糖尿病マウスの慢性創傷を作成するためのプロトコル

要約

慢性創傷は、全厚の皮下創傷の後に高レベルの酸化ストレスを誘発することによって、糖尿病マウスモデルの急性創傷から発症する。創傷は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの阻害剤で治療され、皮膚微生物叢に存在する細菌による治癒およびバイオフィルムの発達を損なう結果生じる。

要約

慢性創傷は、適切な治癒に関与する1つ以上の複雑な細胞および分子プロセスにおける不完全な調節の結果として発症する。彼らは約6.5Mの人々に影響を与え、米国だけで〜$40B/年の費用がかかります。ヒトにおける慢性創傷の発症方法を理解するために多大な努力がなされているが、根本的な疑問は未解決のままである。最近では、ヒト慢性創傷の多くの特徴を持つ糖尿病性慢性創傷の新しいマウスモデルを開発した。db/--マウスを用いて、創傷直後に創傷組織に高レベルの酸化ストレス(OS)を誘導し、抗酸化酵素に特異的な阻害剤を用いた1回限りの治療を用いて、慢性創傷を生成することができる。グルタチオンペルオキシダーゼ。これらの創傷は、高レベルのOSを持ち、バイオフィルムを自然に開発し、治療後20日以内に完全に慢性になり、60日以上開いたままにすることができます。この新しいモデルは、ヒトにおける糖尿病性慢性創傷の多くの特徴を有し、したがって、創傷が慢性になる方法の基本的な理解を進めることに大きく貢献できる。これは、ヒトの慢性創傷が患者に重大な痛みや苦痛を引き起こし、未解決の場合は切断をもたらすため、大きなブレークスルーです。さらに、これらの創傷は治療に非常に高価で時間がかかり、患者の個人所得の大幅な損失につながります。私たちの慢性創傷モデルの使用を通じて研究のこの分野の進歩は、この衰弱状態の下で苦しむ何百万人もの医療を大幅に改善することができます。このプロトコルでは、急性創傷を慢性化させる手順を詳細に説明しますが、これはこれまで行われていません。

概要

創傷治癒は、時間的および空間的に調節される複雑な細胞および分子プロセスを含み、免疫応答および血管に限定されない多くの異なる細胞タイプを含む多くの異なる細胞タイプを含む連続的かつ重なり合う段階で組織されるシステム¹.皮膚が傷害を持続した直後に、因子および血液細胞は創傷部位に凝集し、凝固カスケードを開始して血栓を形成する。恒常性が達成された後、血管は、異物の創傷床をクリアし、プロテオ分解酵素を分泌するために多形態性細胞を化学的に引き付ける創傷部位酸素、栄養素、酵素、抗体および化学的要因に入るように拡張する。^2.活性化血小板は、傷部のケラチノサイトを刺激するために様々な成長因子を分泌し、傷部を再上皮化させる。創傷部位に募集された単球は、食細胞細胞細菌と死んだ好中球を循環させるマクロファージに分化し、ケラチノサイト増殖およびプロ渡虫シグナルを維持するための追加因子を分泌する。増殖段階では、再上皮化が続く間、線維芽細胞、単球/マクロファージ、リンパ球、および内皮細胞からなる新しい造粒組織が再建^{プロセス2}を継続する。血管新生は、内皮細胞の増殖および移動を促進することによって刺激され、新しい血管発達をもたらす。細胞外マトリックスの上皮化および改造は、環境に対する障壁を構築する。創傷が治癒し、造粒組織が瘢痕に進化するにつれて、アポトーシスは、追加の組織損傷を引き起こすことなく、炎症細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を排除する。組織の引張強度は、コラーゲンのような細胞外マトリックスの様々な成分を改造する線維芽細胞によって増強され、新たに形成された組織が傷ついていない^皮膚2とほぼ同じくらい強く、柔軟であるようにする。

