身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

要約

このプロトコルでは、体組成計と体組成とマウスの代謝パラメーターを特徴づける代謝動物監視システムの使用について説明します。高脂肪食摂取による肥満モデルは、これらの技術の適用のための例として使用されます。

要約

体組成 (脂肪や無駄のない質量) に変更の全身酸素消費量、エネルギー消費量や基板活用など代謝パラメーターと食品の摂取量、身体活動などの動作に重要な情報を提供することができますについて疾患の基になるメカニズムです。身体組成と肥満とその後の後遺症の発展に代謝の重要性を考えると、それは前臨床研究の設定でこれらのパラメーターの正確な措置をしなければなりません。過去数十年間の技術の進歩は、非侵襲的・縦断的齧歯動物モデルでこれらのメジャーを取得する可能にしました。その結果、これらのメタボリック対策が遺伝子操作 (たとえばノックアウト、トランスジェニック マウス、ウイルス ノックダウンまたは遺伝子の過剰発現)、実験的薬剤/化合物スクリーニング、食習慣の応答を評価するとき有用な証明します。行動や身体活動介入。ここで、身体組成と代謝パラメーター監視システム食事供給、高脂肪食飼育マウスの動物を使用して測定するために使用するプロトコルについて述べる。

概要

代謝は、通常の携帯、オルガン、そして全身の生理学の多くの側面を支えています。その結果、様々 な病態の設定、代謝に変化、基になる条件に直接貢献するかもしれないまたは病理学の副作用として悪影響可能性があります。伝統的に、代謝研究、エネルギー バランスに研究に集結してきた肥満とインスリン抵抗性、糖尿など関連する条件のフィールド耐糖能障害、心血管疾患、糖尿病。本研究はこのような状況を世界中の個人、社会、エスカレートの有病率を与えられた保証および経済的コストこれらの条件を与えます。ですから、予防戦略とターゲット肥満させる新しい治療法の開発は、世界中の研究所で継続的目標と重くこれらの研究に依存しているマウスの前臨床モデル。

マウスの重量を量る体重増加または損失の信頼性の評価を提供します、それは全体体組成 (体脂肪量除、無料の水と同様、毛や爪などの他のコンポーネント) を構成するさまざまなコンポーネントの内訳を提供しません。マウスが死亡した後、研究の完了時の脂肪パッドの重さ別の脂肪質のターミナルの正確な測定を提供しますが、単一の時間ポイントのデータを提供することができますのみ。結果として、それは時間、大幅増加の動物数、時間、およびコスト以上の肥満の開発を調査する複数のコホートを登録する必要があります。二重エネルギー x 線吸収測定法 (DEXA) の使用体脂肪と除脂肪組織内容を評価するためにアプローチでき縦断的データを取得する研究者です。ただし、プロシージャに必要な麻酔¹マウス、度重なる麻酔が影響の脂肪組織の蓄積または代謝調節の他の側面に影響を与えます。EchoMRI は、脂肪とスリムな大量、無料の水と総水量を測定する核磁気共鳴の relaxometry を利用しています。これは達成可能な期間、振幅、生成されたラジオ周波数描写と各組織の定量化の空間分布の違いで、異なる組織コンポーネント間のコントラストを作成するためです。この手法は、非侵襲、迅速で簡単な放射、または麻酔を必要としない、重要なは、検証されている積極的に化学分析²に対して有利です。

