoll bieten einen direkten Weg zur Identifizierung von Mutationen, die Hypoxie zu produzieren. Dieser Test wird auch bei der Analyse der Schaltung, die die Hypoxie-induzierten angeborene Verhaltensweisen, die hier beschriebenen entlockt wertvoll sein. Neuronales Netzwerkanalyse dieser Art ist ein Schwerpunkt der viel aktuelle Forschung und das einfache Nervensystem von D. Melanogaster Larve ist ein wertvolles System für sezieren, automatisierte Verhaltensweisen. Sensorische Neuronen Larven Sauerstoff Wahrnehmung beteiligt wurden bereits identifiziert und bietet einen ersten Schritt zur Definition die komplette Schaltung für eine Hypoxie-induzierten Reaktionen ^10,11. Mit unserem Test in Kombination mit selektiven neuronale Zuschlag über die GAL4-UAS-System-¹² ist eine klare Route für die Abgrenzung weiterer Komponenten des neuronalen Netzes.

Protokoll

1. Vorbereitung der Larven

1. Richten Sie mindestens zwei Tage vor Beginn der Assay Kreuze des gewünschten experimentelle ein und Steuern Sie-Kombinationen (je mindestens 20 Frauen und 10 Männer) in Ei-Lay Gerichte wie beschrieben durch Wieschaus und Nüsslein-Volhard ¹³ aber mit 50 mL Polypropylen Becher und 6,0 cm Einweg Petrischalen mit Trauben Agar und verschmiert mit Hefe Paste kurz vor Gebrauch. Halten Sie fliegen in Ei-Lay Speisen im Dunkeln bei Raumtemperatur bis benötigt.
2. Traube Agar Rezept-Saft kombinieren 100 mL gefroren 100 % Traubensaft Konzentrat, 350 mL Deioinized Wasser, 5 mL Glazial-Essigsäure und 13 g D. Melanogaster -Agar in eine 1 L Becherglas. Mikrowelle in 1-2 min platzt, rühren zwischen platzt, bis alle Agar aufgelöst ist. Kühlen Sie die Lösung für ein paar Minuten ab, dann fügen Sie 10 mL 10 % (w/V) des Nipagen (Methyl-p-Hydroxybenzoat) in 95 % igem Ethanol. Mix, dann Pipette 7 mL pro Platte in Einweg-6,0 cm Petrischalen lassen gel und bei Zimmertemperatur ca. 3-4 h. Store bei 4 0C in Plastiktüten.
3. Hefe paste Rezept-7 g getrocknete Hefe, 10 mL entionisiertem Wasser, mit einem Spatel mischen, bis gleichmäßige Konsistenz.
4. Zeitgesteuerte Eizellentnahmen generieren experimentelle und Larven zu kontrollieren. Mit neuer, Hefe verschmiert, Traube Platten, sammeln Sie Eiern bei Raumtemperatur für 4 h in der Dunkelheit in den Morgenstunden. Entfernen Sie diese 4 h Sammlung Platten und ersetzen Sie durch frische Platten. Inkubieren Sie die 4 h Sammlung Platten über Nacht bei 25 ⁰C bis zum Nachmittag des nächsten Tages, als die meisten der Larven geschlüpft haben werden. Sammeln Sie diese erste Instar Larven und verwenden sie, um das Experiment einzurichten.

2. Einrichten der Assay-Platten

1. Vorbereitung der Assay-Platten. Bereiten Sie für eine einzelne Ausführung des Tests fünf Assay Platten 10 experimentelle Larven und fünf Platten 10 Kontrolle Larven. Verwenden Sie ein 1,5 cm Kork Borer, um einen zentralen Kern des Nährbodens aus jeder Platte ein Loch für das Essen zu entfernen. Setzen Sie Hefe Paste (0,8 - 0,9 g) in das Loch und klopfen Sie vorsichtig mit einem Spatel zu einem Hügel füllen das Loch.
2. Agar-Platte-Vorbereitung – 700 mL entionisiertem Wasser mit 16 g D. Melanogaster Agar in eine 2 L Becherglas kombinieren und Mikrowelle für 5 min. Entfernen von Mikrowelle und rühren mit einem Glasstab unaufgelöste Agar in Lösung zu bringen. Fügen Sie 17,5 mL 10 % (w/V) Nipagen in 95 % Ethanol, Mischung, dann weiter Mikrowelle Heizung in 30 s platzt gefolgt von rühren, bis alle Agar vollständig gelöst ist. Cool für ein oder zwei Minuten, dann pipette 15 mL Aliquots in 10 cm Kunststoff Petrischalen. Agar-gel, Abdeckplatten mit Deckel und lassen sie trocknen bei Raumtemperatur für ein paar Stunden oder über Nacht zu ermöglichen. Shop-Platten in versiegelten Plastikbeuteln bei 18 ° C.
   Anmerkung 1: Um Bildung von Nipagen Kristallen auf der Oberfläche der Platten durch überschüssige Dessiccation zu vermeiden, verwenden Sie Platten innerhalb von ein paar Tagen der Vorbereitung. Bei Bedarf können Kristalle wieder aufgelöst werden, durch wenige Mikroliter von 95 % Alkohol auf sie fallen.
   Anmerkung 2: Chargen des Nährbodens können unterschiedliche gelbildenden Eigenschaften haben. Die trockene Gel-Platten sollte fest im Griff und ausreichend belastbar, dass ein sauberer und intakter Kreis des Nährbodens entfernt werden, wenn der Korken Borer mit Essen-Loch (siehe oben) erstellen.
3. Einrichten von Larven im Assay Platten. Verwenden Sie mechanischen Druck, um Kurve die Spitze der Kunststoff Microspatula und Tauchen Sie die Spitze in Hefe-Paste "Klebstoff" bieten für die Abholung der Larven. Nehmen Sie erste Instar Larven einzeln und legen Sie sie auf der Agarplatte in der Nähe von Essen-Hügel. Bereiten Sie mindestens fünf replizieren Platten aus 10 Larven für beide experimentelle und Kontrolle Genotypen. Abschluss, Kappe und beschriften Sie jeden Teller und legen Sie die Platten (Deckel Seite nach oben) in einem dunklen Raum bei Zimmertemperatur (Dies ist in unserem Labor 22 ° C).

3. Überwachung der Assay-Platten

1. Untersuchen Sie Platten täglich unter dem sezierenden Mikroskop und notieren Sie die Anzahl der Larven auf das Essen oder draußen auf der Agar-Oberfläche. Beachten Sie alle sichtbaren Toten oder sterbenden Larven. Beachten Sie, wann und ob Tunnelbau in den Agar Substrat als dritte Instar Larven bezogen angesehen wird. Hinweis Termine auf die Puppen beginnen sich zu bilden und beachten Sie etwaige pupal Anomalien. Tägliche Beobachtungen weiter, bis alle Larven gestorben oder pupated.
2. Entfernen Sie Puppen vorsichtig von der Platte mit einem gebogenen Nadel und Übertragung auf eine Traube Platte zu necken. Auf Wunsch weiterhin Puppen um festzustellen, wie viele Eclose als Erwachsene.

4. Vorbereitung Assay-Platten für die Bildgebung

1. Sorgfältig entfernen Sie und entsorgen Sie alle Hefe Essen aus dem zentralen Brunnen jeder Platte.
2. Sanft überfluten Sie jede Platte mit Leitungswasser zu und verwenden Sie eine weiche Künstler Pinsel vorsichtig reiben Sie Verschmutzungen, die auf die Agar-Oberfläche verfolgt worden. Ersetzen Sie das Wasser mehrmals und weiter sanft Bürsten, bis jede Platte vollständig sauber ist. Geben Platten ein abschließendes Spülen mit entionisiertem Wasser, verschließen sie und lassen bei Raumtemperatur über Nacht zu trocknen.
   Hinweis: Tunnelbau in den Agar ist am intensivsten um den Erdhügel Essen herum (siehe Abbildung 2). Infolgedessen ist der Rand der Öffnung Essen in der Regel jenseits der ersten 1,5 cm Durchmesser erweitert. Darüber hinaus verursachen die Zerbrechlichkeit des bearbeiteten Agar in dieser Region kleine Stücke von untertunnelten Agar bei der Reinigung von den Umfang des Lochs verloren zu gehen. Erhöhung der Gel-Agar-Konzentration könnte mit diesen Problemen helfen, aber während der Bild J Quantifizierung Schritte (siehe unten) sind Korrekturen möglich.

(5) Quantifizierung der Tunnelbau

1. Bild der Platten. Bereiten Sie ein Bild von jeder Platte genommen vor einem schwarzen Hintergrund um die Tunnel im Agar als helle weiße Linien zeigen.
   Hinweis: Wir verwenden ein System häufig verwendet, um DNA-Gele für diesen Schritt Bild (siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien). Alternative bildgebende Systeme, geeignet zur Erzeugung von TIFF-Dateien, wie digitale Kameras oder Handy-Kameras kann angepasst werden, um geeignete Bilder zu produzieren.
2. Verwenden Sie das Public Domain Programm NIH Image J zum quantitate Larven tunneling. Laden Sie das Programm von http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Weitere Informationen zum Programm finden Sie unter http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html.
   Hinweis: Andere bildgebende Systeme könnte verwendet werden, um quantitate Tunneln. Die folgenden Anweisungen gelten für NIH Image J.
3. Nach dem Öffnen einer TIFF-Datei Bild einer tunneling Platte, verwenden Sie Oval Tool, um einen Bereich für Quantifizierung zu definieren, stellt die gesamte Agar-Oberfläche aber ernten, die Kunststoff-Rand der Platte.
4. Gelten Sie die automatische Schwelle um ein umgekehrtes Bild der Platte, mit der Tunnel zeigt als schwarze Linien zu produzieren. Verwenden Sie die Farbauswahl und Pinsel Werkzeuge zu weiß, alle schwarzen Bereiche, die Schäden der Agar als Tunnel darstellen.
5. Unter die Analyze -Pull-Down-Menü, wählen Sie Set Maßstab | Klicken Sie auf die Waage zu entfernen und überprüfen Sie dann Set Messungen im Fenster "" (auch unter Analyze) Bereich und Limit, Schwelle.
6. Drücken Sie Taste Cntrl + M drücken, um den schwarzen Bereich (Tunnel) in Pixel.
7. Kopieren und Einfügen ist der Pixelwert für jede Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm (z.B. Excel), die eine Quantitative Analyse ermöglichen.
8. Das zentrale Loch wird in der Regel durch intensive Tunnelbau in dieser Region erweitert. Um quantitate den fehlenden Tunnelbau, deaktivieren Sie die Option "Schwellenwert begrenzen" und das Zauberstab-Werkzeug verwenden, um die zentrale Bohrung zu definieren. Drücken Sie die Taste Cntrl + M-Taste um den Pixelwert dieses Gebietes zu erhalten. Subtrahieren von diesem Wert den Pixelwert ein 1,5 cm Loch und den Unterschied zu den Tunnelbau im Schritt 5.6 ermittelten Wert hinzufügen.
9. Für einige Platten kann das zentrale Loch ein Stück getunnelte Agar fehlen, die eine Region angrenzend an das Loch untunneled Agar enthält. Wenn das zentrale Loch für den Einsatz dieser Platten Quantifizierung Pinsel die Farbauswahl und die Farbe Werkzeuge zum Hinzufügen eines schwarzen Balken über die fehlende Region definieren die getunnelte Region und Quantifizierung nicht getunnelt Bereich ausschließen.
   Anmerkung 1: Wenn die experimentellen Larven jede tunneling führen, erlaubt diese Quantifizierung Berechnung des Durchschnitts Tunnelbau für Sätze von Platten und statistischen Vergleich der Kontrolle und experimentellen Werte.

Ergebnisse

Als ein Beweis für den Wert des Assays habe wir es untersuchen mögliche Hypoxie in Larven mit eingeschränkter Funktion des Gens uninflatable (Uif) in die Tracheen. UIF-Datei kodiert ein großer transmembranen Protein, das stark auf die apikale Oberfläche der Larven trachealen Zellen exprimiert wird. Mutanten der Uif wurden bereits erwähnt, abweichendes Verhalten aufweisen, das Gewebehypoxie durch trachealen Fehlfunktion ⁹hinweisen. Wir unterdrückt speziell Uif Ausdruck in der Larven Luftröhre mit dem Gal4-UAS-System. Zwei Gal4-Linien wurden verwendet: i) atemlos (Btl)-Gal4, die stark in die Tracheen von Anfang ihrer Embryonalentwicklung und Ii zum Ausdruck kommt) (Ue) schneiden-Gal4, die Ausdruck in einer kleinen hinteren Region beginnt die dorsale Hauptstamm Tracheen am Ende der Embryogenese und starken Ausdruck in dieser Region das ganze Larven leben ⁷weiter. Ein FH -Uif RNAi-Linie wurde aus Wien-Drosophila-Forschungszentrum (VDRC ID #1050) gewonnen.

Wie im obigen Protokoll beschrieben, replizieren fünf Platten von frisch geschlüpften erste Instar, die Larven für jede der vier Kreuze wie folgt eingerichtet wurden.

Experiment 1
(1) Steuerung 1 - Schnitt(Ue)-Gal4 x Kanton-S (+)
(2) Experimental 1 - Schnitt(Ue)-Gal4 X UAS-Uif RNAi

Experiment 2
(3) Control 2 - Btl-Gal4 x Kanton-S (+)
(4) Experimental 2 - Btl-Gal4 X UAS-Uif RNAi

Das Verhalten des geschnitten(Ue)-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven von Experiment 1 war vergleichbar mit dem von der Steuerung geschnitten(Ue)-Gal4 > + Tiere im Hinblick auf die Wege des Maulwurfs, Tunnelbau und Überleben zur Verpuppung, (Abbildung 1 und Abbildung 2). Im Gegensatz dazu erzeugt Down-Regulierung Uif Ausdruck im gesamten Trachealkanüle System von früh in der Entwicklung (Experiment 2) deutlich unterschiedliche Antworten. Die Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven angezeigt beide Verhalten Manifestationen der Gewebehypoxie – reduziert Essen zu wühlen und eine völlige Abwesenheit von Substrat Tunnelbau später im Larvenstadium Leben (Abbildung 1 und Abbildung 2 ). Die experimentelle Larven waren auch deutlich kleiner, dünner und langsamer als Kontrollen (Abbildung 3) und zeigte eine hohe Todesrate im Laufe des Tests. Wie oben besprochen, sind verringertes Wachstum, Trägheit und organismal Tod Symptome der Larven Hypoxie bekannt. Darüber hinaus instar die meisten der experimentellen Larven zur Verpuppung versuchen gescheitert und blieb als Dritter Larven lange nach Kontrolle Larven pupated hatte. Einige Larven überlebten mehr als 15 Tage vor seinem Tod schließlich ohne Verpuppung (Abbildung 1A). Ein paar der experimentellen Larven verpuppen sich versucht aber in allen Fällen abnorme Puppen wurden gebildet, die nicht lebensfähigen Erwachsene generiert haben.