創傷閉鎖に向かうこの高度に協調した進行からの逸脱は、障害および/または慢性創^傷3につながる。慢性創傷は、酸化ストレスの増加、慢性炎症、損傷した微小血管系、および創^傷4における異常なコラーゲンマトリックスによって特徴付けられる。酸化ストレスは、特に創傷において、創傷^{閉鎖2、5を}遅らせることができる。創傷治癒の第1段階において、炎症期が調節されなくなると、宿主組織は細胞傷害性酵素を放出する炎症^細胞5の連続的な流入による広範な損傷を想定し、フリー酸素ラジカルの増加、無秩序な炎症メディエーターは、細胞^死6、7をもたらす。

この破壊的な微小環境では、バイオフィルム形成細菌は宿主栄養素を利用し、宿主^組織2の損傷に寄与する。これらのバイオフィルムは、タンパク質、DNA、RNA、および多糖類からなる水和された細胞外高分子物質が、従来の抗生物質療法に耐性を有し、回避できるため、制御および除去が困難である。ホストの生来性および適応免疫応答2、8、9。

慢性創傷の研究は、米国だけで年間650万人に影響を与え、年間400億ドルの費用がかかるため、非常に重要^です。糖尿病患者は、感染の広がりを抑えるために切断を必要とする慢性創傷を発症するリスクが高まっている。これらの患者は、^糖尿病11の病態生理学メカニズムに起因する切断の5年以内に50%の死亡リスクを有する。創傷治癒における宿主の免疫系とマイクロバイオームとの関係は、慢性創傷の結果が未解決の場合、切断および^死亡12を含むため、進行中の研究の重要なトピックである。

ヒトにおける慢性創傷がどのように発症するかを理解するために多大な努力がなされているが、慢性創傷がどのように形成されるのか、またその理由は依然として不明である。障害のある治癒のメカニズムを研究する実験はヒトでは行うことが困難であり、創傷治癒の専門家は、すでに数週間から数ヶ月間慢性に達している慢性創傷を有する患者だけを見る。したがって、専門家は、慢性2になるために創傷を開発するために導くプロセスが間違っていたかを研究^{することができません。}ヒトの慢性創傷の複雑さを要約する動物モデルの欠如がある。我々のモデルが開発されるまで、慢性創傷研究のためのモデルは存在しなかった。

慢性創傷モデルは、レプチン受容体(db/db^-/--)13に変異を有するマウスで開発された。これらのマウスは肥満、糖尿病、治癒を損なっているが、慢性創^傷14を発症しない。血糖値は平均約200 mg/dL, しかし、400 mg/dL¹⁵と高くすることができます.創傷組織中の高レベルの酸化ストレス(OS)が創傷直後に誘発されると、創傷は^慢性16になる。db//-^創傷は20日までに慢性と見なされ、60日以上開いたままである。細菌によって産生されるバイオフィルムは、創傷の3日後に発症するのを見ることができる。成熟したバイオフィルムは、創傷後20日後に見ることができ、どちらかの創傷閉鎖まで持続する。これらのマウスで見つかったバイオフィルム形成細菌は、ヒト糖尿病性慢性創傷にも見られる。

酸化ストレスは、抗酸化酵素、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの2つの阻害剤、過酸化水素を分解する能力を有する2つの酵素で創傷を治療することによって誘導される。過酸化水素は活性酸素種であり、タンパク質、脂質、DNAの酸化を通じて細胞損傷を引き起こす可能性があります。カタラゼは、過酸化水素の分解を有害性の低い化学物質に触媒酸素と水にします。3-アミノ-1,2,4-トリアゾール(ATZ)は、酵素の活性中心に特異的かつ共生的に結合することによってカタラーゼを阻害し、それを不活性化する17、18、19。ATZは、カタラ^{ゼ20、21、22、23、24}の阻害を通じてインビトロとインビボの両方の酸化ストレスの効果を研究するために使用されています。グルタチオンペルオキシダーゼは、抗酸化剤、グルタチオンを介した過酸化水素の還元を触媒し、酸化ストレスから細胞を保護する重要な酵素^{である25。}メルカプトスチシン酸(MSA)は、チオールと酵素のセレノシステイン活性部位に結合することによりグルタチオンペルオキシダーゼを阻害し、それを不活性化^する26。MSAは、インビトロおよびインビボにおける酸化ストレスの影響を研究するために使用されてきた^{だけでなく、20 、27、28}.

慢性創傷のこの新しいモデルは、増加したOSからの長期炎症や皮膚微生物叢からの自然なバイオフィルム形成を含む、ヒト糖尿病性慢性創傷で観察される同じ特徴の多くを共有するので、研究する強力なモデルです。創傷は、真皮表皮相互作用、異常なマトリックス沈着、血管新生の不良および血管系の損傷を損なった。慢性創傷は、男性と女性の両方のマウスで発症するので、両方の男女が慢性創傷を研究するために使用することができます。したがって、慢性創傷モデルは、そのような創傷がどのように始まるかの基本的な理解を進めるのに大きく寄与することができる。この慢性創傷モデルを使用すると、創傷治癒障害の生理学と宿主のマイクロバイオームからの寄与を通じて、慢性がどのように開始/達成されるかについての基本的な質問に対する答えを提供できる。

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プロトコル

すべての実験は、連邦規制に従って完了し、カリフォルニア大学のポリシーと手順は、カリフォルニア大学リバーサイドIACUCによって承認されています。

1. 動物

1. 糖尿病と肥満 B6 を使用します。.慢性創傷モデル用BKS(D)-Lepr^db/Jマウス。購入オプションには、繁殖のためのヘテロジゴットまたは実験用のホモ接着物のいずれかが含まれます。
2. 子孫を産み出すためにヘテロジゴットの雄と雌を繁殖させる。統計的には、ゴミの四分の一だけが糖尿病と肥満に成長します(db/db^-/--)。
3. 生後3週間のごみと一緒に、ウィーンとハウスdb/db^{-/-マウス。}生後5週間のごみから別々のdb/db-/-マウスを、生後5~6ヶ月になるまで他のdb/db-/-^マウスと共に、慢性創傷モデルに使用することができる。この間、成熟した複雑な皮膚マイクロバイオームが発症する可能性があります。
   ^{注:db//--マウス}は、生後3~5週間の間のごみから容易に視覚的に同定される。^{db-/-マウス}は肥満であり、糖尿病であり、野生のタイプおよびヘテロジゴウスのリッターメートよりも有意に大きく、丸みを帯びるだろう。彼らの腹部はわずかにピンク色に見え、腰が大きく見えることがあります。増加した体重は、手術前に確認する必要があります。また、血液中の高レベルのグルコースを測定し、マウスを遺伝子型化してレプチン受容体の変異を確認することができる。

2. ビバリウムと畜産

1. 従来のビバリウム(バリア/特異的病原体フリー施設ではない)におけるハウスdb/db-/-マウスを、db/db-/-^マウスの皮膚上に微生物叢を確立できるようにする。慢性創傷に罹患したヒトを具体的にモデル化するには、病原体への曝露を防ぐために特別な予防措置を講じないようにする。
2. バイバリウム内の感染の広がりを最小限に抑えるために、マイクロアイソレータトップでケージを保護します。新しい寝具で週に2回ケージを変更し、定期的なビバリウムチョウでマウスを養います。寝具や食べ物をオートクレーブしないでください。
3. 室温を21~24°Cの範囲に設定し、年の時期に応じてわずかな変動を行います。湿度は、気候と場所を反映し、19と70%の間の範囲になります。

3. 慢性創傷の発症要件

1. 慢性創傷の発症には、通常肥満、糖尿病、および少なくとも5〜6ヶ月の生後5~6ヶ月の雄マウスと雌マウスのみを使用してください。これらのマウスの重量は40〜80gの間で変化し、平均は約60gである。
2. 肥満と見なされるが体重が50g未満のマウスは使用しないでください。
   注:このプロトコルで言及されているすべてのマウスは、特に断りのない限り、ここで説明する修飾に合格する。