肥満と関連研究の重要な考慮事項は、エネルギーの釣り合いの式です。脂肪の蓄積は、純粋なエネルギー (エネルギー消費) を対 (食物摂取) のエネルギーよりも複雑ですが、重要な要素を測定することができるしています。毎日のエネルギーの支出は 4 種類の要素の合計: (1) 基礎エネルギー消費量 (安静代謝率);(2) 食品消費の熱効果によりエネルギー消費量(3) 体温調節のために必要なエネルギー(4) とエネルギーが身体活動に費やした。エネルギー消費量は、熱を生成するように、エネルギー消費量を評価するために (直接熱として知られている) 動物によって熱産生を測定に使用できます。またの測定に影響を与えたし、期限切れの O₂の濃度と直接 (間接測定方法として CO₂全身 O₂消費量と CO₂の生産の決定を可能にすることが出来、熱量測定) は熱発生量とエネルギー消費量の計算結果。食品の摂取量の増加やエネルギー消費量の減少は体重増加にマウスを素因し、これらのパラメーターの変化の観察可能性が高い肥満の特定モデルの作用機序の有用な情報を提供できます。興味の関連代謝パラメーターは呼吸交換比率 (RER) 基板/燃料の (すなわち、炭水化物または脂肪) は代謝とエネルギーを作り出すために生かされることを受けている割合を示すインジケーターです。その結果、身体活動レベル、O₂消費、RER、エネルギー消費量と食品摂取量 (エネルギー消費) の測定は生物の代謝プロファイルに関する幅広い知識を提供できます。このようなデータを収集する 1 つの方法は監視システム (アサリ)、エネルギー消費量を測定する間接熱量測定法に基づいており、身体活動量 (ビームを決定する機能が追加された包括的な実験動物を使用するには改) スケールを介して食物摂取量が測定室に組み込まれています。

このプロトコルでは、マウス、代謝の側面を測定する代謝動物監視システムにおける身体組成を評価する体組成計の使用のストレートな説明を提供します。これらの技術に関すると制限事項は、解析、解釈、およびデータ表現の方法についての提案と共に説明されます。

プロトコル

説明すべての実験は、アルフレッド ・医療研究教育地区動物倫理委員会 (AMREP AEC) によって承認された、マウスは、国民の厚生に関するガイドラインをオーストラリアの医学研究評議会 (NHMRC) に沿ったケアを提供されました。動物実験。動物がその所定の食事と水自由を投与し、12 h ライト ・ 12 h 暗い循環温度制御環境 (~ 21-22 ° C) で収容します。7 週 (c57bl/6 j 背景) の古い男性マウス飼育していずれかの正規通常食事ダイエット (コンテンツ 14.3 MJ/kg のエネルギー、炭水化物、脂肪 5%、19% のタンパク質から kJ の 76% から成る材料の表を参照してください) や高脂肪食摂取群の高脂肪ダイエット (HFD) (エネルギー内容 19 MJ/kg、炭水化物、43% の脂肪、21% のタンパク質、専門のフィードから kJ の 36% から成る) の 3 週間。代謝のモニタリング分析、食事療法の 3 週間後、アサリで行われていた間、体重と身体組成計測値 EchoMRI マシンを使用してが毎週行われました。

1. 体組成アナライザーの手順

注:最適に機能するには、EchoMRI 4-1 でこのプロトコルで使用する必要があります空気の温度が安定し、変動しない部屋の中で含まれています。理想的にはこれは常に監視する必要があります。電源をマシンと中断の移動も避けなければならない可能な場合。電源供給が中断されました、システムの再起動するが、それを再度使用する前にウォーム アップするマシンの少なくとも 2-3 h を許可します。始める前に、正しい個人用保護具を身に着けていることを確認します。

1. マウスをスキャンする前に体組成アナライザー コンピューターのシステム テストを実行します。これは (呼ばれるキャノーラ油システム テスト サンプル (コスト)) 計測器の精度をテストし、その精度のドリフトがなかったことを確認する校正標準を使用して含まれます。
   1. オープン システム ソフトウェア、システム テストのツールバー ボタンをクリックしてまたは、「alt キー + Y」を同時に押すこと。
   2. コンピューターでシステム テストが実施前にアラーム システム (図 1) のガントリー内 (この場合マウス固有のコスト) で正確な人件費が配置されていることを確認するを待ちます。これは確かにケースであることを確認、完了に数分を取るテストを続行する受け入れます。
2. システムのテストが渡されると、スキャンと転送を続行します。
   1. システム テストが失敗した場合は、システムのテストを繰り返します。
   2. マシンは引き続き (偏差が発生しましたを示す) 範囲外場合、校正状況を是正するために必要があります。この完了画面の指示をに従って、または購入時に指定されたユーザー マニュアルに記載されています。問題が解決しない場合チェック マニュアル³製造元のサポート チームに問題を報告や命令をさらに追求。
3. マシンの中に含まれているそれらを保つために小さな動物試料ホルダー (円柱) にマウスを配置します。これを行うには、ホルダーを水平方向に配置、マウスを拾う、まずシリンダー ヘッドの開口部にそれを挿入します。ゆっくりと慎重にマウスがシリンダーと分析のための準備の下にくるように縦位置にホルダーをもたらします。
4. 一度、ホルダー内で測定期間中にマウスの動きを制限する区切り記号を挿入します。状況によっては、非常にアクティブなマウスを指先で場所で区切り記号を保持する必要がある場合があります。
   注: は、ストレスを軽減する、初期分析の前に標本のホールダーの配置をマウスを理解します。赤着色された動物試料ホルダーの使用マウスを感じる彼らは暗闇の中で、潜在的なストレス反応を削減できます。
5. ソフトウェアでは、データを保存するフォルダー (フォルダーのツールバー) を選択してファイル名を作成します。
6. 必要に応じて、プライマリ蓄積スキャンの数を増やすことによって脂肪や無駄のないランダムなノイズの量を減らします。ソフトウェアを開始すると、プライマリの蓄積は、一般的な日常使用するための推奨される既定値に設定されます。これらのパラメーターを変更する特別な理由がない限り、既定の設定はユーザーに精度の必要なレベルを与えます。
7. 無料の飲料水と全体の水のためのデータを得ることに興味がないは、ノーと言うタブを選択して水ステージをオフします。そうと、スキャン時間を大幅に削減、スループットが向上します。
8. 「スキャンを開始」を選択するか、キーボードの f5 キーを押して、スキャンを開始します。動物についてのすべての関連データを入力 (例えば、動物 ID、ボディ固まりなど。)"ok"を押しますまたは約 1 分かかります、スキャンを開始する f5 キー。
9. データを取得すると、コンピューターからマウスを含む動物ホルダーをはずし、そのケージの裏では動物を配置します。すべての動物がスキャンされ、一度は、さらなる分析と照合順序のデータをエクスポートします。
10. 前に、と使用後、メーカーの指示に従って動物のホルダーを徹底的に掃除します。これらの者は、アクリル樹脂から構成されますと、イソプロピル アルコール、エチル ・ アルコールがホルダーの割れや破損の可能性が高まる、ホルダーの急速な悪化を起こすに避けてください。代わりに、いずれか食器洗浄温水ソリューションを使用または、さらに消毒が必要な場合 (1: 125 希釈) で f10 キーまたは他の消毒または洗浄スプレー (材料の表を参照) を使用してを拭き取ってください。

2. 代謝動物監視システム ・ プロシージャ

注: ~ 2 h、ウォーム アップと安定化が必要です。725 の ° C に熱されるジルコニア携帯を許可する切り替える必要がありますマシンがオフになっている場合また我々 は一般的に体組成計拘束ストレスで発生する問題を避けるために動物の監視システムを入力する日の前日にマウスを配置します。

1. 動物の監視システムに接続されているコンピューターがオン、制御プログラムを開くことを確認します。ポンプを開始する [ツール] メニューから「Oxymax ユーティリティ」オプションを選択します。
2. 適切な水で水のボトルを埋めるの重量を量るとマウスの健康の検査、食品を整理します。システムを食品の摂取量を計測する場合は、食品を粉砕することを検討してください。ホッパーにバネ付きのプラットフォームとヒントの食品を押すことによって食品のホッパーを記入してください。食品のホッパーと水のボトルは完全に完全に十分な食料と割り当てられた実験時間を最後に水があることを確認を確認します。
3. Drierite/乾燥剤; のステータスを確認それを青し、したがって乾燥、色の表示器を使用している場合が、ピンク/紫の場合それがあった重要な水分の吸光度とする交換か補充。
4. アンモニア トラップとソーダ石灰の状態をチェックし、必要な場合は、交換します。アンモニア トラップが接続されている場合、時に、2 つ目のトラップの色変化の兆しが表示されたら、2 つは最初の 1 つを置き換えます。CO₂オフセットの増加は、ソーダ石灰を交換する必要性を意味することも。
   注: 乾燥剤することができますオーブンで乾燥し、新鮮なたびを使用して、システムの製造元の推奨事項に従う私たちただし再利用します。
5. 部屋を組み立てます。これを行うには、するには、バランスで、食品のホッパーを配置挿入室床となり穿孔プラットフォーム上に商工会議所を配置します。慎重に商工会議所にマウスを置き、システムの前面のふたを添付しクリップをバックアップ、水ボトルの位置を決め、固定する前にセキュリティで保護されました。念のため、すべての室蓋、マウス、および水 (図 2 a-d) を再確認します。
   注: 検討されているマウスのサイズに応じて必要がありますマウスの食品が、彼らは送り装置の上に直接寝ることができる十分なスペースにアクセスできるように食品ホッパー上スペースの高さを調整します。
6. ガス センサーが各実験の前に校正することをお勧めします、システムを調整します。
   1. (0.5% CO₂20.5% O₂、バランス窒素) 知られている組成のガスを使用します。校正ガスのタンクをレギュレーターとホース経由でシステムに接続します。オンにし、タンクの出力圧力が 5-10 psi を読んでいることを確認します。
      注: 2 番目のタンク、ホースとレギュレータ「オフセット」ガスとして純粋な窒素の使用のため、いくつかシステムがあります。当社システムは代わりに CO₂自由な空気を生成するソーダ石灰を利用しています。
   2. O₂ ・ CO₂センサーを校正する手順に従います。[ツール] メニューから「校正」を選択し、O₂と CO₂の両方を順番に調整します。キャリブレーションする前に、その 1) サンプルとリファレンス フロー 0.400 LPM、2) ジルコニア O₂センサーの温度は 725 ° C (± 1 ° C)、3) サンプルとリファレンスの乾燥空気ポンプについていると 4) 校正用ガスが接続されオンになって。
   3. O₂センサーのキャリブレーションを行う際に、必要に応じて少し 1.0000 (± 0.0002) の O₂の比率値を達成するためにジルコニア酸素センサーの前面にオフセットのコントロールを調整します。これは、(コンピューター画面上でソフトウェア表示緑色のフォントで強調) 許容範囲内であることを確認するためです。
   4. 成功の O₂ ・ CO₂センサー較正後、オフに校正ガス シリンダー、レギュレータからホースを外します。キャリブレーション後、O₂参照空気 (大気) は 20.92 (± 00.02) をお読みください。校正が許容範囲外の場合を繰り返し、トラブル ・ シューティング ・製造元のガイドを参照してください。失敗は、詳細について製造元に問い合わせてください。
7. 実験のセットアップを続行します。実験メニューから「実験ファイルを開く」を選択します。適切なテンプレート (たとえばマウス) を選択します。実験メニューの「セットアップ」の下で記録する必要があります実験のパラメーターを定義(例えば、マウス ID 重量グループなど)使用しない、任意部屋選択を解除し保存する実験場所を選択します。
8. スケールは食品の摂取量を測定する場合 tared されたいるし、実験メニューで「実行」を選択してデータのキャプチャを開始を確認します。表現型、動物の隔離、およびシステムの使用状況に関する制度ガイドラインによって時間の長さが異なるため、データがキャプチャされます。
   注: 私たちの手で実験は日常的に実行 48 h の新しい環境やデータ解析のために使用される 2 番目の 24 時間に順化として使用される最初の 24 h。データ収集期間は、どのくらい調査官が単独で収容された動物の倫理の承認に依存して、彼らのマウスを維持する希望に基づいています。また、規定が存在する場合、マウスをシステムに配置されている前室で慣らされてし、接続されている可能性があります。12 室のシステムを使用しているとき、各商工会議所は 13 分に一度程度を測定します。
9. 定期的にチェックし、マウスは、動物の福祉を確保するためのシステムは、適切なデータが収集されているときに得られる結果を監視します。任意の問題は、この段階で特定し、修正することがあります。各マウスのシステムがすべての朝と夕方にチェックします。
10. 各マウスの酸素消費量、RER、およびエネルギー支出に関してリアルタイムで収集されたデータのデータ ファイル ページの上部に代謝] タブを確認します。一方、改をビームし、食品の消費データをそれぞれ活動と餌のタブに配置できます。周り「O₂で」を読んでチェック 20.90 20.94、"CO₂で"は 0.040 - 約 0.050、rer 線は 0.7 と 1 の間、流量 0.5 ・ 0.6 L/分で一定。
11. 定期的に食料と水へのアクセスがあるマウスとそれぞれを消費していることを確認します。彼らはないに穴あき床掘りなど苦痛の兆候を示していることを確認します。また、表示される結果を監視します。
12. 完了時に割り当てられた実験時間の実験メニューから「停止」を選択し、結果をエクスポート (CSV ファイルとしてファイル > エクスポート > 生成件名 CSV) 分析のため。
13. マウスの健康の検査、それらの重量を量る、自分のホームケージに戻ります。
    1. マウスは分離後お互いに向かって敵対的である、従って彼らは再び一緒に収容されて一度を監視します。
    2. ケージを分解、ホッパーから余分な食品を削除し、糞便、尿、生け簀から食べ物をヒントします。ボトルと薄めた T bac で sippers の水没、浸漬し、薄めた漂白剤溶液でその他のコンポーネントをきれい。きれいな水で洗い、空気に残して乾燥。
14. ソフトウェアと代謝パラメーターを計算します。ソフトウェアは、最終的なデータ出力⁴を提供する方程式の数を利用しています。
    酸素消費量と二酸化炭素産生の計算:酸素消費量: VO₂ (LPM)_{= V私}O_2i - V_oO_{2 o};二酸化炭素の生産: VCO₂ (LPM)_{V =o}CO_{2 o}V_私CO_2i
    場所: V は_私= 入力換気量 (LPM), V_o = 出力換気量 (LPM) O_2i = 入力、O_{2 o}に O₂濃度出力、CO_{2 i} O₂濃度を = = CO₂入力、CO_{2 o}濃度出力 CO₂濃度を =。
    RER の計算: RER = VCO₂ /VO₂。タンパク質の酸化は計測していません、したがって、RER は、これの調整されていないことに注意してください。
    エネルギー消費量の計算: エネルギー消費量: CV = 3.815 + 1.232* RER
    熱 (Kcal/h)) = CV * VO_2.場所: CV が熱量 (熱と酸素消費量の関係) であります。これは「の要素の科学の栄養」グラハム ラスクによって構成され、ラスク テーブルと呼ばれるから派生されます。

