Composition corporelle et l’analyse mise en cage métabolique in Mice Fed graisse haute

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation d’un analyseur de composition corporelle et le système de surveillance animale métabolique pour caractériser la composition corporelle et des paramètres métaboliques chez les souris. Un modèle de l’obésité induit par l’alimentation riche en graisses est utilisé à titre d’exemple pour l’application de ces techniques.

Résumé

Modifications de la composition corporelle (masse grasse ou maigre), les paramètres métaboliques tels que la consommation d’oxygène du corps entier, dépense énergétique et utilisation des substrats et des comportements tels que la prise alimentaire et l’activité physique peuvent fournir des informations importantes en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents de la maladie. Compte tenu de l’importance de la composition corporelle et du métabolisme au développement de l’obésité et ses séquelles ultérieures, il est nécessaire de faire des mesures précises de ces paramètres dans le cadre de la recherche préclinique. Avancées technologiques dans les dernières décennies ont permis de tirer ces mesures dans les modèles de rongeurs de façon non invasive et longitudinale. Par conséquent, ces mesures métaboliques se sont avérés utiles pour évaluer la réponse des manipulations génétiques (souris knock-out ou transgéniques par exemple, précipitation virale ou la surexpression des gènes), dépistage de drogue/composé expérimental et diététiques, interventions de l’activité physique ou comportemental. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour mesurer la composition corporelle et des paramètres métaboliques à l’aide d’un animal système dans nourris et hautes graisses régime alimentaire chez les souris nourries de surveillance.

Introduction

Métabolisme sous-tend les nombreux aspects de cellulaire normal, orgue et physiologie du corps entier. En conséquence, dans le cadre de diverses pathologies, altérations du métabolisme peuvent contribuer directement à l’affection sous-jacente ou pourraient être négativement touchées comme un effet secondaire de la pathologie. Traditionnellement, recherches métaboliques et les études sur l’équilibre énergétique ont été concentrées sur le domaine de l’obésité et les affections apparentées telles que résistance à l’insuline, pré-diabète, intolérance au glucose, les maladies cardiovasculaires et le diabète. Cette recherche est justifiée étant donné la prévalence croissante de ces conditions dans le monde entier et l’individu, société, et infligent des coûts économiques ces conditions. Par conséquent, l’élaboration de stratégies de prévention et de nouvelles thérapies pour objectif obésité est un objectif continu dans les laboratoires de recherche dans le monde entier et modèles murins précliniques sont fortement invoqués pour ces études.

Bien que pesant souris fournit une évaluation fiable du gain de poids ou de perte, il ne fournit pas une ventilation des différents composants qui composent la composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau gratuite ainsi autres composants tels que les fourrures et les griffes). Le pesage des coussinets adipeux à l’achèvement des études, une fois que la souris est décédée donne la mesure exacte des différents dépôts de graisse, mais ne peut fournir des données pour un moment unique. En conséquence, il est souvent nécessaire de s’inscrire plusieurs cohortes afin d’étudier l’évolution de l’obésité au temps, nettement plus en plus nombre d’animaux, temps et coûts. L’utilisation de bi-énergie absorptiométrie à rayons x (DEXA) fournit une approche pour évaluer le contenu du tissu gras et maigre corps et permet au chercheur d’obtenir des données de manière longitudinale. Toutefois, la procédure exige des souris d’être anesthésié¹et des épisodes répétés d’anesthésie peuvent avoir une incidence l’accumulation du tissu adipeux ou impact sur d’autres aspects de la régulation du métabolisme. EchoMRI utilise la résonance magnétique nucléaire relaxométrie pour mesurer la masse grasse et maigre, eau gratuite et teneur en eau totale. Cet objectif est réalisable en raison de la création du contraste entre les composants de tissus différents, avec des différences dans la durée, l’amplitude et la répartition spatiale des radiofréquences générés, permettant à la délimitation et la quantification de chaque type de tissu. Cette technique est avantageuse car il est non invasif, rapide, simple, ne nécessite aucune anesthésie ou rayonnement et, surtout, a été positivement validé contre l’analyse chimique².

Un facteur clé de l’obésité et la recherche connexe est l’équation de bilan énergétique. Accumulation de graisse est plus compliquée que purement énergétique (apport alimentaire) versus énergie (dépense énergétique), mais elles sont des facteurs essentiels pour pouvoir mesurer. Dépense énergétique quotidienne correspond au total des quatre éléments différents : (1) dépense énergétique basale (taux métabolique au repos) ; (2) la dépense d’énergie due à l’effet thermique de la consommation d’aliments ; (3) l’énergie nécessaire pour la thermorégulation ; et (4) l’énergie dépensée sur l’activité physique. Comme dépense d’énergie génère de la chaleur, la mesure de la production de chaleur par un animal (appelé calorimétrie directe) peut servir à évaluer la dépense énergétique. Sinon, mesure d’inspiré et expiré concentrations d’O₂ et CO₂, permettant la détermination de tout le corps O₂ consommation et de production de CO₂ , peut être utilisé comme un moyen de mesurer indirectement (indirect calorimétrie) production de chaleur et donc de calculer la dépense énergétique. Une augmentation de la prise alimentaire ou une baisse de la dépense énergétique sera prédisposent souris au gain de poids et les observations des variations de ces paramètres peuvent fournir des informations utiles des mécanismes susceptibles d’action dans des modèles particuliers de l’obésité. Un paramètre métabolique connexe d’intérêt est le ratio d’échanges gazeux (RER), un indicateur de la proportion de substrat/combustible (c.-à-d., hydrates de carbone ou de la graisse) qui subit le métabolisme et utilisées pour produire de l’énergie. Par conséquent, mesure de la prise alimentaire (énergie consommée) combinée avec des niveaux d’activité physique, la consommation de₂ O, RER et dépense énergétique peut fournir une compréhension globale du profil métabolique de l’organisme. Une méthode pour collecter des données consiste à utiliser un animal de laboratoire complet système (palourdes), qui est basé sur la méthode de la calorimétrie indirecte pour mesurer la dépense énergétique et dispose des capacités supplémentaires de la détermination des niveaux d’activité physique (faisceau de surveillance pauses) et la prise alimentaire par l’intermédiaire des échelles incorporées dans la chambre de mesure.

Dans ce protocole, nous fournissons une description simple de l’utilisation d’un analyseur de composition corporelle pour évaluer la composition corporelle chez des souris et un système de surveillance métabolique animal pour mesurer des aspects du métabolisme. Problèmes et limitations de ces techniques seront discutées ainsi que les méthodes proposées d’analyse, interprétation et représentation des données.

Protocole

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par l’Alfred Medical Research Education Precinct Animal Ethics Committee (AMREP AEC) et de souris ont reçu des soins compatissants en ligne avec la santé nationale et du Medical Research Council (NHMRC) des lignes directrices de l’Australie sur Expérimentation animale. Les animaux étaient administrés à leur régime alimentaire et l’eau prescrites ad libitum et abrité au sein d’un environnement contrôlé en température (~ 21-22 ° C) avec une lumière de 12 h et 12 h-dark cycle. Sept semaines vieilles souris mâles (sur un fond de C57Bl/6J) recevaient des diètes régulières chow normal (énergie contenu 14,3 MJ/kg, composé de 76 % de kJ de glucides, 5 % de matières grasses, 19 % de protéines ; voir Table des matières) ou pour le groupe de graisse-alimentation élevé, une haute teneur en graisses pour maigrir (HFD) () 19 MJ/kg, composé de 36 % de kJ d’hydrates de carbone, 43 % de matière grasse, protéine de 21 %, spécialité se nourrit du contenu énergétique) pendant 3 semaines. Poids et Mensurations de composition à l’aide d’une machine de EchoMRI ont été faites par semaine alors que l’analyse de contrôle métabolique a eu lieu dans un palourdes après 3 semaines de la diète.

1. corps Composition Analyzer procédure

Remarque : Pour fonctionner de façon optimale, la EchoMRI 4-en-1 utilisé dans le présent protocole doit être contenue dans une pièce où la température de l’air est stable et ne fluctue pas. Idéalement, cela doit être constamment surveillée. Déplacement de la machine et les interruptions au pouvoir doit également être évitée si possible. Si l’alimentation a été interrompue et le système doit être redémarré, laisser au moins 2-3 h pour la machine pour se réchauffer avant de l’utiliser. Avant de commencer, assurez-vous que vous portez des équipements de protection individuelle approprié.

1. Avant l’analyse de souris, effectuer un test du système sur la machine d’analyseur de composition de corps. Cela consiste à utiliser un étalon (dénommé une prise d’essai du système des huile canola (coûts)) pour tester la précision de l’instrument et à s’assurer qu’il n’y a eu aucune dérive dans l’exactitude des informations.
   1. Ouvrir le logiciel système, puis cliquez sur le bouton de barre d’outils de Test du système ou en appuyant simultanément sur « Alt + Y ».
   2. Avant l’essai de système est effectué par l’ordinateur, attendez un rappel vérifier que les coûts appropriés (dans ce cas les coûts propres à la souris) a été placé dans le portique du système ( Figure 1). Une fois confirmé que c’est effectivement le cas, accepter de procéder à l’essai, qui va prendre quelques minutes pour terminer.
2. Une fois que le système de test a été passé, continuer avec la numérisation.
   1. Si le test du système échoue, répétez le test du système.
   2. Si la machine continue à être hors de portée (en indiquant qu'un écart s’est produite), étalonnage peut être nécessaire de corriger la situation. Compléter cela en suivant les instructions ou tel que décrit dans le manuel d’utilisation fourni au moment de l’achat. Si le problème persiste, vérifiez le manuel³ ou signaler le problème au service clientèle du fabricant et demander des instructions supplémentaires.
3. Placez les souris dans un petit spécimen d’animaux-(long cylindre) pour garder leur contenu tandis que dans la machine. Pour ce faire, placez le support horizontal, soulevez la souris et l’insérer dans l’ouverture de la culasse tout d’abord. Lentement et soigneusement mettre le titulaire en position verticale, afin que la souris est au fond du cylindre et prêtes pour l’analyse.
4. Une fois dans le support, insérer un séparateur pour limiter le mouvement de la souris au cours de la période de mesure. Dans certaines circonstances, avec des souris extrêmement actifs, il peut être nécessaire maintenir le délimiteur en place avec le bout de votre doigt.
   NOTE : Familiariser les souris avec le placement dans le porte-spécimens avant leur analyse initiale pour réduire le stress. L’utilisation d’un porte-échantillon animal coloré rouge peut également réduire la réponse au stress potentiels, comme les souris se sentent qu’ils sont dans l’obscurité.
5. Dans le logiciel, sélectionnez un dossier (barre d’outils du dossier) pour enregistrer les données et créer un nom de fichier.
6. Si nécessaire, réduire la quantité de bruit aléatoire dans les mesures gras et maigres en augmentant le nombre des accumulations primaires du scan. Une fois que le logiciel est lancé, les accumulations primaires est définie sur une valeur par défaut recommandée pour un usage quotidien général ; sauf s’il existe une raison particulière de changer ces paramètres, les paramètres par défaut donnera le niveau de précision nécessaire aux utilisateurs.
7. Si ne pas intéressé à obtenir des données pour l’eau libre et total de l’eau, éteindre la scène de l’eau en sélectionnant l’onglet de dire non. Cela va réduire de façon significative la durée de scan et améliorer le débit.
8. Lancer le scan en sélectionnant « Démarrer le scan » ou en appuyant sur F5 sur le clavier. Entrez toutes les données pertinentes sur l’animal (p. ex., animal ID, masse corporelle, etc..) et appuyez sur « OK » ou sur F5 pour commencer l’analyse, ce qui prendra environ 1 min.
9. Après que les données ont été obtenues, retirez le support animal contenant la souris de l’ordinateur et placer le dos animal dans sa cage. Une fois que tous les animaux ont été balayés, exportez les données pour une analyse plus approfondie et la collation.
10. Avant et après utilisation, nettoyez à fond les détenteurs d’animaux conformément aux instructions du fabricant. Car ces supports sont construits en plastique acrylique, alcool isopropylique et alcool éthylique doivent être évités, car ils peuvent provoquer la fissuration des titulaires et/ou une détérioration rapide de l’actionnaire, ce qui augmente la probabilité de rupture. Au lieu de cela, utilisez la solution de l’eau chaude pour la vaisselle, ou, si autre désinfectant est requise, utilisez F10 (à une dilution de 1:125) ou autres sprays désinfectants ou nettoyage (voir Table des matières) et puis essuyer.

2. métabolisme Animal suivi procédure système

Remarque : Le système nécessite environ 2 h à réchauffer et à stabiliser. Si la machine est éteinte, il doit être allumé pour permettre à la cellule de zircone à chauffer à 725 ° C. Aussi, nous mettons généralement souris dans l’analyseur de composition corporelle un jour avant à l’entrée de l’animal, système de surveillance pour éviter tout problème avec le stress de contrainte.

1. S’assurer que l’ordinateur relié au système de surveillance animal est sous tension et ouvrez le programme de contrôle. Sélectionnez l’option « Utilitaire Oxymax » dans le menu outil pour initier les pompes.
2. Remplir les gourdes d’eau appropriée, peser et inspecter la santé des souris et d’organiser des aliments. Si la mesure prise alimentaire dans le système, envisager de poudrage de la nourriture. Remplissez les trémies d’alimentation en appuyant sur la nourriture de plate-forme et de la pointe à ressort dans la trémie. Veiller à ce que la trémie de la nourriture et la bouteille d’eau sont complètement remplis pour s’assurer qu’il y a suffisamment de nourriture et eau pour durer le temps imparti expérimental.
3. Vérifier l’état de la drierite/déshydratant ; Si vous utilisez un indicateur de couleur, il devrait être bleu et donc sécher, mais si c’est rose/mauve, il a eu absorption de l’humidité importante et doit être remplacé ou complété.
4. Vérifiez l’état du piège de l’ammoniaque et de la chaux sodée et remplacer si nécessaire. Si le piège de l’ammoniac est connecté deux à la fois, quand le deuxième piège affiche des signes d’un changement de couleur, remplacer la première. Une augmentation du CO₂ décalage peut aussi signifier qu’il fallait remplacer la chaux sodée.
   NOTE : Déshydratant peut être séché dans un four et réutilisé, cependant, nous suivons les recommandations du fabricant du système à utiliser fraîche chaque fois.
5. Assembler les chambres. Pour ce faire, placez la trémie d’alimentation sur la balance, puis placez la chambre sur le dessus avec la plate-forme perforée qui devient le plancher de la chambre insérée. Soigneusement placer la souris dans la chambre et fixez le couvercle du système avec le front et clips en arrière et fixer avant le positionnement de la bouteille d’eau et de fixation. Par précaution, revérifiez tous les couvercles de chambre, les souris et l’eau (Figure 2 a-D).
   Remarque : Selon la taille des souris en cours d’examen, il peut être nécessaire d’ajuster la hauteur des espaces au-dessus de la trémie d’alimentation afin que les souris aient accès à la nourriture, mais pas assez d’espace qu’ils peuvent dormir directement sur le dessus de la mangeoire.
6. Comme il est recommandé que les capteurs de gaz être étalonné avant chaque expérience, étalonner le système.
   1. Utiliser un gaz de composition connue (0,5 % de CO₂, 20,5 % O₂, équilibre d’azote). Relier le réservoir de gaz de calibrage au système via un régulateur et tuyau. Mettre en marche et s’assurer que la pression de sortie du réservoir est la lecture de 5 à 10 lb/po2.
      Remarque : Certains systèmes ont un deuxième réservoir, tuyau et le régulateur pour l’utilisation de l’azote pur comme un gaz « offset ». Le système que nous opérons utilise plutôt Sodo pour générer l’air libre de CO₂ .
   2. Suivez les procédures pour calibrer l’O₂ tant CO₂ capteurs. Sélectionnez « calibration » dans le menu Outils et séquentiellement calibrer l’O₂ tant de CO₂. Avant de calibrer, s’assurer que l’échantillon 1) et les flux de référence sont 0,400 l/min, 2) la température de la sonde zircone O₂ est 725 ° C (± 1 ° C), 3) se trouvent le sample et les référence plus sèches et les pompes à air, et 4) le gaz d’étalonnage et est allumé.
   3. Si nécessaire, lors de l’étalonnage de la sonde de₂ O, légèrement Réglez le décalage sur l’avant de la sonde zircone pour atteindre une valeur de ratio₂ O de 1.0000 (± 0,0002). Il s’agit d’assurer que c’est dans des limites acceptables (surlignés en vert polices dans l’affichage du logiciel sur l’écran de l’ordinateur).
   4. Après les succès d’O₂ et CO₂ calibrage de la sonde, éteignez la bouteille de gaz de calibrage et débranchez le tuyau du régulateur. Après calibration, O₂ pour l’air de référence (atmosphérique) devraient lire 20,92 (± 00.02). Si l’étalonnage est hors tolérance, répéter et se reporter aux guides du fabricant en cas de problème. A défaut, contactez le fabricant pour obtenir des instructions supplémentaires.
7. Poursuivez le montage expérimental. Sélectionnez « ouvrir fichier expérimental » dans le menu de l’expérience. Sélectionnez le modèle approprié (par exemple, la souris). En vertu de « setup » dans le menu expérience définissent les paramètres de l’expérience qui doivent être enregistrées (par exemple, ID de souris, poids, groupe, etc.) désélectionner les chambres ne l’utilisez pas et sélectionnez l’emplacement pour l’expérience d’être sauvés.
8. S’assurer que les échelles ont été tarés si la mesure de la prise alimentaire et commencent la saisie de données en sélectionnant « exécuter » dans le menu de l’expérience. Données sont capturées pour différentes durées selon le phénotype, les lignes directrices sur les animaux d’isolation et l’utilisation du système.
   NOTE : Dans nos mains, l’expérience est régulièrement exécutée pendant 48 h, avec les premières 24 h, utilisé comme une acclimatation à ce nouvel environnement et le deuxième 24h utilisé pour l’analyse des données. La période de collecte de données est basée sur combien de temps le chercheur souhaite conserver leurs souris individuellement logés et dépend de l’approbation de l’éthique animale. Par ailleurs, si des dispositions existent, souris peuvent être acclimatés dans les chambres avant d’être utilisés dans le système et connectées. Chaque chambre est mesurée à environ une fois toutes les 13 mn quand un système de 12 chambres est en cours d’utilisation.
9. Vérifiez régulièrement et surveiller les résultats qui sont obtenus pendant que les souris sont dans le système pour assurer le bien-être des animaux et que nous recueillons des données appropriées. Toute question peut être en mesure d’identifier à ce stade et rectifiées. Vérifier sur chaque souris chaque matin et le soir quand ils sont dans le système.
10. Vérifiez l’onglet métabolique en haut de la page de fichier de données pour les données collectées en temps réel pour chaque souris en ce qui concerne les dépenses de consommation, RER et l’énergie de l’oxygène. Pendant ce temps, des rondins pauses et données de consommation alimentaire peuvent se trouver dans les onglets de l’activité et l’alimentation, respectivement. Vérifiez que le « O₂ dans » lit autour de 20.90-20,94, le « CO₂ dans » avoisine 0,040 - 0,050, le RER est comprise entre 0,7 et 1, et le débit d’eau est constante à 0,5 - 0,6 L/min.
11. À intervalles réguliers, vérifier que les souris aient accès à la nourriture et l’eau et qu’ils consomment chacun. S’assurer qu’ils ne manifestent pas des signes de détresse comme creuser dans le plancher perforé. En outre, suivre les résultats qui sont affichent.
12. À la fin du temps alloué expérimentale, sélectionnez « stop » dans le menu de l’expérience et les résultats à l’exportation (sous forme de fichiers CSV, fichier > exportation > générer sujet CSV) pour analyse.
13. Inspecter la santé des souris, pesez-les et puis retourner à leurs domicile cages.
    1. Souris peut être hostile envers l’autre après la séparation, donc surveiller une fois qu’ils sont logés ensemble à nouveau.
    2. Démonter les cages, retirer les excès de nourriture de trémies et astuce sur les fèces, l’urine et denrées alimentaires provenant des cages. Submerger les bouteilles et sippers en solution diluée de T-bac, tremper et nettoyer les autres composants de la solution eau de Javel diluée. Rincer à l’eau et laisser à l’air sec.
14. Calculer les paramètres métaboliques avec le logiciel. Le logiciel utilise un certain nombre d’équations pour fournir les données finales sortie⁴.
    Pour le calcul de la production de dioxyde de carbone et la consommation d’oxygène : la consommation d’oxygène: VO₂ (l/min)_{= Vj’ai}O_2i - V_oO_2o; Production de gaz carbonique: VCO₂ (l/min)_{= Vo}CO_2o-V_j’aiCO_2i
    Où : V_i = le taux de ventilation d’entrée (LPM), V_o = le débit de ventilation (LPM), O_2i = O₂ concentration à l’entrée, O_2o = la concentration de₂ O en sortie, CO_2i = la CO₂ concentration à l’entrée, CO_2o = la concentration de CO₂ à la sortie.
    Pour le calcul du RER : RER = VCO₂ / VO₂. Notez que l’oxydation des protéines n’a pas été mesurée et donc le RER n’a pas ajusté pour cela.
    Pour le calcul de la dépense énergétique : dépense énergétique: CV = 3.815 + 1.232* RER
    Chaleur (Kcal/h)) = CV * VO_2. Où : Le CV est le pouvoir calorifique (la relation entre la chaleur et le volume de consommation d’oxygène). Il est dérivé de « L’éléments de la Science de la Nutrition » dénommé la Lusk Table, composé par Graham Lusk.

Résultats

Les résultats observés dans la Figure 3 affichent un changement typique dans les paramètres de composition du corps lors d’alimentation haute graisse, telle que mesurée par l’intermédiaire de EchoMRI. Au départ, il n’y avait aucun différence dans n’importe quel paramètre mesuré (Figure 3 a-F). Cependant, après seulement une semaine d’alimentation riche en graisses, il y avait une augmentation ...

Discussion

Étapes critiques

Les protocoles décrits ci-après fournissent un exemple de façons de composition corporelle mesure et divers paramètres métaboliques chez la souris à l’aide d’un analyseur de composition corporelle et un animal métabolique, système de surveillance. Pour les deux techniques, il est extrêmement important de s’assurer que les machines fonctionnent de façon optimale, et pour ce faire, il est impératif que le chercheur effectue un test du système ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 in 1 system	EchoMRI	4 in 1 system	Whole body composition analyser
Canola oil test sample (COSTS)	EchoMRI	Mouse-specific (contact company for cat number)
Animal specimen holder	EchoMRI	103-E56100R
Delimiter	EchoMRI	600-E56100D
12 chamber system	Columbus Instruments	Custom built	Metabolic Caging System; includes control program
Drierite	Fisher Scientific	238988	CLAMS consumable
Calibration gas tank	Air Liquide	Mixed to order	Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen).
Normal chow diet	Specialty Feeds	Irradiated mouse and rat diet
High fat diet	Specialty Feeds	SF04-001
Balance	Mettler Toledo	PL202-S	Balance for weighing mice
TexQ Disinfectant spray	TexWipe
Hydrogen Peroxide cleaning solution	TexWipe	TX684