Abbildung 1. Quantifizierung der Nahrung grabende und larvale Entwicklung.
(A) Prozentsatz der live Larven außerhalb essen Hügel für die vier Genotypen hier studiert. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp verwendet werden angezeigt. Vom 3. Tag nach dem schlüpfen, ~ 70 % der Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven wurden außerhalb der Nahrung, während keine Larven außerhalb der Küche oder auf der Agar-Oberfläche für die anderen drei Genotypen erkannt wurden. Die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven sterben langsam 15 Tage nach dem Schlupf zwischen 4-20 Tage mit ~ 15 % von ihnen noch am Leben. Der schwarze Pfeil entlang der x-Achse gibt hier und in (B) den Tag, mit dem alle Larven der drei anderen Genotypen pupated hatte.
(B) Anteil der Toten Larven sichtbar außerhalb der Nahrung für die vier Genotypen. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp werden angezeigt. Toten Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven sammeln sich im Laufe der Zeit mit den meisten sterben außerhalb essen. Die anderen Genotypen, die alle überleben zur Verpuppung
(C) Prozentsatz Überleben zur Verpuppung für die vier Genotypen untersucht. Durchschnittswerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp werden angezeigt. Keine normalen Puppen von Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Genotyp produziert wurden. Fehlerindikatoren in Abbildung repräsentieren SEMs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2. Quantifizierung von Larven tunneling.
(A) Beispiele für die Assay-Platten für alle vier Genotypen studierte nach der Vorbereitung für den Tunnelbau Quantifizierung. Beachten Sie die völlige Fehlen von Tunneln für die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi Larven. Assay-Platten sind 10 cm Petri Platten.
(B) Quantifizierung tunneling abgeleitet von Bild J für die vier Genotypen. Durchschnittliche Pixelwerte für die fünf Assay-Platten für jede Genotyp. Keine Tunnelbau für die Btlbeobachtet wurde-Gal4 > FH Uif RNAi Larven. Fehlerbalken = SEMs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Vergleich der Btl-Gal4 > FH Uif RNAi und Btl-Gal4 > + Larven
Larven des ähnlichen Alters (6. Tag nach dem Schlupf) für die Btl-Gal4 > FH Uif RNAi (A) und Btl-Gal4 > + (B) Genotypen. Rote Pfeile zeigen auf die dorsale Stamm Tracheen. Beide Larven mit der gleichen Vergrößerung abgebildet. Maßstabsleiste = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Wir haben hier einen einfache Assay entwickelt, um Gewebehypoxie in D. Melanogaster Larven erkennen vorgestellt. Die Diagnose basiert auf verminderte wühlen in Essen Hügel im frühen Larvenstadium Leben und das Fehlen von Substrat Tunnelbau spät im Larvenstadium Leben. Larval Verdrängung kann dazu führen, dass vorzeitige Migration Weg eine Nahrungsquelle und damit einen kritischen Aspekt des Tests ist, dass eine kleine Anzahl von Larven in Anwesenheit einer großen überschüssige Lebensmittel untersucht werden. Aufnahme der Fungizid-Methyl-p-Hydroxyl-Benzoat (Nipagen) in die Agarplatten ist auch wichtig, damit keine Schimmelbildung während des Tests.

Wir finden, dass die Agarplatten eine Quelle der Variabilität in der Probe sein können. Larven des gleichen Genotyps, aus verschiedenen Chargen der Eltern oder aus verschiedenen Sammlungen der Larven, zeigen in der Regel relativ begrenzte Variation in ihrem Verhalten in der Probe. Im Gegensatz dazu Agarplatten an verschiedenen Tagen gemacht oder mit verschiedenen Chargen des Nährbodens Unterschiede im Tunnelbau ergeben können. Eine Bedingung ist daher, dass die Kontrolle und experimentelle Larven sollten alle mit getestet werden Agarplatten von der gleichen Charge-Vorbereitung. Agar von verschiedenen Herstellern oder auch Sendungen des gleichen Herstellers in ihrer gelierende Stärke variieren können, und so es kann erforderlich sein, das Anpassen der Agar-Konzentration nach oben aus dem 2,2 % hier verwendet, um eine optimale Gel zu erreichen. Wir haben festgestellt, dass Wildtyp Larven leicht über 3 % Agar-Gel graben können.

Um den Wert des Assays zu demonstrieren, haben wir es verwendet, um potenzielle Gewebehypoxie in Larven mit unterdrückte Funktion untersuchen uninflatable in die Tracheen. Unsere Ergebnisse liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Verlust der trachealen Expression dieses Gens Hypoxie produzieren kann: Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven bohren sich in Essen und völlige Fehlen von Substrat Tunnelbau bei Nichtbeachtung zeigte die dritte Instar. In unseren früheren Studien von anderen Genotypen, wir beobachtet, dass Hypoxie-induzierten Verlust der Nahrung wühlen nicht so vollständig wie Verlust von Substrat tunneling und Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven studierte hier ähnlich verhalten. Die fehlerhafte tunneling Komponente des Assays bietet daher den stärksten Hinweis auf Hypoxie.

Obwohl die Btl-Gal4 > Uif RNAi Larven zeigten Verhaltensmerkmale Diagnose der Hypoxie, die schneiden(Ue)-Gal4 > FH -Uif RNAi nicht diese Anomalien aufweisen. Die Btl und schneiden(Ue) Gal4 Treiber auf verschiedenen Stufen und in verschiedenen Mustern innerhalb der Larven Tracheen zum Ausdruck kommen. Die Btl-Gal4-Treiber wird im gesamten System der trachealen ausgehend von seiner Entwicklung in Embryogenese und Weiterbildung durch Larven Leben ausgedrückt. Im Gegensatz dazu Gal4 Ausdruck aus dem Schnitt(Ue)-Gal4-Treiber nur beginnt am Ende des embryonalen Lebens nach Morphogenese der Tracheen und beschränkt sich auf die extremen hinteren Abschnitte der dorsalen Stämme, die großen längs-Gefäße des die trachealen System. UIF Zuschlag mit dieser Gal4-Linie ist nicht deshalb zu reduzieren, Uif Ausdruck früh genug oder breit genug, um einige Schwellenwert der Hypoxie erforderlich, um die Verhaltensweisen auslösen zu produzieren in dieser Assay gemessen.

Eine frühere Studie ergab, dass Dritte Instar Larven ausgesetzt zu niedrigen Sauerstoffgehalt (10 %) verminderten Wachstum zeigen und verzögert Ausbruch der Pupariation ¹⁴. Die Btl-Gal4 > UAS -Uif RNAi Larven studierte hier voran, die dritte Instar, aber die Auswirkungen auf ihre Wachstums- und Verpuppung Preise waren stärker ausgeprägt: sie waren deutlich kleiner als Steuerelemente mit sehr wenig Fettgewebe unter der Epidermis (Abbildung 3) und nur ein kleiner Bruchteil (~ 10 %) versucht Pupariation. Diese Unterschiede deuten darauf hin das Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven erlebt einen höheren Grad der Hypoxie, Uif Zuschlag in die Tracheen ganze Larven lebenslang vorhanden war, oder weil es mehr produziert schweren Sauerstoffmangel in Dritte Instar. An dieser Stelle ist es unklar, wie Uif Funktionsverlust der Tracheen Sauerstofftransport verhindern könnte. Die Tracheen der Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven waren gut sichtbar durch die Kutikula (Abbildung 3), ein Indiz dafür, dass sie Luft enthalten und nicht, bis zu dem Punkt beschädigt wurden, dass flüssige Eintrag Funktion beeinträchtigt. Es ist daher formell möglich, dass der trachealen Schaden durch Funktionsverlust UIF-Datei erstellt nicht entlocken, Hypoxie, sondern eher einige defekt, der Tunnelbau hemmt. Für die Genotypen, die schon früher damit befasst haben wir festgestellt, dass die Nichtbeachtung der tunnel im späten dritten Instar Larven ¹⁵erhöhte Niveaus von LDH mRNA⁷, die kanonische Indikator für die Glykolyse und Hypoxie zugeordnet ist. So, endgültige Bestätigung der Hypoxie für Btl-Gal4 > FH -Uif RNAi Larven (und in Larven untersucht in Zukunft nutzen dieser Assay) würde bedeuten, RT-PCR um LDH mRNA-Niveaus oder Verwendung einer handelsüblichen Indikator zur Messung zu beurteilen intrazelluläre Sauerstoff-Niveaus (z. B. s. ¹⁶).

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dehydrated yeast
Frozen grape juice concentrate	Welch's		Available at most large supermarkets
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Drosophila agar	Apex Bioresearch Products	66-103
Methyl-para-hydroxybenzoate	Apex Bioresearch Products	20-658
EQUIPMENT
50 ml polypropylene beakers
6.0 cm disposable Petri dishes	Falcon	08757100B
10 cm disposable plastic Petri dishes	E+K Scientific	EK-24104
Plastic microspatulas	Corning Incorporated	3012
Bent teasing needle	Nasco	S08848MH
Dissecting microscope			Any microscope with 10-30X magnification