結果

図 3に結果は、EchoMRI を介して測定した高脂肪食に体組成のパラメターの典型的な変更を表示します。ベースラインで任意のパラメーターを測定 (図 3 a-f) の違いはありませんでした。ただし、高脂肪の餌のちょうど 1 週間後の体重、体脂肪量、HFD グループ (図 3 aBD

ディスカッション

重要なステップ

ここ記載されているプロトコルは、体組成を測定する方法とマウスの体組成計と代謝動物監視システムを使用しての様々 な代謝パラメーターの例を提供します。どちらの方法マシンが理想的には、作業していることを確認これを行うには、研究者は体組成計のシステム テストを実行し、新陳代謝のための知られているガスの組成を調整が不?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 in 1 system	EchoMRI	4 in 1 system	Whole body composition analyser
Canola oil test sample (COSTS)	EchoMRI	Mouse-specific (contact company for cat number)
Animal specimen holder	EchoMRI	103-E56100R
Delimiter	EchoMRI	600-E56100D
12 chamber system	Columbus Instruments	Custom built	Metabolic Caging System; includes control program
Drierite	Fisher Scientific	238988	CLAMS consumable
Calibration gas tank	Air Liquide	Mixed to order	Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen).
Normal chow diet	Specialty Feeds	Irradiated mouse and rat diet
High fat diet	Specialty Feeds	SF04-001
Balance	Mettler Toledo	PL202-S	Balance for weighing mice
TexQ Disinfectant spray	TexWipe
Hydrogen Peroxide cleaning solution	TexWipe	TX684