Composição corporal e análise de enjaulamento metabólico em ratos de alta gordura Fed

Resumo

Este protocolo descreve o uso de um analisador de composição do corpo e sistema de monitoramento animal metabólico para caracterizar a composição corporal e parâmetros metabólicos em camundongos. Um modelo de obesidade induzido pelo alto teor de gordura alimentar é usado como um exemplo para a aplicação dessas técnicas.

Resumo

Alterações de composição corporal (massa gorda ou magra), parâmetros metabólicos, tais como o consumo de oxigênio de todo o corpo, a despesa de energia e a utilização de substrato e comportamentos tais como a ingestão de alimentos e atividade física podem fornecer informações importantes a respeito os mecanismos subjacentes da doença. Dada a importância da composição corporal e metabolismo para o desenvolvimento da obesidade e suas sequelas subsequentes, é necessário tomar medidas precisas desses parâmetros no cenário de pesquisa pré-clínica. Os avanços da tecnologia sobre as passado poucas décadas tornaram possível derivar dessas medidas em modelos de roedores em uma forma não-invasiva e longitudinal. Por conseguinte, estas medidas metabólicas provaram ser úteis ao avaliar a resposta das manipulações genéticas (por exemplo nocaute ou transgénicos ratos, viral knock-down ou superexpressão de genes), triagem de drogas experimentais/composto e dietéticos, intervenções de atividade física ou comportamental. Aqui, descrevemos os protocolos usados para medir a composição corporal e parâmetros metabólicos usando um animal sistema em alimentados com comida e altos gordo dieta-alimentou ratos de monitoramento.

Introdução

Metabolismo sustenta muitos aspectos de celular normal, órgão e fisiologia de todo o corpo. Por conseguinte, no cenário de diversas patologias, alterações no metabolismo podem contribuir diretamente para a condição subjacente ou podem ser adversamente afetadas como um efeito colateral da patologia. Tradicionalmente, metabólica pesquisas e estudos em balanço energético concentraram no campo da obesidade e doenças relacionadas, tais como resistência à insulina, pré-diabetes, intolerância à glicose, diabetes e doenças cardiovasculares. Esta pesquisa se justifica, dada a crescente prevalência de tais condições em todo o mundo e o indivíduo, da sociedade, e os custos económicos dessas condições infligem. Como tal, o desenvolvimento de estratégias de prevenção e novas terapias para a obesidade do alvo é uma meta constante em laboratórios de pesquisa ao redor do mundo e modelos pré-clínicos do mouse são fortemente invocados para estes estudos.

Embora pesar ratos fornece uma avaliação confiável de ganho de peso ou perda, ele não fornece um colapso dos diferentes componentes que formam a composição do corpo inteiro (massa gorda, massa magra, água livre bem como outros componentes, como o pelo e as garras). A pesagem de almofadas de gordura após a conclusão dos estudos, uma vez que o mouse é falecido fornece uma medida exata de diferentes depósitos de gordura, mas só pode fornecer dados para um único momento. Como consequência, muitas vezes é necessário se inscrever várias coortes para investigar o desenvolvimento da obesidade ao longo do tempo, significativamente crescente número de animais, tempo e custos. A utilização da absortometria de raio-x de dupla energia (DEXA) fornece uma abordagem para avaliar o conteúdo de tecido gordo e magro corpo e permite que o pesquisador obter dados de uma forma longitudinal. No entanto, o procedimento exige ratos anestesiados¹, e episódios repetidos de anestesia podem impactar o acúmulo de tecido adiposo ou afetar outros aspectos da regulação metabólica. EchoMRI utiliza a ressonância magnética nuclear em materiais para medir a massa gorda e magra, a água livre e conteúdo total de água. Isto é possível devido à criação do contraste entre os componentes de diferentes tecidos, com diferenças na duração, amplitude e a distribuição espacial das frequências de rádio geradas permitindo a definição e quantificação de cada tipo de tecido. Esta técnica é vantajosa, pois é não-invasivo, rápido, simples, não requer anestesia ou radiação e, importante, foi positivamente validado contra análise química².

Uma consideração chave de obesidade e investigação com ele relacionada é a equação de equilíbrio de energia. Enquanto o acúmulo de gordura é mais complicado do que puramente energia (ingestão de alimentos) versus energia para fora (gasto de energia), são fatores vitais para ser capaz de medir. Gasto energético diário é o total de quatro diferentes componentes: (1) despesas de energia basal (taxa metabólica de repouso); (2) o gasto de energia devido ao efeito térmico do consumo de alimentos; (3) a energia necessária para a termorregulação; e (4) a energia gasta na atividade física. Como despesa de energia gera calor, medir a produção de calor por um animal (conhecido como calorimetria direta) pode ser usado para avaliar o gasto de energia. Alternativamente, medição de inspirado e expirado a concentrações de O₂ e CO₂, permitindo a determinação de todo o corpo O₂ consumo e produção de CO₂ , pode ser utilizado como uma forma de medir indiretamente (indireta Calorimetria) produção de calor e, consequentemente, calcular o gasto de energia. Um aumento na ingestão de alimentos ou uma diminuição no gasto de energia irá predispor ratos para ganho de peso e observações de mudanças nesses parâmetros podem fornecer informações úteis de prováveis mecanismos de ação em particulares modelos de obesidade. Um parâmetro metabólico relacionado de interesse é a relação de troca respiratória (RER), um indicador da proporção de substrato/combustível (ou seja, carboidrato ou gordura) está passando por metabolismo e sendo utilizado para produzir energia. Consequentemente, medição de ingestão de alimentos (energia consumida) combinado com níveis de atividade física, O consumo de₂ , RER e gasto de energia pode fornecer uma compreensão ampla do perfil metabólico do organismo. Um método para coletar tais dados é usar um animal de laboratório completo sistema (moluscos), que se baseia o método de calorimetria indireta para medir o gasto de energia e tem a capacidade adicional de determinar os níveis de atividade física (feixe de monitoramento quebras) e ingestão de alimentos através de escalas incorporado na câmara de medição.

Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição direta do uso de um analisador de composição do corpo para avaliar a composição corporal em ratos e um sistema de monitoramento animal metabólico para medir aspectos do metabolismo. Considerações e limitações para essas técnicas serão discutidas bem como sugeridos métodos de análise, interpretação e representação de dados.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram aprovados por Alfred médico pesquisa educação delegacia Animal Comitê de ética (AMREP AEC) e ratos foram fornecidos cuidado humano em consonância com a saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) da Austrália orientações sobre Experimentação animal. Os animais foram administrados seus prescrita dieta e água ad libitum e alojados em um ambiente de temperatura controlada (~ 21-22 ° C) com uma luz de 12 h e 12 h-escuro ciclo. Sete semanas velhos camundongos machos (sobre um fundo de C57Bl/6J) foram alimentados com dieta ou regular comida normal (teor de energia 14.3 MJ/kg, composto por 76% de kJ de carboidratos, 5% de gordura, proteína de 19%; ver tabela de materiais) ou para o grupo de alimentação de gordura alto, um alto teor de gordura da dieta ((HFD) 19 MJ/kg, consistindo de 36% do kJ de carboidrato, gordura de 43%, 21% de proteína, especialidade Feeds de conteúdo de energia) por 3 semanas. Peso corporal e medidas de composição do corpo usando uma máquina de EchoMRI foram feitas semanalmente, enquanto a análise de controlo metabólica ocorreu em um AMÊIJOAS após 3 semanas da dieta.

1. corpo composição Analyzer procedimento

Nota: Para funcionar optimamente, o EchoMRI 4 em 1 usado no presente protocolo deve estar contido dentro de uma sala onde a temperatura do ar é estável e não flutua. Idealmente isto deve ser constantemente monitorado. Movendo-se da máquina e interrupções para poder também deve ser evitado se possível. Se a alimentação foi interrompida e o sistema tem de ser reiniciado, permitir que pelo menos 2-3 h para a máquina para se aquecer antes de usá-lo novamente. Antes de começar, certifique-se de que você está usando equipamentos de proteção individual corretos.

1. Antes da digitalização ratos, realize um teste de sistema na máquina de analisador de composição do corpo. Isto envolve o uso de um padrão de calibração (referido como uma amostra de teste de sistema do óleo de canola (custos)) para testar a precisão do instrumento e para assegurar que não houve nenhum desvio em sua precisão.
   1. Abra o software de sistema, em seguida, clique no botão de barra de ferramentas de teste de sistema ou pressionando "Alt + Y" simultaneamente.
   2. Antes que o sistema de teste é realizado pelo computador, espere por um lembrete verificar que os custos corretos (no caso os custos específicos de rato) foi colocado dentro do pórtico do sistema ( Figura 1). Uma vez confirmado que este é realmente o caso, aceite-se para prosseguir com o teste, que levará alguns minutos para terminar.
2. Uma vez que passou-se o teste de sistema, continue em frente com a digitalização.
   1. Se o teste de sistema falhar, repita o teste de sistema.
   2. Se a máquina continua a estar fora de alcance (indicando que um desvio ocorreu), a calibração pode ser necessária rectificar a situação. Complete esta seguindo as instruções, ou conforme descrito no manual do usuário fornecido no momento da compra. Se o problema persistir, verifique o manual³ ou relatar o problema para a equipe de suporte do fabricante e buscar mais instrução.
3. Coloque os ratos em um suporte de amostra animal pequeno (cilindro longo) para contê-los enquanto na máquina. Para fazer isso, coloque o suporte na horizontal, pegar o mouse e inseri-lo no orifício da cabeça do cilindro, primeiro. Lentamente e com cuidado levar o titular na posição vertical para que o mouse está na parte inferior do cilindro e pronto para análise.
4. Uma vez dentro o titular, inserir um delimitador para limitar o movimento do mouse durante o período de medição. Em algumas circunstâncias, com ratos extremamente ativos, pode ser necessário prender o delimitador no lugar com a ponta do dedo.
   Nota: Familiarize os ratos com colocação nos suportes da amostra antes da sua análise inicial para reduzir o stress. O uso de um suporte de amostra animal colorido vermelho também pode reduzir a resposta de stress potencial, como os ratos se sentem que estão no escuro.
5. Dentro do software, selecione uma pasta (barra de ferramentas de pasta) para salvar os dados para e criar um nome de arquivo.
6. Se necessário, reduza a quantidade de ruído aleatório nas medições gordas e magras, aumentando o número de acumulações primárias da varredura. Uma vez que o software é iniciado, as acumulações primárias é definida como um valor padrão recomendado para o uso diário geral; a menos que haja um motivo específico para alterar estes parâmetros, as configurações padrão dará o nível de precisão necessário para os usuários.
7. Se não está interessado na obtenção de dados para a água livre e total de água, desliga fase de água, selecionando a guia para dizer não. Isso irá reduzir a duração da varredura significativamente e melhorar o throughput.
8. Inicie a digitalização, selecionando "Iniciar digitalização" ou pressionando F5 no teclado. Digite todos os dados relevantes sobre o animal (por exemplo, animal ID, massa corporal, etc.) e pressione "okey" ou F5 para iniciar a varredura, que terá cerca de 1 min.
9. Depois os dados foram obtidos, retire o suporte de animais contendo o mouse da máquina e coloque a animal de volta em sua jaula. Uma vez que todos os animais foram digitalizados, exporte os dados para posterior análise e agrupamento.
10. Antes e após a utilização, limpe cuidadosamente os detentores de animais conforme as instruções do fabricante. Como estes suportes são construídos a partir de plástico acrílico, álcool isopropílico e álcool etílico devem ser evitados como eles podem causar fissuração dos titulares e/ou deterioração rápida do titular, aumentando assim a probabilidade de ruptura. Em vez disso, use solução de água morna para lavar louça, ou, se desinfetante adicional for necessária, use F10 (a uma diluição de 1:125) ou outros sprays de limpeza ou desinfecção (ver Tabela de materiais) e depois limpe.

2. metabólica Animal procedimento do sistema de monitoramento

Nota: O sistema requer ~ 2 h para aquecer e estabilizar. Se a máquina foi desligada, deve ser ligado para permitir que a célula de zircônia para ser aquecido a 725 ° C. Também colocamos geralmente ratos no analisador de composição do corpo, um dia antes para entrar o animal, sistema de monitoramento para evitar quaisquer problemas com o esforço de contenção.

1. Verifique o computador ligado ao sistema de monitoramento animal está ligado e abrir o programa de controle. Selecione a opção "Utilitário de Oxymax" do menu ferramentas para iniciar as bombas.
2. Encher garrafas de água com água adequada, pesar e inspecionar a saúde dos ratos e organizar alimentos. Se a ingestão de alimentos de medição no sistema, considere pulverizando a comida. Encha os funis de alimentação pressionando-se a comida com mola de plataforma e ponta no funil. Certifique-se de que o funil de alimento e garrafa de água estão completamente cheios para garantir que haja bastante comida e água para durar o tempo experimental.
3. Verificar o status de drierite/dessecante; se usando um indicador de cor, deve ser azul e, por conseguinte, a seco, mas se é de rosa, teve absorbância significativa da umidade e deve ser substituído ou complementado.
4. Verifique o estado da armadilha de amoníaco e cal sodada e substitua se necessário. Se a armadilha de amônia está ligada dois de uma vez, quando a segunda armadilha exibe sinais de uma mudança de cor, substituir o primeiro. Um aumento no deslocamento de CO₂ também pode significar a necessidade de substituir a cal sodada.
   Nota: Dessecante pode ser secas em estufa e reutilizado, no entanto, seguimos as recomendações do fabricante do sistema para usar fresco cada vez.
5. Monte as câmaras. Para fazer isso, coloque o funil de alimentação sobre o equilíbrio e, em seguida, coloque a câmara no topo com a plataforma perfurada que torna-se o chão da câmara inserido. Cuidadosamente coloque o mouse na câmara e coloque a tampa do sistema com a parte frontal e clipes de volta e seguro antes da garrafa de água de posicionamento e fixação. Como precaução, verifique novamente todas as tampas de câmara, ratos e água (Fig. 2A-D).
   Nota: Dependendo do tamanho dos ratos examinada, pode ser necessário ajustar a altura dos espaços acima da tremonha de alimentação para que os ratos têm acesso a comida, mas não há espaço suficiente que podem dormir diretamente sobre o alimentador.
6. Como é recomendável que os sensores de gás ser calibrados antes de cada experimento, calibre o sistema.
   1. Use um gás de composição conhecida (0,5% CO₂, 20,5% O₂, balanço de nitrogênio). Se conecte o tanque de gás de calibração para o sistema através de um regulador e mangueira. Ligue e verifique a pressão de saída do tanque está lendo 5-10 libras por polegada quadrada.
      Nota: Alguns sistemas terão um segundo tanque, mangueira e regulador para o uso de nitrogênio puro como um gás "deslocamento". O sistema que operamos em vez disso utiliza cal sodada para gerar ar livre de CO₂ .
   2. Siga os procedimentos para calibrar tanto o O₂ e CO₂ sensores. Selecione "calibragem" do menu ferramentas e sequencialmente calibrar tanto o O₂ e CO₂. Antes de calibrar certifique-se de que a amostra 1) e fluxos de referência são 0,400 LPM, 2) a temperatura do sensor₂ O Zirconia é 725 ° C (± 1 ° C), 3) a amostra e a referência mais seco e bombas de ar são na, e 4) o gás de calibração é conectado e ligado.
   3. Se necessário, quando calibrar o sensor de₂ O, ligeiramente, ajuste o controle de deslocamento na frente do sensor de oxigênio de zircônia para atingir um valor de ratio O₂ de 1.0000 (± 0,0002). Isso é para garantir que está dentro de limites aceitáveis (realçados em verde fonte no software display na tela do computador).
   4. Após a bem sucedida O₂ e CO₂ calibração do sensor, desligar o cilindro de gás de calibração e desconecte a mangueira do regulador. Após a calibração, O₂ para o ar de referência (atmosférica) deve ler 20.92 (± 00.02). Se for fora da tolerância, repetir e referir-se a resolução de problemas guias do fabricante. Caso contrário, contate o fabricante para obter instruções adicionais.
7. Proceda com a montagem experimental. Selecione "abrir arquivo experimental" no menu do experimento. Selecione o modelo apropriado (por exemplo, rato). Em "setup" no menu do experimento defina os parâmetros da experiência que deve ser gravado (por exemplo, o ID de rato, peso, grupo, etc.) de-seleccionar qualquer câmaras não estiver em uso e selecione o local para a experiência de ser salvo.
8. Assegure as escalas têm sido taradas se medindo o consumo de comida e começam a captura de dados selecionando "executar" no menu do experimento. Dados são capturados para diferentes comprimentos de tempo dependendo do fenótipo, as orientações institucionais sobre o isolamento de animais e uso do sistema.
   Nota: Em nossas mãos, o experimento é rotineiramente executado por 48 h, com as primeiras 24 horas, usada como aclimatação para o novo ambiente e a segunda 24h usado para análise de dados. O período de coleta de dados é baseado em quanto tempo o investigador deseja manter seus mouses isoladamente alojados e dependente de aprovação ética animal. Como alternativa, se existirem disposições, ratos podem ser aclimatados nas câmaras antes de serem colocados no sistema e conectados. Cada câmara é medida aproximadamente uma vez a cada 13 min, quando um sistema de câmara de 12 está em uso.
9. Verifique regularmente e monitorar os resultados obtidos enquanto os ratos estão no sistema para garantir o bem-estar dos animal e que está sendo coletados dados apropriados. Qualquer questão pode ser capaz de ser identificado nesta fase e retificado. Checar cada mouse todas as manhãs e à noite quando eles estão no sistema.
10. Verifique na guia metabólica na parte superior da arquivo da página de dados para os dados coletados em tempo real para cada mouse no que diz respeito às despesas de consumo, RER e energia oxigênio. Entretanto, feixe quebras e dados de consumo alimentar podem ser localizados em guias de atividade e alimentação, respectivamente. Verifique se o "O₂ em" é leitura em torno de 20.90-20.94, o "CO₂ em" é em torno de 0.040 - 0.050, o RER é entre 0,7 e 1, e a taxa de fluxo é constante em 0,5 - 0,6 L/min.
11. Periodicamente, verifique que os ratos têm acesso à comida e água e que eles estão consumindo cada um. Garantir que eles não estão demonstrando sinais de aflição como cavar no piso perfurado. Além disso, acompanhar os resultados que são exibidos.
12. Após a conclusão do tempo alocado experimental, seleccione "stop" no menu do experimento e exportar os resultados (como arquivos. CSV, arquivo > Exportar > gerar assunto CSV) para análise.
13. Inspecionar a saúde dos ratos, pesá-los e depois voltar para suas gaiolas em casa.
    1. Ratos podem ser hostil para o outro após a separação, então monitorar uma vez que eles estão alojados juntos novamente.
    2. Desmontar as gaiolas, remover o excesso de comida de funis e dica qualquer fezes, urina e comida de gaiolas. Mergulhe garrafas e bebemos em solução diluída de T-bac, molho e limpe os outros componentes em solução de água sanitária diluída. Enxaguar com água limpa e deixar ao ar seco.
14. Calcule parâmetros metabólicos, com o software. O software utiliza um número de equações para fornecer a saída de dados final⁴.
    Para o cálculo da produção de consumo e de dióxido de carbono oxigênio: consumo de oxigênio: VO₂ (LPM)_{= Veu}O_2i - V_óO_2o; Produção de dióxido de carbono: VCO₂ (LPM)_{= Vo}CO_2o-V_euCO_2i
    Onde: V_eu = a taxa de entrada de ventilação (LPM), V_o = a taxa de ventilação de saída (LPM), Ó_2i = a concentração de O₂ na entrada, O_2o = a concentração de O₂ na saída, CO_2i = o CO₂ concentração na entrada, CO_2o = a concentração de CO₂ na saída.
    Para cálculo de RER: RER = VCO₂ / VO₂. Observe que a oxidação de proteínas não foi medida e consequentemente o RER não foi ajustado para esta.
    Para cálculo do gasto energético: gasto energético: CV = 3.815 + 1.232* RER
    Calor (Kcal/h)) = CV * VO_2. Onde: CV é o poder calorífico (a relação entre o calor e o volume de consumo de oxigênio). Isto é derivado de "The elementos da ciência da nutrição" referido como a tabela de Lusk, composta por Graham Lusk.

Resultados

Os resultados observados na Figura 3 exibem uma típica mudança nos parâmetros de composição do corpo com alta gordura alimentar, medida através de EchoMRI. No início do estudo não houve diferença em qualquer parâmetro medido (Figura 3A-F). No entanto, após apenas 1 semana de alta gordura alimentar, houve um aumento significativo no peso corporal, massa gorda e percentagem de massa gorda no grupo HFD (<...

Discussão

Passos críticos

Os protocolos descritos neste documento fornecem um exemplo de formas de composição corporal de medida e vários parâmetros metabólicos em ratos utilizando um analisador de composição do corpo e um animal metabólico, sistema de monitoramento. Para ambas as técnicas, é criticamente importante garantir que as máquinas estão trabalhando de forma otimizada, e para isso, é imperativo que o pesquisador realiza um teste de sistema para o analisador de com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 in 1 system	EchoMRI	4 in 1 system	Whole body composition analyser
Canola oil test sample (COSTS)	EchoMRI	Mouse-specific (contact company for cat number)
Animal specimen holder	EchoMRI	103-E56100R
Delimiter	EchoMRI	600-E56100D
12 chamber system	Columbus Instruments	Custom built	Metabolic Caging System; includes control program
Drierite	Fisher Scientific	238988	CLAMS consumable
Calibration gas tank	Air Liquide	Mixed to order	Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen).
Normal chow diet	Specialty Feeds	Irradiated mouse and rat diet
High fat diet	Specialty Feeds	SF04-001
Balance	Mettler Toledo	PL202-S	Balance for weighing mice
TexQ Disinfectant spray	TexWipe
Hydrogen Peroxide cleaning solution	TexWipe	TX684