4. 脱毛ローションの削り方と応用

注:傷つける前に、マウスのドーサム上の不要な髪を取り除きます。以下の手順は、手術前日に麻酔下にない生きたdb/db-/-マウスで行われる。動物にストレスや危害を防ぐための予防措置を取ってください。

1. シェービング
   1. マウスをきれいな面に置き、マウスの尾の付いた部分を親指と 2 本目の指でつかみ、マウスの位置を固定します。マウスがジャンプしたり、突然の動きをする可能性があります。もしそうなら、すぐに反応し、怪我を防ぐためにバリカンを引き戻します。
   2. ヘアバリカンでマウスの毛を剃ります(図1A,1B)。ブレードをマウスの皮膚に平行に配置し、首から尾まで背中全体を剃り、透明なフィルムドレッシングを配置するのに十分な大きな表面積を可能にします(材料の表を参照)。最も効率的なカットのための髪の成長の方向に対してブレードを軽く実行します。(図1B)。
      1. ブレードを皮膚に深く押し込まないように、打撲傷や切り傷によって皮膚に損傷を与える可能性があります。
2. 脱毛ローションの塗布
   注:透明なドレッシングがしっかりと付着できるように、脱毛ローションを使用して非常に滑らかな肌を得ます。
   1. 既に切り取った髪を皮膚に濡らすのに十分な圧力で、濡れた紙の拭き取りを軽く押し付け、化学的な火傷を防ぐために、マウスの皮膚を水で浸します。
   2. 皮膚が濡れながら、15-20s(図1C、1D)の脱毛ローションの小さな人形でマウスの皮膚を軽くこする(材料の表を参照)。髪が短く切られたところはどこでもローションを完全に広げなさい。マウスが大きい場合は、より多くのローションを使用してください。
   3. マウス、尾、または顔の近くの場所にローションを適用しないでください。ローションが耳や尾に付着した場合は、すすくなるまで濡れた紙で拭くだけで拭きます。ローションがマウスの顔に当たったら、直ちに蛇口や脱イオン水の下でマウスを洗い、目、鼻、口の損傷を防ぎます。
   4. 塗布後、追加の20-45sのために髪と反応する化物を残します。
   5. すすい前に、手袋をした指や薄い金属のへらで、様々な場所(図1E)で皮膚からローションを軽く拭き取り、脱毛反応の完了を確認してください。黒髪の存在なしに皮膚がピンクの場合、反応は完了します。早すぎるよりすすいでから、もう一度ローションを塗るよりも、髪が実際に取り除かれたことを素早く確認することをお楽しみください。
3. 洗浄
   注:脱毛反応の完了が確認されたら、マウスをランニングタップまたは脱イオン水で洗い、脱毛ローションを除去し、化学的な火傷を防ぎます。
   1. マウスを左手袋の手に置き、左手の親指で尻尾のベースを押して、マウスが動き回らないようにします。マウスが噛み付かないように、左指の残りの部分を閉じてまっすぐにします。
   2. 顔/頭の領域が水の流れから離れ、ぬるま湯の流れが頭の後ろにあり、背中にのみ落ちるようにマウスを配置します。素早く、しかし穏やかに右手袋の手でマウスの背中をこすり、ローションを洗い流します。
   3. マウスの皮膚にローションが無くなったら、ペーパータオルで素早く拭き取り、水の大部分を吸収します(図1F)。
4. シェービングや脱毛後のお手入れ
   1. 濡れた紙拭きで耳と尾に残る残留脱毛ローションを確認し、清掃してください。
   2. マウスを個々のケージに戻し、ケージを加熱パッド(40~45°C)に約30分間置きます。マウスは通常の動作に戻り、数分以内にその動作に戻り、周りを走り回り、グルーミングを行う必要があります。
   3. 実験の期間中、各マウスを別々のケージに入れておきます。マウスの皮膚はもはや保護されず、他のマウスによって容易に引っ掻かれたり噛まれたりすることができる。
   4. 脱毛ローションは、創傷治癒プロセスを妨げたり変更したりするわずかな刺激効果を有する可能性があるため、手術前に18〜24時間待って、マウスの皮膚が落ち着き、マウスが背中の毛の欠如に適応できるようにします。
5. 暗い色素沈着で皮膚から髪を取り除く
   注:一部のdb/db^-/-マウスは、これらのパッチなしで皮膚よりも速く、より強く成長する髪を持つ皮膚に暗いパッチを持つ可能性があります。(図2A)。皮膚のこれらの暗い領域は、中間後期アナゲン段階の毛包および/または色素失^禁29、30のために色が暗く見える。
   1. 暗いパッチが気付いた場合は、再び脱毛ローションを適用しますが、これらの領域でのみ、ステップ4.2と4.3(図2B、2C)を繰り返します。
      注:皮膚の暗い斑点は、実験の期間を通じてより速く髪を成長させるので、必要に応じて、3〜5日ごとに短い髪をクリップします。創傷の所望の位置からパッチまたは2つ離れて許容される。マウスの背面がこれらの暗いパッチで有意に覆われている場合は、慢性創傷モデルにこのマウスを使用しないでください。

5. 試薬のセットアップ

注:db//-マウスにおける慢性創傷の発症は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ、3-アミノ-1、2、4-トリアゾール(ATZ)およびメルカプトスチシン酸(MSA)に対する特異的阻害剤による治療によって、^{それぞれ16}.以下の手順では、マウスの重量に基づいて鎮鎮薬および阻害剤の投与量および投与を詳細に示す。

1. 無菌PBSに0.05mg/kgマウスで痛み止めブプレネックスを腹腔内に注入する。手術前に60gマウスに120μLの体積を約30分間注入する。手術後6時間の別の用量を投与する。必要に応じて余分な用量を与えてもよい。
2. 無菌PBSに1g/kgマウスでATZを食後に注入する。手術前に60gマウスに480 μLの体積を約20分間注入します。腹部の左側に体積の半分を注入し、右側に残りの半分を注入します。
3. MSAを無菌PBSで150mg/kgマウスで透明なドレッシングと創傷組織との間の創傷に多発的に堆積させる。手術後10分以内に60gマウスに対して60μLの体積を投与する。

6. 手術

注:慢性創傷モデルの成功は非滅菌条件に依存する。これらのマウスは無菌ではなく、従来のビバリウムに収容される。皮膚に存在する細菌マイクロバイオームは、抗酸化酵素の阻害剤による治療時の慢性創傷のその後の開始および発症に重要である。したがって、サイトの従来の外科的前調製は、逆示される。

1. 米皮注射
   1. ケージラックの傾斜部分にマウスを固定し、マウスの本体よりも頭を低くして快適に立って、尾を保持します。これにより、内臓を可能な限り注射点から遠ざけようとします。
   2. 膀胱や他の腹部器官への注射を避けるために、腹部の右下の象限に針を挿入します。
   3. 注射の前に針を吸引する。
2. 治療と麻酔
   1. ステップ5.1および5.2に記載されているように、手術前にBuprenex 30分とATZ 20分を投与する。
   2. 図 3Aに示すように、暖かい加熱パッドの上に小さなプラスチック製の容器にマウスを置き、約 15 ~ 20 分間、手順の前に熱サポートを提供すると、潜在的な死亡率を防ぎます。
   3. 小さな容器の上に紙拭き取りタオルまたはペーパータオルを置き、熱を抑えます。マウスは暖かくなるにつれて落ち着くはずです。図 3Bは手術に必要な材料を示す。
   4. 開いたシステムを使用する場合は、化学フードのイソファリン気化器に接続されている密閉容器にマウスを置きます。
   5. オープンシステムでは、2-3.5 L/minの流量で1〜2分間5%のイソファランを投与し、マウスの状態を継続的に監視します。
      1. マウスが意識不明または動かなくなったら、白い外科用パッドにマウスを置き、手術中にアイソフランの連続投与を可能にするために気化器に固定された鼻コーンで頭部をフィットさせます。
   6. オープンシステムでは、手術中に同じ流量で2〜3%のイソファランを投与し、麻酔の深さを維持するためにイソファルランの流れに適応する。
   7. 手術中に投与されたイソファランの濃度と持続時間の両方を最小限に抑える。db/db^-/-マウスは麻酔に非常に敏感なので、イソフラン暴露を最小限に抑えるのが最善です。マウスが5%のイソファランで2分後にまだ応答している場合は、鼻コーンを確保し、手術を開始する前に15〜30sの3-5%のイソファランを投与する。
      1. 傷つける前に適切な麻酔を確認してください。麻酔の深さは、強いつま先のピンチなどの物理的な刺激に対する応答の欠如によって確認される。吸入麻酔下のマウスの時間の長さは5分以下なので、目には獣医のチントは適用されません。
3. 負傷
   1. 70%のエタノールまたは臨床エタノールタオルで紙拭き取りをスプレーし、傷部位の領域をきれいにするためにマウスの背面を拭きます。透明なドレッシングがしっかりと付着できるように肌の表面をきれいにし、寝具、食べ物、皮膚からのほこりがきちんと付着するのを防ぐことができます(図4A)。過度に拭かないようにするか、皮膚に存在する細菌を殺す危険性があります。
   2. 創傷部位の位置を決定する。創傷を行う最良の場所は、マウスの後部側にあり、より高い色素沈着を持つ皮膚のパッチから中心に離れている。
      注:我々は、これらのマウスは、1つの創傷の負担に耐えることができる経験によって決定しました。
   3. 7 mmの皮膚生検パンチ、ピンセットおよび外科はさみを使用して30-45 sの内の傷を作成する。生検パンチを所望の創傷部位に軽く押し付け、パンチのわずかな印象を残すのに十分な深さの周りにパンチをねじります(図4B)。ピンセットでパンチの中心を引き上げ、外科はさみで輪郭を切ることによって輪郭を描く皮膚を切除する(図4C-4E)。
   4. 透明フィルムドレッシング(6 cm x 3.5 cm)の半分で傷をしっかりと覆います。
   5. マウスに対する2%のイソファランの投与を停止する(図4F)。

7. 手術後の治療と回復

1. 手術後のMSA治療を管理し、ステップ5.3に記載されているように透明なドレッシングが適用されます。MSAをドレッシングの下の創傷部に堆積させる。
2. 回復に役立つ30分間、加熱パッドの小さな容器にマウスを戻します。マウスがウォームアップしたら、マウスをケージに戻します。イソファランの効果は一時的であり、マウスはまもなく動き回るはずです。
3. マウスが胸骨の回復を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置したり、ビバリウムに戻したりしないでください。
   注:これらのマウスで作業する場合の選択の麻酔は、その迅速な誘導およびその後の麻酔からの出現のために正確にイソファランである。
   1. 別のマウスの慢性創傷を妨害する1匹のマウスを避けるために個別に手術を受けた家のマウス。前述のように、それらは完全に回復するまでビバリウムに戻らない。
4. 手術後6時間のブプレネックスの2回目の用量を投与する。
5. 手術後の最初の48時間はマウスを注意深く観察してください。
   注:手術は、慢性創傷を作成するための阻害剤と相まって、すでに糖尿病と肥満の両方である動物に非常にストレスです。手術後の最初の数日を生き残るマウスは、通常、実験の持続時間を生き残ります。

8. データ収集、生存戦略、傷後のマウスの取り扱い、その他のヒント

1. データ収集
   1. 手術直後に早く写真を撮る。バイオフィルムは、創傷後5〜10日の間、および早くも3日の間にどこでも観察される。
   2. 細菌が分析の焦点である場合は、10-15 s. 綿棒を保存するための適切な冷凍庫媒体に、培養に依存しないシーケンシング分析のための培養または乾燥のための適切な冷凍庫媒体に、-80 °Cで、創傷の周りの軽い圧力で無菌スワップをロールします。無菌金属へらを介して細胞外高分子物質をマイクロ遠心管に集め、分析前に-80°Cで保存します。
   3. バイオフィルムの収集や撮影の取り扱い中にマウスに麻酔を投与しないでください。これらの手順の間に、マウスを落ち着かせ、それが逃げるのを防ぐために、マウスの前に食べ物の一部を置きます。ほとんどのマウスは食べ物の上に登り、その上に座り、動かない。
2. マウスが適切に動いていない場合や、ドレッシングが正しく適用されていない場合は、二次感染や意図しない慢性創傷や潰瘍が発症する可能性があるので、定期的にマウスと腹部側の活動をチェックして傷がないか確認してください。皮膚と濡れ寝具(db/db^-/-マウスは多尿)との間の摩擦は、ケージが頻繁に変更されない場合、皮膚を乱す可能性があります。
   注:ドレッシングの下の流体の蓄積は、接着剤が粘着性を失い、液体が漏れることを可能にする可能性があります。死んだ皮膚細胞、寝具、および大腿骨物質は、皮膚に固執し、硬化することができます。これらの乾燥したパッチと皮膚の凝集体は、二次感染を防ぐために速やかにクリアする必要があります。
3. マウスが後ろ足で立ったり座ったりする場合は、これらのマウスをケージに移動し、食物と水へのアクセスがはるかに低くなります。ケージ内の食べ物と水の位置が高い場合、マウスは後ろ足で立ったり座って到達したりすることがあります。ほとんどのマウスは、手術前に飲むのに問題はありませんが、一部のマウスが背中にひっくり返る可能性があります。これらの「フリッパー」は、彼らが支援とさらなる監視を必要とするので、ひっくり返すのに大きな困難を持っているかもしれません。
4. 皮膚が破片、フレーク状の皮膚および髪の毛がはっきりしている場合は、皮膚に透明なドレッシングを最大20日間放置します。皮膚にこれらのいずれかが発生した場合は、古いドレッシングを削除し、新しい作品を適用します。
   1. ドレッシングを脱ぐには、頭の後ろの皮膚を軽くつまみ、ドレッシングを頭から引き離します。
   2. ドレッシングをしっかりと置くために、マウスをできるだけ静かに保つ。皮膚が清潔で、フレーク状の死んだ皮膚細胞、寝具からのほこり、および食べ物の断片から自由であることが重要です。ドレッシングを入れて、傷の周りの皮膚に入れて固定します。
   3. マウスの前に食べ物を置いて動きを制限しない場合は、ワイヤーケージの上にマウスを置きます。マウスがケージのレールをつかんだら、尾をできるだけ体に近づけ、最小限の力で引っ張ります。マウスが前方に引くと、背中が伸びてまっすぐにして簡単に塗布できます。この時点でドレッシングをしっかりと置きます。
   4. 古いドレッシングを再利用しないでください。常に最大の接着のために背中に新しいドレッシングを適用します。

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結果

図5は、創傷閉鎖に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷および慢性に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷の例を示す。透明なドレッシングは、バイオフィルムと流体の蓄積が見られるように、慢性創傷に所定の位置に残されています。

慢性創傷開始は6時間未満で行われ、創傷マージンは...

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ディスカッション

マウスに慢性創傷が作成されると、このモデルは、慢性の開始に関与する創傷治癒過程の障害を研究するために使用することができる。このモデルはまた、慢性創傷の発達を逆転させ、治癒を損ない、創傷の閉鎖および治癒につながる広範囲の化学物質および薬物の有効性をテストするために使用することができる。慢性の発症後の異なる時間ポイントを研究することができます:例えば?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers