당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

요약

만성 상처는 전체 두께 의 상처 후 산화 스트레스의 높은 수준을 유도하여 당뇨병 마우스 모델에 급성 상처에서 개발된다. 상처는 카랄라제와 글루타티온 과산화효소에 대한 억제제로 처리되어 피부 미생물군유전체에 존재하는 박테리아에 의한 치유 및 생물막 발달을 방해합니다.

초록

만성 상처는 적절한 치유에 관여하는 하나 이상의 복잡한 세포 및 분자 과정에서 결함있는 규칙의 결과로 발생합니다. 그(것)들은 ~ 6.5M 사람들에 영향을 미치고 미국에서만 ~$40B/년 비용. 만성 상처가 인간에서 어떻게 발생하는지 이해하는 데 상당한 노력이 투자되었지만 근본적인 질문은 여전히 답이 없습니다. 최근에는 인간의 만성 상처의 특징이 많은 당뇨병 성 만성 상처에 대한 새로운 마우스 모델을 개발했습니다. db/db^-/- 마우스를 사용하여, 우리는 상처 직후 상처 조직에 높은 수준의 산화 스트레스 (OS)를 유도하여 만성 상처를 생성 할 수 있습니다, 항산화 효소 카랄라제에 특화된 억제제를 사용하여 일회성 치료를 사용하여 글루타티온 과산화아제. 이 상처는 OS의 상부를 가지고, 자연적으로 생물막을 개발하고, 치료 후 20 일 이내에 완전히 만성이되고 60 일 이상 동안 더 열려 있을 수 있습니다. 이 새로운 모델은 인간에 있는 당뇨병 만성 상처의 많은 특징을 가지고 있고 그러므로 상처가 만성이 되는 방법의 근본적인 이해를 전진시키기에 크게 기여할 수 있습니다. 이것은 인간에 있는 만성 상처가 환자에게 중요한 고통과 고민을 일으키는 원인이 되고 해결되지 않는 경우에 절단귀이기 때문에 중요한 돌파구입니다. 또한, 이러한 상처는 치료에 매우 비싸고 시간이 많이 소요되며 환자에게 개인 소득의 상당한 손실로 이어질 수 있습니다. 우리의 만성 상처 모형의 사용을 통해 연구 결과의 이 필드에 있는 전진은 이 쇠약하게 하는 조건의 밑에 손해를 입는 수백만을 위한 건강 관리를 현저하게 향상할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 급성 상처가 만성화되는 절차를 자세히 설명합니다.

서문

상처 치유는 면역 반응 및 혈관을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 다른 세포 모형을 관련시키는 연속적이고 중첩되는 단계로 조직되는 시간적으로 그리고 공간적으로 통제되는 복잡한 세포 및 분자 프로세스를 관련시킵니다 시스템¹. 피부가 부상을 입은 직후, 인자 및 혈액 세포가 상처 부위에 응고되어 응고캐드를 시작하여 응고를 형성합니다. 항상성을 달성 한 후, 혈관은 상처 부위 산소, 영양분, 효소, 항체 및 화학 적 인 자중으로 팽창하여 다형성 세포체가 이물질의 상처 침대를 지우고 단백질 분해 효소를 분비합니다. ^2.활성화된 혈소판은 상처 부위의 각질을 자극하여 상처 부위를 다시 상피화시키기 위해 다양한 성장 인자를 분비한다. 상처 부위에 모집 된 단핵구는 식세포 박테리아와 죽은 호중구가 있는 대식세포로 분화하고 각질 세포증식 및 친철 신호를 유지하기 위해 추가 요인을 분비합니다. 증식 단계에서, 재상피질화가 계속되는 동안, 섬유아세포, 단핵구/대식세포, 림프구 및 내피 세포로 구성된 새로운 과립화 조직은 재건 과정을^{계속한다 2.} 혈관 신생은 내피 세포 증식 및 이동을 촉진하여 자극되어 새로운 혈관 발달을 초래합니다. 세포외 매트릭스의 상피화 및 리모델링은 환경에 대한 장벽을 구축합니다. 상처가 치유되고 과립 조직이 흉터로 진화함에 따라 세포 사멸은 염증 세포, 섬유 아세포 및 내피 세포를 추가 조직 손상을 일으키지 않고 제거합니다. 조직의 인장 강도는 섬유 아세포가 콜라겐과 같은 세포 외 매트릭스의 다양한 구성 요소를 리모델링하여 새로 형성 된 조직이상처받지 않은 피부2만큼 강하고 유연하다는 것을 향상시키십시오.

상처 폐쇄를 향한이 고도로 협조적 인 진행에서 어떤 편차도 손상 및 / 또는 만성 상처로 이어진다³. 만성 상처는 증가 된 산화 스트레스, 만성 염증, 손상된 미세 혈관 구조 및 상처내의 비정상적인 콜라겐^{매트릭스를 특징으로합니다 4.} 산화 스트레스, 특히 상처에 상처^폐쇄를지연 시킬 수 있습니다^2,5. 상처 치유의 첫 번째 단계에서 염증 상이 조절되지 않게되면, 숙주 조직은 세포 독성 효소를 방출하는 염증 세포^5의 지속적인 유입으로 인한 광범위한 손상을 가정하고, 자유 산소 라디칼의 증가, 및 관계가없는 염증 성 중재자, 세포 사멸의 결과^6,7.

이러한 파괴적인 미세 환경에서, 생물막 형성 박테리아는 숙주 영양소를 이용하고 숙주 조직^2의손상에 기여한다. 이러한 생물막은 단백질, DNA, RNA 및 다당류로 구성된 수화된 세포외 고분자 물질을 제어하고 제거하기 가 어렵기 때문에 기존의 항생제 치료에 내성이 있는 박테리아를 허용하고 회피할 수 있습니다. 호스트의 타고난 적응 면역 반응^2,8,9.

만성 상처를 연구하는 것은 650 만 명에게 영향을 미치고 미국에서만 연간 400 억 달러의 비용이 들기 때문에 매우 중요합니다^10. 당뇨병을 가진 환자는 감염의 퍼짐을 포함하기 위하여 절단을 요구하는 만성 상처를 개발하기 위한 리스크를 증가시켰습니다. 이 환자는 당뇨병의 병리생리학 기계장치에 기인하는 절단의 5 년 안에 50% 사망 리스크가^{있습니다 11.} 호스트의 면역 계통과 상처 치유에 있는 microbiome 사이 관계는 만성 상처의 결과 때문에 지속적인 연구의 중요한 주제입니다, 해결되지 않는 경우에, 절단 및 죽음을^{포함합니다 12}.

만성 상처가 인간에서 어떻게 발생하는지 이해하는 데 상당한 노력이 투자되었지만 만성 상처가 어떻게 그리고 왜 형성되는지는 여전히 불분명합니다. 장애인 된 치유의 메커니즘을 연구 하는 실험은 인간에서 수행 하기 어렵다, 상처 치유 전문가 만 이미 몇 주에 대 한 만성에 도달 하는 만성 상처를 가진 환자를 참조. 따라서, 전문가는 만성이 되기 위하여 발전하기 위하여 상처를 지도하는 무슨 프로세스가 잘못되었는지 공부할 수 없습니다². 인간의 만성 상처의 복잡성을 재현 동물 모델의 부족이있다. 우리의 모형이 개발될 때까지, 만성 상처 연구 결과를 위한 아무 모형도 존재하지 않았습니다.

만성 상처 모델은 렙틴 수용체에 돌연변이가 있는 마우스에서개발되었다(db/db^-/-)^13. 이 마우스는 비만, 당뇨병, 및 손상 된 치유 하지만 만성 상처를 개발 하지 않습니다^14. 혈액 포도 당 수준 주위 평균 200 mg/dL, 하지만 높은 수 있습니다 400 mg/dL¹⁵. 상처 조직에서 높은 수준의 산화 스트레스 (OS)가 상처 직후에 유도되면 상처는 만성^{16이됩니다.} db/db^-/- 상처는 20일까지 만성적으로 간주되며 60일 이상 열려 있습니다. 박테리아에 의해 생성된 생물막은 상처 후 3일 후에 시작되는 발달을 볼 수 있다; 성숙한 생물막은 상처 후 20 일 후에 볼 수 있으며 상처가 닫일 때까지 지속됩니다. 우리가 이 마우스에서 찾아낸 생물막 형성 박테리아는 또한 인간 적인 당뇨병 만성 상처에서 있습니다.

산화 스트레스는 과산화수소를 분해할 수 있는 능력을 가진 두 가지 효소인 항산화 효소, 카랄라제 및 글루타티온 과산화효소의 두 가지 억제제로 상처를 치료함으로써 유도된다. 과산화수소는 반응성 산소 종이며 단백질, 지질 및 DNA의 산화를 통해 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 카살라제는 과산화수소의 분해를 덜 유해한 화학 물질인 산소와 물로 촉매합니다. 3-아미노-1,2,4-트리아졸(ATZ)은 효소의 활성 중심에 특이적이고 공유적으로 결합하여 카랄라아제를 억제하고,^{이를 17,18,19로}비활성화한다. ATZ는 카랄라제^{20,21, 22,23,24의}억제를 통해 생체 외 및 생체 내 모두 산화 스트레스의 효과를 연구하는 데 사용되어 왔다. 글루타티온 과산화효소는 항산화제, 글루타티온을 통해 과산화수소의 환원을 촉매하고, 산화 스트레스^25로부터세포를 보호하는 중요한 효소이다. 메르카프토수치닉산(MSA)은 티올과 효소의 셀레노시스테인 활성 부위에 결합하여 글루타티온 과산화효소를^{억제하여, 이를 비활성화26.} MSA는 생체 외와 생체 내에서 산화 스트레스의 효과 연구 하는 데 사용 되었습니다 뿐만 아니라^20,27,28.

만성 상처의 이 새로운 모형은 피부 microbiome에서 증가한 OS 및 자연적인 생물막 대형에서 머리말을 붙인 염증을 포함하여 인간 적인 당뇨병 만성 상처에서 관찰된 동일 특징의 많은 것을 공유하기 때문에 공부하는 강력한 모형입니다. 상처는 진피 - 표피 상호 작용, 비정상적인 매트릭스 침착, 가난한 혈관 신생 및 손상된 혈관 구조에 손상을 입혔습니다. 만성 상처는 남성과 여성 마우스 모두에서 개발, 그래서 남녀 모두 만성 상처를 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 만성 상처 모델은 그러한 상처가 어떻게 시작되는지에 대한 근본적인 이해를 증진시키는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 만성 상처 모델을 사용 하 여 어떻게 만성 시작/장애인된 상처 치유의 생리학및 호스트의 microbiome의 기여를 통해 달성 에 대 한 기본적인 질문에 대 한 답변을 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 연방 규정에 따라 완료되었으며 캘리포니아 대학의 정책 및 절차는 캘리포니아 대학교, 리버사이드 IACUC에 의해 승인되었습니다.

1. 동물

1. 당뇨병과 비만 B6를 사용합니다. 만성 상처 모델에 대한 BKS(D)-Lepr^db/J마우스. 구매 옵션에는 번식을 위한 헤테로지고트 또는 실험을 위한 동형고트(homozygotes)가 있습니다.
2. 자손을 생산하기 위해 헤테로지고테 수컷과 암컷을 사육한다. 통계적으로 쓰레기의 단지 사분의 일은 당뇨병과 비만이 될 성장할 것입니다(db/db^-/-).
3. 출생 후 3 주 동안 새끼 와 함께 원과 집 DB / db^-/- 마우스. 생후 5주 후에 다른 db/db-/- 마우스와 함께 생후 5주 후에 생쥐로부터 분리된 db/db^{-/-마우스는} 5-6개월이 될 때까지 만성 상처 모델에 사용할 수 있습니다. 이 시간 동안 성숙하고 복잡한 피부 미생물군유전체가 발달할 수 있습니다.
   참고 : db / db^-/- 마우스는 3-5 주 사이의 흰자에서 시각적으로 쉽게 식별됩니다. db/db^-/- 마우스는 비만이고, 당뇨병이며, 야생형 및 이종균보다 훨씬 크고 둥글게 될 것이다. 그들의 복부는 약간 분홍색과 그들의 엉덩이가 더 크게 나타날 수 있습니다. 증가 된 무게는 수술 전에 확인해야합니다. 또한, 렙틴 수용체에서 돌연변이를 확인하기 위해 마우스의 혈액 및 유전자형에서 높은 수준의 포도당을 측정할 수 있다.

2. 사육및축산

1. 집 db/db^-/- 마우스는 기존의 사육장 (장벽 / 특정 병원균무료 시설이 아님)에서 미생물이 db /db^-/- 마우스의 피부에 확립 될 수 있도록합니다. 만성 상처로 고통받는 인간을 구체적으로 모델링하려면 병원균에 노출되지 않도록 특별한 예방 조치를 취하지 마십시오.
2. 미세 이솔레이터 상판으로 케이지를 보호하여 사육장 내 감염 확산을 최소화하십시오. 새 침구로 일주일에 두 번 케이지를 변경하고 일반 사육장 차우로 마우스를 먹이십시오. 침구 나 음식을 오토 클레이브하지 마십시오.
3. 실온을 21°C에서 24°C 사이로 설정하고, 연중 시간에 따라 약간의 변동이 있습니다. 습도, 기후와 위치의 반사, 사이 범위 19 그리고 70%.

3. 만성 상처의 발달을위한 요구 사항

1. 만성 상처의 발달을 위해 현상전형적으로 비만, 당뇨병 및 나이의 적어도 5-6 달인 남성과 여성 마우스만 사용하십시오. 이 마우스의 무게는 40-80 g 사이에서 변화해야 합니다, 약 60 g의 평균.
2. 비만으로 간주되지만 무게가 50g 미만인 마우스는 사용하지 마십시오.
   참고: 이 프로토콜에 언급된 모든 마우스는 달리 언급되지 않는 한 여기에 설명된 자격을 통과합니다.

4. 제모로션 로션의 면도 및 적용

참고: 상처를 입기 전에 마우스의 도르섬에 원치 않는 머리카락을 제거하십시오. 다음 절차는 수술 전날 마취하에 있지 않은 라이브 db/db^-/- 마우스에서 수행됩니다. 동물에게 스트레스와 해를 끼치지 않도록 예방 조치를 취하십시오.

1. 백
   1. 깨끗한 표면에 마우스를 놓고 엄지와 두 번째 손가락으로 마우스 꼬리의 베이스를 잡고 마우스의 위치를 고정합니다. 마우스가 점프하거나 갑작스런 움직임을 할 수 있습니다. 이 경우 신속하게 반응하고 부상을 방지하기 위해 클리퍼를 당깁니다.
   2. 이발로 마우스의 머리카락을 면도하십시오(그림 1A, 1B). 블레이드를 마우스 의 피부에 평행하게 배치하고 꼬리 주변을 포함하여 목에서 꼬리까지 전체를 면도하여 투명 필름 드레싱을 배치할 수 있을 만큼 충분한 표면적을 허용합니다(재료 표참조). 가장 효율적인 절단을 위해 머리 성장 방향에 대해 블레이드를 가볍게 실행합니다. (그림1B).
      1. 타박상이나 절단으로 피부를 손상시킬 수 있으므로 블레이드를 피부에 깊숙이 누르지 마십시오.
2. 제모 로션의 적용
   참고: 투명 드레싱이 단단히 밀착될 수 있도록 제모 로션을 사용하여 매우 매끄러운 피부를 얻으세요.
   1. 이미 잘라낸 머리카락을 피부에 적시기 위해 충분한 압력으로 젖은 종이 닦아서 화학 적 화상을 방지하기 위해 마우스의 피부를 물에 담그십시오.
   2. 피부가 젖은 상태에서, 15-20s(그림 1C, 1D)에대한 제모 로션의 작은 덩어리로 마우스의 피부를 가볍게 문질러 (재료 표참조). 로션을 모발이 짧게 자른 곳마다 완전히 발라주세요. 마우스가 큰 경우 더 많은 로션을 사용하십시오.
   3. 마우스, 꼬리 또는 얼굴 근처의 귀에 로션을 바르지 마십시오. 로션이 귀나 꼬리에 들어오면 젖은 종이로 닦아내기만 하면 헹니다. 로션이 마우스의 얼굴에 오면 즉시 마우스를 실행 탭 또는 탈이온 수로 씻어 눈, 코 및 입의 손상을 방지합니다.
   4. 로션을 그대로 두어 모발에 반응하여 추가로 20-45s를 사용하십시오.
   5. 헹구기 전에, 장갑을 낀 손가락이나 얇은 금속 주걱으로 다양한 장소에서 피부의 로션을 가볍게 닦아내어 제모 반응의 완성을 확인하십시오(그림 1E). 피부가 검은 머리의 존재없이 분홍색인 경우 반응이 완료됩니다. 모발이 조기에 헹검을 한 다음 로션을 다시 바르는 것보다 헹급하기 전에 모발이 제거되었는지 신속하게 확인하는 것이 가장 좋습니다.
3. Rinsing
   참고: 제모 반응이 완료되면 마우스를 누더기 로션을 제거하고 화학 적 화상을 방지하기 위해 실행 탭 또는 탈이온수로 마우스를 씻으하십시오.
   1. 마우스를 왼쪽 장갑을 낀 손에 놓고 왼쪽 엄지손가락으로 손바닥에 꼬리 의 밑부분을 눌러 마우스가 움직이지 않도록 합니다. 마우스가 물지 않도록 왼쪽 손가락의 나머지 부분을 닫고 곧게 펴십시오.
   2. 얼굴/머리 영역이 물줄기에서 멀어지고 미지근한 물줄기가 머리 뒤로 떨어질 수 있도록 마우스를 배치합니다. 마우스 뒷면을 오른쪽 장갑을 낀 손으로 빠르게 문지르면서 로션을 씻어냅니다.
   3. 마우스의 피부가 화장수가 없는 경우 종이 타월로 마우스를 빠르게 닦아 대부분의 물을 흡수합니다(그림1F).
4. 면도 및 제모 후 관리
   1. 젖은 종이 닦음으로 귀와 꼬리에 남아있을 수있는 잔류 제모 로션을 확인하고 청소하십시오.
   2. 마우스를 개별 케이지에 다시 놓고 케이지를 가열 패드(40-45°C)에 약 30분 동안 놓습니다. 마우스는 정상적인 동작으로 돌아가서 몇 분 안에 서두르고 신랑 자체를 해야합니다.
   3. 실험 기간 동안 각 마우스를 별도의 케이지에 보관합니다. 마우스의 피부는 더 이상 보호되지 않으며 다른 마우스에 의해 쉽게 긁히고 물릴 수 있습니다.
   4. 제모 로션은 상처 치유 과정을 방해하거나 변경할 수있는 약간의 자극효과를 가질 수 있기 때문에 수술 전에 18-24 시간 동안 마우스 피부가 진정되고 마우스가 뒤쪽의 머리카락 부족에 적응할 수 있도록 기다립니다.
5. 어두운 색소 침착으로 피부에서 모발 제거
   참고 : 일부 db / db^-/- 마우스는 잠재적으로 이러한 패치없이 피부보다 더 빠르고 강한 다시 성장하는 머리가있을 것이다 피부에 어두운 패치가있을 것이다. (그림2A). 피부의 이 어두운 지역은 중간 후반 anagen 단계 머리 여포 및/또는 안료 요실금^29,30때문에 색깔에서 더 어둡게 나타납니다.
   1. 어두운 패치가 발견되면, 다시 제모 로션을 적용하지만,이 분야에서만, 단계 4.2 및 4.3을 반복(그림 2B, 2C).
      참고 : 피부의 어두운 패치는 실험기간 동안 머리카락이 더 빨리 자라므로 필요한 경우 3-5 일마다 머리카락을 짧게 잘라냅니다. 상처의 원하는 위치에서 한 두 개의 패치가 허용됩니다. 마우스의 뒷면이 이러한 어두운 패치에 의해 크게 덮여 있는 경우, 만성 상처 모델에 대 한이 마우스를 사용 하지 마십시오.

5. 시약 설치

참고 : db / db^-/- 마우스의 만성 상처의 발달은 카탈라제와 글루타티온 과산화효소, 3-아미노-1,2,4 트리아졸 (ATZ) 및 메르카포수닉산 (MSA)에 대한 특정 억제제를 사용하여 치료함으로써 달성됩니다¹⁶ . 다음 절차는 마우스의 무게에 근거를 둔 진통제 및 억제제의 복용량 그리고 행정을 상세히 설명합니다.

1. 무균 PBS에서 0.05 mg/kg 마우스에서 복강 내 진통제 부프레넥스를 주입하십시오. 수술 약 30분 전에 60 g 마우스에 120 μL의 부피를 주입하십시오. 수술 후 또 다른 용량 6 h를 투여하십시오. 추가 복용량 필요에 따라 주어질 수 있습니다.
2. 멸균 된 PBS에서 1 g / kg 마우스로 ATZ를 복강 내 주사하십시오. 수술 약 20 분 전에 60g 마우스에 480 μL의 부피를 주입하십시오. 복부의 왼쪽에 볼륨의 절반을 주입하고 오른쪽에 다른 절반은.
3. 투명 드레싱과 상처 조직 사이의 상처에 국소적으로 MSA를 150 mg/ kg 마우스로 멸균 PBS에 입금하십시오. 수술 후 10분 이내에 60 g 마우스에 대해 60 μL의 부피를 투여하십시오.

6. 수술

참고 : 만성 상처 모델의 성공은 비 멸균 조건에 의존합니다. 이 마우스는 세균이 없고 전통적인 사육장에 보관됩니다. 피부에 상주 하는 박테리아 microbiome 는 산화 효소의 억제제로 치료 시 만성 상처의 후속 개시 및 개발에 대 한 중요 한. 따라서, 사이트의 전통적인 사전 수술 준비는 반대로 표시된다.

1. 복강 내 주사
   1. 케이지 랙의 기울어진 부분에 마우스를 고정하고 마우스의 몸체보다 낮은 머리와 편안하게 서 마우스로 꼬리를 잡습니다. 이것은 우리가 가능한 주입 지점에서 멀리 내부 기관을 이동하려고 시도할 것을 보장합니다.
   2. 방광, 또는 그밖 복부 기관에 주입을 피하기 위하여 복부의 더 낮은 우측 사분면에 바늘을 삽입하십시오.
   3. 주사 전에 바늘을 흡인합니다.
2. 치료 및 마취
   1. 5.1 단계 및 5.2단계에 설명된 대로 수술 20분 전에 부프레넥스 30분 및 ATZ를 투여한다.
   2. 그림 3A와 같이 따뜻한 가열 패드 위에 작은 플라스틱 용기에 마우스를 약 15-20분 동안 놓습니다.
   3. 열을 더 잘 견딜 수 있도록 작은 용기 위에 종이 닦음이나 종이 타월을 놓습니다. 마우스가 따뜻해짐에 따라 진정해야 합니다. 그림 3 B는 수술에 필요한 자료를 보여줍니다.
   4. 열린 시스템을 사용하는 경우 화학 후드의 이소플루란 기화기에 연결되는 밀폐된 용기에 마우스를 놓습니다.
   5. 개방형 시스템에서 2-3.5 L/min의 유량으로 1-2분 동안 5%의 이소플루란을 투여합니다.
      1. 마우스가 의식이 없거나 더 이상 움직이지 않는 경우, 마우스를 흰색 수술 패드에 놓고 수술 중 이소플루란을 지속적으로 투여할 수 있도록 기화기에 고정된 코 콘으로 머리를 맞춥시다.
   6. 개방형 시스템에서 수술 중 동일한 유량으로 2-3 %의 이소플루란을 관리하고 마취의 깊이를 유지하기 위해 이소플루란의 흐름에 적응하십시오.
   7. 수술 중 투여되는 이소플루란의 집중력과 지속 기간을 최소화하십시오. DB/DB ^-/- 마우스는 마취에 매우 민감하므로 이소플루란 노출을 최소한으로 유지하는 것이 가장 좋습니다. 마우스가 5%의 이소플루란에서 2분 후에도 반응하는 경우, 코콘을 고정하고 수술을 시작하기 전에 15-30초 동안 3-5%의 이소플루란을 투여하십시오.
      1. 상처가 나기 전에 적절한 마취를 확인하십시오. 마취의 깊이는 강한 발가락 핀치와 같은 물리적 자극에 대한 반응의 부족에 의해 확인된다. 흡입 된 마취하에 마우스의 시간은 5 분 미만이므로 수의사 연고가 눈에 적용되지 않습니다.
3. 부상
   1. 70% 에탄올 또는 임상 에탄올 타월렛으로 종이 닦아내고 마우스 뒷면을 닦아 상처 부위부위를 청소합니다. 침구, 음식 또는 피부의 먼지가 제대로 달라붙는 것을 방지할 수 있으므로 투명 드레싱이 단단히 밀착될 수 있도록 피부 표면을 청소합니다(그림4A). 지나치게 닦지 마십시오, 또는 피부에 존재하는 박테리아를 죽일 위험이있을 것입니다.
   2. 상처 부위의 위치를 결정합니다. 상처를 수행하는 가장 좋은 장소는 마우스의 등쪽쪽에 있으며, 중앙에 있고 색소 침착이 높은 피부 패치에서 멀리 떨어져 있습니다.
      참고 : 우리는 이 마우스가 단지 한 상처의 부담을 견딜 수 있다는 것을 경험에 의해 결정했습니다.
   3. 7mm 피부 생검 펀치, 핀셋 및 수술 용 가위를 사용하여 30-45 s 이내에 상처를 만듭니다. 생검 펀치를 원하는 상처 부위에 가볍게 누르고 펀치의 약간의 인상을 남길 만큼 충분히 깊은 주위에 펀치를 비틀어(그림 4B). 핀셋으로 펀치의 중심을 당기고 외과 용 가위로 윤곽을 따라 절단하여 윤곽을 그리는 피부를 절제하십시오(그림 4C-4E).
   4. 투명 필름 드레싱 (6cm x 3.5 cm)의 절반으로 상처를 단단히 덮습니다.
   5. 마우스에 2% 이소플루란의 투여를 중지한다(도4F).

7. 수술 후 치료 및 회복

1. 수술 이완료 후 MSA 치료를 관리하고 투명 드레싱은 단계 5.3에 설명된 대로 적용된다. 드레싱 아래 상처 부위에 MSA를 입금하십시오.
2. 회복을 돕기 위해 30 분 동안 가열 패드의 작은 용기에 마우스를 다시 놓습니다. 마우스가 워밍업되면 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 이소플루란의 효과는 일시적이며 마우스는 그 직후에 움직여야 합니다.
3. 마우스가 흉골 의식을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하거나 사육관으로 돌려 보내지 마십시오.
   참고 : 이 마우스로 작업 할 때 선택의 마취는 마취에서 빠른 유도 및 후속 출현으로 인해 정확하게 isoflurane입니다.
   1. 다른 사람의 만성 상처를 방해하는 한 마우스를 피하기 위해 개별적으로 수술을 받은 집 마우스. 위에서 언급 한 바와 같이, 그들은 완전히 회복 될 때까지 사육장으로 돌아오지 않습니다.
4. 수술 후 부프레넥스 6시간의 두 번째 투여량을 투여하십시오.
5. 수술 후 처음 48 시간 동안 마우스를 주의 깊게 관찰하십시오.
   참고 : 만성 상처를 만드는 억제제와 결합 된 수술은 이미 당뇨병과 비만 모두인 동물에게 매우 스트레스가 됩니다. 수술 후 처음 며칠 동안 살아남은 마우스는 일반적으로 실험 기간 동안 살아남을 수 있습니다.

8. 데이터 수집, 생존 전략, 상처 후 마우스 처리 및 추가 팁

1. 데이터 수집
   1. 수술 직후 부터 사진을 찍습니다. 생물막은 상처 후 5-10 일 사이, 그리고 3 일 이내에 어디에서나 관찰됩니다.
   2. 박테리아가 분석의 초점인 경우, 10-15s. 배양 독립적 시퀀싱 분석을 위한 매체 없이 배양 또는 건조를 위한 적절한 냉동고 매체에 면봉을 -80°C에서 저장합니다. 멸균 금속 주걱을 통해 세포외 고분자 물질을 마이크로 원심 분리튜브에 넣고 분석 하기 전에 -80 °C에 보관하십시오.
   3. 생물막 수집 이나 사진 촬영에 대 한 처리 하는 동안 마우스에 마 취를 관리 하지 마십시오. 이러한 절차 동안, 마우스를 진정 하 고 실행에서 그것을 방지 하기 위해 마우스 앞에 음식의 조각을 배치. 대부분의 마우스는 음식 의 상단에 올라, 그것에 앉아, 그리고 이동하지 않습니다.
2. 마우스가 제대로 움직이지 않거나 드레싱이 올바르게 적용되지 않으면 이차 감염및 의도하지 않은 만성 상처 또는 궤양이 발생할 수 있으므로 주기적으로 마우스와 복부 측의 염증을 검사합니다. 케이지가 자주 변경되지 않으면 피부와 젖은 침구(db / db^-/- 마우스는 polyuric) 사이의 마찰은 피부를 방해 할 수 있습니다.
   참고: 드레싱 아래의 유체 축적은 접착제가 끈적거림을 잃고 액체가 누출될 수 있습니다. 죽은 피부 세포, 침구 및 대변은 피부에 달라 붙어 굳어 질 수 있습니다. 피부에 이 말린 패치 및 응집체는 이차 감염을 방지하기 위하여 즉시 삭제되어야 합니다.
3. 마우스가 서 있거나 뒷다리에 앉는 경우에, 음식과 근해에 접근이 훨씬 더 낮은 케이지에 이 마우스를 이동하십시오. 케이지에 있는 음식과 물의 위치가 높으면 마우스가 서 있거나 뒷다리에 앉아 서서서 닿을 수 있습니다. 대부분의 마우스는 몇몇 마우스가 그들의 등에 뒤집을 지도 모르더라도, 수술 의 앞에 이렇게 할 수 있는 경우에, 먹고 마시는 문제가 없을 것입니다. 이러한 "플리퍼"는 뒤집는 데 큰 어려움이 있을 수 있으므로 도움과 추가 모니터링이 필요합니다.
4. 투명 드레싱을 피부에 최대 20일 간 두면 피부가 이물질, 벗겨지기 좋은 피부, 머리카락이 없는 경우. 이러한 중 어느 것이 피부에 발생하는 경우, 오래된 드레싱을 제거하고 새로운 조각을 적용합니다.
   1. 드레싱을 벗기려면 머리 바로 뒤에 피부를 가볍게 꼬집은 다음 드레싱을 머리에서 한 번의 매끄러운 동작으로 당깁니다.
   2. 드레싱 을 단단히 놓기 위해 마우스를 가능한 한 가만히 두십시오. 피부가 깨끗하고 벗겨지기 쉬운 죽은 피부 세포, 침구의 먼지 및 음식 조각이없는 것이 중요합니다. 드레싱을 상처 주위의 피부에 밀어 넣은 다음 단단히 고정합니다.
   3. 마우스 앞에 음식 조각을 배치해도 움직임이 제한되지 않으면 마우스를 와이어 케이지 위에 놓습니다. 마우스가 케이지에 레일을 잡은 후 꼬리를 가능한 한 몸에 가깝게 잡고 최소한의 힘으로 당깁니다. 마우스가 앞으로 당기면 뒤쪽이 늘어나고 곧게 펴져 쉽게 사용할 수 있습니다. 드레싱을 이 시점에서 단단히 놓습니다.
   4. 오래된 드레싱을 다시 사용하지 마십시오. 항상 가장 큰 접착을 위해 뒷면에 새로운 드레싱을 바하십시오.

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결과

도 5는 만성으로 진행되는 억제제의 치료와 상처로 진행되는 억제제의 치료없이 상처의 예를 묘사한다. 투명한 드레싱은 생물막과 유체 축적을 볼 수 있도록 만성 상처에 제자리에 남아 있습니다.

만성 상처 개시는 6 시간 이내에 일어나고 상처 마진은 산화 스트레스로 눈에 띄게 변경됩니다. 이 상처 마?...

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토론

일단 만성 상처가 마우스에 만들어지면, 모형은 만성의 개시에서 관련시킨 손상한 상처 치유 프로세스를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델은 또한 만성 상처 발달과 손상된 치유를 역전시키고 상처 폐쇄 및 치유로 이어질 수있는 광범위한 화학 물질 및 약물의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 만성의 개시 후에 다른 시간 포인트는 공부될 수 있습니다: 예를 들면, 일 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers