Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen

Zusammenfassung

Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.

Zusammenfassung

Chronische Wunden entwickeln sich als Folge einer fehlerhaften Regulation in einem oder mehreren komplexen zellulären und molekularen Prozessen, die an der richtigen Heilung beteiligt sind. Sie wirken sich auf 6,5 Millionen US-Dollar aus und kosten allein in den USA 40 Milliarden US-Dollar pro Jahr. Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, bleiben grundlegende Fragen unbeantwortet. Kürzlich haben wir ein neuartiges Mausmodell für diabetische chronische Wunden entwickelt, die viele Merkmale menschlicher chronischer Wunden aufweisen. Mit db/db^-/- Mäusen können wir chronische Wunden erzeugen, indem wir unmittelbar nach der Wundwunde hohe Konzentrationen von oxidativem Stress (OS) im Wundgewebe induzieren, wobei eine einmalige Behandlung mit Inhibitoren speziell für die antioxidativen Enzyme Catalase und Glutathionperoxidase. Diese Wunden haben ein hohes OS-Niveau, entwickeln Biofilm natürlich, werden innerhalb von 20 Tagen nach der Behandlung vollständig chronisch und können mehr als 60 Tage offen bleiben. Dieses neuartige Modell hat viele Merkmale diabetischer chronischer Wunden beim Menschen und kann daher wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis davon zu fördern, wie Wunden chronisch werden. Dies ist ein großer Durchbruch, weil chronische Wunden beim Menschen erhebliche Schmerzen und Leiden für Patienten verursachen und zu einer Amputation führen, wenn sie ungelöst sind. Darüber hinaus sind diese Wunden sehr teuer und zeitaufwändig zu behandeln und führen zu erheblichen Einkommensverlusten für die Patienten. Fortschritte in diesem Studienbereich durch die Verwendung unseres chronischen Wundmodells können die Gesundheitsversorgung von Millionen von Menschen, die unter diesem schwächenden Zustand leiden, erheblich verbessern. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das Verfahren, um akute Wunden chronisch zu werden, was bisher nicht geschehen ist.

Einleitung

Die Wundheilung umfasst komplexe zelluläre und molekulare Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert sind, in sequenziellen und überlappenden Stadien organisiert sind, die viele verschiedene Zelltypen umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Immunantwort und die Gefäße. System¹. Unmittelbar nachdem die Haut eine Verletzung erlitten hat, aggregieren sich Faktoren und Blutzellen zur Wundstelle und initiieren die Gerinnungskaskade zu einem Gerinnsel. Nachdem die Homöostase erreicht ist, glaudern die Blutgefäße, um Sauerstoff, Nährstoffe, Enzyme, Antikörper und chemotaktische Faktoren, die Polymorphonukleozyten zur Räumung des Wundbettes von fremdem Schutt reinigen und proteolytische Enzyme absondern, in die Wundstelle zu lassen. ². Aktivierte Blutplättchen sezernieren eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, um die Keratinozyten an der Wundkante zu stimulieren, um den verwundeten Bereich neu zu epithelisieren. Monozyten, die an der Wundstelle rekrutiert werden, differenzieren sich in Makrophagen, die Phagozytosebakterien und tote Neutrophile phagozytosieren und zusätzliche Faktoren absondern, um keratinozyte proliferative und pro-wandernde Signale aufrechtzuerhalten. In der Proliferationsphase, während die Reepithelisierung anhält, setzt neues Granulationsgewebe, bestehend aus Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen, den Wiederaufbauprozess fort². Die Angiogenese wird durch die Förderung der Endothelzellproliferation und -migration stimuliert, was zu einer neuen Gefäßentwicklung führt. Die Epithelisierung und Remodellierung der extrazellulären Matrix konstruieren eine Barriere gegen die Umwelt. Wenn sich die Wunde heilt und sich granulationsgewebe zu einer Narbe entwickelt, eliminiert Apoptose entzündliche Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen, ohne zusätzliche Gewebeschäden zu verursachen. Die Zugfestigkeit des Gewebes wird durch Fibroblasten verstärkt, die verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen umbauen, so dass das neu gebildete Gewebe fast so stark und flexibel ist wie die unverwundete Haut².

Jede Abweichung von dieser stark abgestimmten Progression hin zum Wundverschluss führt zu beeinträchtigten und/oder chronischen Wunden³. Chronische Wunden sind gekennzeichnet durch erhöhten oxidativen Stress, chronische Entzündung, beschädigte Mikrovaskulatur und abnorme Kollagenmatrix in der Wunde⁴. Oxidativer Stress, insbesondere in derWunde, kann den Wundverschluss 2^,5verzögern. Wenn in der ersten Phase der Wundheilung die Entzündliche Phase unreguliert wird, geht das Wirtsgewebe aufgrund eines kontinuierlichen Zustroms von Entzündlichen Zellen^5, die zytotoxische Enzyme freisetzen, einer Zunahme freier Sauerstoffradikale und unregulierte Entzündungsmediatoren, die zum Zelltod^6,7führen.

In dieser zerstörerischen Mikroumgebung nutzen biofilmbildende Bakterien wirtsnährstoffe und tragen zur Schädigung des Wirtsgewebes^{bei 2}. Diese Biofilme sind schwer zu kontrollieren und zu entfernen, da die hydratisierten extrazellulären polymeren Substanzen, die aus Proteinen, DNA, RNA und Polysacchariden bestehen, es Bakterien, die im Inneren leben, ermöglichen, gegenüber konventionellen Antibiotikatherapien tolerant zu sein und sich der angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts^2,8,9.

Das Studium chronischer Wunden ist von entscheidender Bedeutung, da sie 6,5 Millionen Us-Dollar betreffen und allein in den USA 40 Milliarden DOLLAR pro Jahr kosten¹⁰. Patienten mit Diabetes haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung chronischer Wunden, die einer Amputation bedürfen, um die Ausbreitung der Infektion einzudämmen. Diese Patienten haben ein Sterblichkeitsrisiko von 50 % innerhalb von 5 Jahren nach der Amputation, das dem Pathophysiologiemechanismus von Diabetes¹¹zugeschrieben wird. Die Beziehung zwischen dem Immunsystem des Wirts und dem Mikrobiom in der Wundheilung ist ein wichtiges Thema der laufenden Forschung, da die Folgen chronischer Wunden, wenn ungelöst, Amputation und Tod¹²umfassen.

Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, ist es immer noch unklar, wie und warum sich chronische Wunden bilden. Experimente zur Untersuchung der Mechanismen der beeinträchtigungen Heilung sind beim Menschen schwierig durchzuführen, und Wundheilungsspezialisten sehen nur Patienten mit chronischen Wunden, die bereits seit Wochen bis Monaten die Chronik erreicht haben. So sind Spezialisten nicht in der Lage zu untersuchen, welche Prozesse schief gelaufen sind, die die Wunde zu entwickeln, um chronisch zu werden². Es fehlt an Tiermodellen, die die Komplexität menschlicher chronischer Wunden rekapitulieren. Bis zur Entwicklung unseres Modells gab es kein Modell für chronische Wundstudien.

Das chronische Wundmodell wurde bei Mäusen entwickelt, die eine Mutation im Leptinrezeptor haben (db/db^{-/-) 13}. Diese Mäuse sind fettleibig, diabetisch, und haben beeinträchtigte Heilung, aber entwickeln keine chronischen Wunden¹⁴. Der Blutzuckerspiegel liegt im Durchschnitt bei 200 mg/dL, kann aber bis zu 400 mg/dL¹⁵betragen. Wenn ein hoher oxidativer Stress (OS) im Wundgewebe unmittelbar nach der Wundverwundung induziert wird, wird die Wunde chronisch¹⁶. Die db/db^-/- Wunden gelten von 20 Tagen als chronisch und bleiben 60 Tage oder mehr geöffnet. Biofilm, der von Bakterien produziert wird, entwickelt sich ab drei Tagen nach der Verwundung; ein ausgereifter Biofilm ist 20 Tage nach der Verwundung zu sehen und besteht bis zum Wundenverschluss. Die biofilmbildenden Bakterien, die wir in diesen Mäusen finden, finden sich auch in menschlichen diabetischen chronischen Wunden.

Oxidativer Stress wird induziert, indem die Wunden mit zwei Inhibitoren antioxidativer Enzyme, Kataalase und Glutathionperoxidase, zwei Enzymen mit der Fähigkeit, Wasserstoffperoxid abzubauen, behandelt werden. Wasserstoffperoxid ist eine reaktive Sauerstoffspezies und kann durch die Oxidation von Proteinen, Lipiden und DNA zelluläre Schäden verursachen. Kataase katalysiert die Zersetzung von Wasserstoffperoxid in weniger schädliche Chemikalien Sauerstoff und Wasser. 3-Amino-1,2,4-Triazol (ATZ) hemmt die Kataalase durch spezifische und kovalente Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms und inaktiviert es^17,18,19. ATZ wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress sowohl in vitro als auch in vivo durch die Hemmung der Kataalase^{20,21,22,23,24}zu untersuchen. Glutathionperoxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid durch das Antioxidans Glutathion und ist ein wichtiges Enzym, das die Zelle vor oxidativem Stress schützt²⁵. Mercaptosuccinsäure (MSA) hemmt Glutathionperoxidase durch Bindung an die Selenocystein-aktive Stelle des Enzyms mit Thiol, inaktiviert es²⁶. MSA wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress in vitro und in vivo sowie^20,27,28zu untersuchen.

Dieses neuartige Modell chronischer Wunden ist ein mächtiges Modell zu studieren, weil es viele der gleichen Merkmale in menschlichen diabetischen chronischen Wunden beobachtet teilt, einschließlich längerer Entzündung entzeln von erhöhten OS und natürliche Biofilmbildung aus Hautmikrobiom. Die Wunden haben eine beeinträchtigte dermal-epidermale Wechselwirkung, abnormale Matrixablagerung, schlechte Angiogenese und beschädigte Vaskulatur. Chronische Wunden entwickeln sich sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen, so dass beide Geschlechter verwendet werden können, um chronische Wunden zu untersuchen. Daher kann das chronische Wundmodell wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis dessen, wie solche Wunden beginnen, zu fördern. Mit diesem chronischen Wundmodell können Antworten auf grundlegende Fragen darüber gegeben werden, wie Die Chronik durch Beiträge aus der Physiologie der beeinträchtigten Wundheilung und dem Mikrobiom des Wirts initiiert/erreicht wird.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesbestimmungen und der Politik der University of California und Verfahren abgeschlossen und wurden von der University of California, Riverside IACUC genehmigt.

1. Tier

1. Verwenden Sie diabetische und fettleibige B6. BKS(D)-Lepr^db/J Mäuse für das chronische Wundmodell. Kaufoptionen umfassen entweder Heterozygoten für die Zucht oder Homozygoten direkt für Experimente.
2. Züchte nasch heterozygote Männchen und Weibchen, um Nachkommen zu produzieren. Nur ein Viertel des Abfalls wird statistisch gesehen diabetisch und fettleibig werden (db/db^-/-).
3. Entwöhnen und hausieren db/db^-/- Mäuse zusammen mit ihren Littermaten 3 Wochen nach der Geburt. Trennen Sie db/db^-/- Mäuse von ihren Littermaten 5 Wochen nach der Geburt und Haus mit anderen db/db^-/- Mäusen, bis sie 5-6 Monate alt sind und für das chronische Wundmodell verwendet werden können. Während dieser Zeit kann sich ein reifes und komplexes Hautmikrobiom entwickeln.
   HINWEIS: Die db/db^-/- Mäuse sind leicht visuell von Littermate zwischen 3-5 Wochen zu identifizieren. Die db/db^-/- Mäuse sind fettleibig, sind diabetisch und werden deutlich größer und runder sein als der wilde Typ und heterozygote Littermate. Ihr Bauch kann etwas rosaund ihre Hüften größer erscheinen. Erhöhtes Gewicht sollte vor der Operation bestätigt werden. Außerdem ist es möglich, hohe Glukosewerte im Blut zu messen und die Maus zu genotypisieren, um die Mutation im Leptinrezeptor zu bestätigen.

2. Vivarium und Ehemann

1. Haus db/db^-/- Mäuse in einem konventionellen Vivarium (keine barrierefreie Anlage) so dass eine Mikroflora auf der Haut von db/db^-/- Mäusen errichtet werden kann. Um menschenspezifisch zu modellieren, der an chronischen Wunden leidet, treffen Sie keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um die Exposition gegenüber Krankheitserregern zu verhindern.
2. Schützen Sie die Käfige mit Mikroisolator-Tops, um die Ausbreitung der Infektion innerhalb des Vivariums zu minimieren. Wechseln Sie die Käfige zweimal pro Woche mit neuer Bettwäsche und füttern Sie die Mäuse mit regelmäßigem Vivarium Chow. Autoklavieren Sie weder die Bettwäsche noch das Essen.
3. Stellen Sie die Raumtemperatur auf einen Bereich zwischen 21 und 24 °C ein, wobei je nach Jahreszeit geringfügige Schwankungen auftreten. Die Luftfeuchtigkeit, die das Klima und die Lage widerspiegelt, wird zwischen 19 und 70% liegen.

3. Anforderungen an die Entwicklung chronischer Wunden

1. Verwenden Sie nur männliche und weibliche Mäuse, die phänotypisch fettleibig, diabetisch und mindestens 5-6 Monate alt für die Entwicklung von chronischen Wunden sind. Das Gewicht dieser Mäuse sollte zwischen 40-80 g schwanken, durchschnittlich etwa 60 g.
2. Verwenden Sie keine Mäuse, die als fettleibig gelten, aber weniger als 50 g wiegen.
   HINWEIS: Alle Mäuse, auf die in diesem Protokoll Bezug genommen wird, bestehen die hier beschriebenen Qualifikationen, sofern nicht anders angegeben.

4. Rasieren und Auftragen von Enthaarungslotion

HINWEIS: Entfernen Sie unerwünschte Shair auf dem Dorsum der Maus vor der Verwundung. Das folgende Verfahren wird an lebenden db/db^-/- Mäusen durchgeführt, die am Tag vor der Operation nicht unter Anästhesie stehen. Ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um Stress und Schäden für das Tier zu verhindern.

1. Rasieren
   1. Legen Sie die Maus auf eine saubere Oberfläche und greifen Sie die Basis des Schwanzes der Maus mit dem Daumen und zweiten Finger, um die Position der Maus zu sichern. Die Maus kann springen oder plötzliche Bewegungen machen; wenn dies der Falle ist, reagieren Sie schnell und ziehen Sie die Clippers zurück, um Verletzungen zu verhindern.
   2. Rasieren Sie das Haar der Maus mit einem Haarschneider (Abbildungen 1A, 1B). Positionieren Sie die Klinge parallel zur Haut der Maus und rasieren Sie den ganzen Rücken vom Hals bis zum Schwanz, einschließlich des ganzen Schwanzes, um eine ausreichend große Oberfläche zu ermöglichen, um einen transparenten Filmverband zu platzieren (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie die Klinge leicht gegen die Richtung des Haarwachstums für den effizientesten Schnitt. (Abbildung 1B).
      1. Drücken Sie die Klinge nicht tief in die Haut, da sie die Haut durch Blutergüsse oder Schnitte schädigen kann.
2. Anwendung der Enthaarungslotion
   HINWEIS: Verwenden Sie enthaart Lotion, um eine sehr glatte Haut zu erhalten, so dass das transparente Dressing fest haften kann.
   1. Die Haut der Maus mit Wasser einweichen, um chemische Verbrennungen zu verhindern, indem Man leicht ein durchnässtes Papiertuch gegen die rasierte Haut drückt, mit genügend Druck, um die bereits geschnittenen Haare auf die Haut zu befeuchten.
   2. Während die Haut nass ist, reiben Sie leicht die Haut der Maus mit einem kleinen Dollop der Enthaarungslotion (siehe Tabelle der Materialien) für 15-20 s (Abbildungen 1C, 1D). Verteilen Sie die Lotion vollständig über, wo immer das Haar kurz geschnitten wurde. Verwenden Sie mehr Lotion, wenn die Maus größer ist.
   3. Tragen Sie keine Lotion auf die Ohren der Maus, des Schwanzes oder irgendwo in der Nähe des Gesichts auf. Wenn die Lotion auf die Ohren oder den Schwanz kommt, wischen Sie einfach mit einem nassen Papier wischen, bis sie abspült. Wenn die Lotion auf das Gesicht der Maus gelangt, waschen Sie sofort die Maus unter laufenden Hahn oder entionisiertes Wasser, um Schäden an den Augen, Nase und Mund zu verhindern.
   4. Lassen Sie die Lotion mit dem Haar für eine zusätzliche 20-45 s nach der Anwendung reagieren.
   5. Vor dem Spülen die Vervollständigung der Enthaarungsreaktion überprüfen, indem Sie die Lotion an verschiedenen Stellen (Abbildung 1E) mit einem gehandicapten Finger oder einem dünnen Metallspachtel leicht von der Haut abwischen. Die Reaktion ist vollständig, wenn die Haut rosa ist, ohne das Vorhandensein von schwarzen Haaren. Es ist am besten, schnell zu überprüfen, dass das Haar tatsächlich vor dem Spülen entfernt wurde, als vorzeitig zu spülen und dann wieder Lotion auftragen zu müssen.
3. Spülen
   HINWEIS: Sobald der Abschluss der Haarentfernungsreaktion überprüft wurde, waschen Sie die Maus mit laufendem Wasserhahn oder entionisiertem Wasser, um die Enthaarungslotion zu entfernen und chemische Verbrennungen zu verhindern.
   1. Platzieren Sie die Maus auf der linken Hand und drücken Sie die Basis des Schwanzes mit dem linken Daumen gegen die Handfläche, um zu verhindern, dass sich die Maus bewegt. Schließen und richten Sie den Rest der linken Finger, um zu verhindern, dass die Maus beißt.
   2. Positionieren Sie die Maus so, dass der Gesichts-/Kopfbereich vom Wasserstrom weg ist und der Wasserstrom hinter den Kopf und nur auf den Rücken fallen kann. Reiben Sie schnell aber sanft die Rückseite der Maus mit der richtigen Hand, um die Lotion wegzuwaschen.
   3. Sobald die Haut der Maus frei von der Lotion ist, wischen Sie die Maus schnell mit einem Papiertuch ab, um den größten Teil des Wassers aufzunehmen (Abbildung 1F).
4. Pflege nach Rasur und Haarentfernung
   1. Überprüfen und reinigen Sie alle Restenthaarungslotionen, die auf den Ohren und dem Schwanz mit einem nassen Papiertuch verbleiben können.
   2. Legen Sie die Maus wieder in den individuellen Käfig und legen Sie den Käfig für ca. 30 min auf ein Heizkissen (40-45 °C). Die Maus sollte zu normalem Verhalten zurückkehren, herumhuschen und sich innerhalb weniger Minuten pflegen.
   3. Beherbergen Sie jede Maus während der gesamten Dauer des Experiments in einem separaten Käfig. Die Haut der Mäuse ist nicht mehr geschützt und kann leicht von anderen Mäusen zerkratzt und gebissen werden.
   4. Da die Enthaarungslotion leichte reizende Effekte haben kann, die den Wundheilungsprozess stören oder verändern können, warten Sie 18-24 h vor der Operation, damit sich die Maushaut beruhigen kann und die Maus sich an den Mangel an Haaren auf dem Rücken anpasst.
5. Entfernen von Haaren aus der Haut mit dunkler Pigmentierung
   HINWEIS: Einige db/db^-/- Mäuse haben potenziell dunkle Flecken in der Haut, die Haare schneller und stärker als Haut ohne diese Flecken zurückwachsen lassen. (Abbildung 2A). Diese dunklen Bereiche der Haut erscheinen dunkler in der Farbe aufgrund der Mitte-späten Anagen Stadium Haarfollikel und/oder Pigment Inkontinenz^29,30.
   1. Wenn dunkle Flecken bemerkt werden, tragen Sie die Enthaarungslotion erneut auf, aber nur in diesen Bereichen, und wiederholen Sie Schritt 4.2 und 4.3 (Abbildungen 2B, 2C).
      HINWEIS: Die dunklen Flecken der Haut wachsen Haare schneller während der Dauer des Experiments, so clip das Haar kurz alle 3-5 Tage, wenn nötig. Ein oder zwei Pflaster weg von der gewünschten Stelle der Wunde ist akzeptabel. Wenn die Rückseite der Maus erheblich von diesen dunklen Flecken bedeckt ist, verwenden Sie diese Maus nicht für das chronische Wundmodell.

5. Reagenz-Setup

ANMERKUNG: Die Entwicklung chronischer Wunden bei db/db^-/- Mäusen wird durch Diebehandlung mit spezifischen Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase, 3-Amino-1,2,4-Triazol (ATZ) und Mercaptosuccinsäure (MSA) bzw.¹⁶ . Das folgende Verfahren beschreibt die Dosis und Verabreichung der Analgesie und Inhibitoren basierend auf dem Gewicht der Maus.

1. Injizieren Sie das Schmerzmittel Buprenex intraperitoneal bei 0,05 mg/kg Maus in sterile PBS. Injizieren Sie ca. 30 min vor der Operation ein Volumen von 120 l für eine 60 g Maus. Verabreichen Sie eine weitere Dosis 6 h nach der Operation. Bei Bedarf kann eine zusätzliche Dosis verabreicht werden.
2. INjizieren ATZ intraperitoneal bei 1 g/kg Maus in sterile PBS. Injizieren Sie ein Volumen von 480 l für eine 60 g Maus ca. 20 min vor der Operation. Injizieren Sie die Hälfte des Volumens auf der linken Seite des Bauches und die andere Hälfte auf der rechten Seite.
3. Legen Sie MSA topisch auf die Wunde zwischen dem transparenten Verband und dem Wundgewebe bei 150 mg/kg Maus in sterilem PBS ab. Verabreichen Sie ein Volumen von 60 l für eine 60 g Maus innerhalb von 10 min nach der Operation.

6. Chirurgie

HINWEIS: Der Erfolg des chronischen Wundmodells beruht auf nicht-sterilen Bedingungen. Diese Mäuse sind nicht keimfrei und befinden sich in einem konventionellen Vivarium. Das Bakterienmikrobiom, das sich in der Haut befindet, ist entscheidend für die spätere Einleitung und Entwicklung chronischer Wunden bei der Behandlung mit Inhibitoren von antioxidativen Enzymen. Daher ist die traditionelle prächirurgische Präparation der Website kontraindiziert.

1. Intraperitoneale Injektion
   1. Sichern Sie die Maus auf schrägen Teil des Käfigs Rack und halten Sie den Schwanz mit der Maus bequem stehen deiner Kopf niedriger als der Körper der Maus. Dadurch wird sichergestellt, dass wir versuchen, die inneren Organe so weit weg vom Injektionspunkt wie möglich zu bewegen.
   2. Setzen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches, um eine Injektion in die Blase oder andere Bauchorgane zu vermeiden.
   3. Aspirieren Sie die Nadel vor der Injektion.
2. Behandlung und Anästhesie
   1. Verabreichen Sie Buprenex 30 min und ATZ 20 min vor der Operation, wie in den Schritten 5.1 und 5.2 beschrieben.
   2. Legen Sie die Maus ca. 15-20 min in einen kleinen Kunststoffbehälter auf ein warmes Heizkissen, wie in Abbildung 3A dargestellt.
   3. Legen Sie ein Papiertuch oder Papiertuch über die Oberseite des kleinen Behälters, um die Hitze besser einzudämmen. Die Maus sollte sich beruhigen, wenn sie sich erwärmt. Abbildung 3 B zeigt Materialien, die für eine Operation notwendig sind.
   4. Legen Sie die Maus in einen geschlossenen Behälter, der mit dem Isofluran-Verdampfer in der chemischen Haube angeschlossen ist, wenn Sie ein offenes System verwenden.
   5. In einem offenen System 5% Isofluran für 1-2 min bei einer Durchflussrate von 2-3,5 L/min verabreichen.
      1. Sobald die Maus bewusstlos ist oder sich nicht mehr bewegt, legen Sie die Maus auf ein weißes chirurgisches Pad und passen Sie den Kopf mit einem Nasenkegel, der am Verdampfer befestigt ist, um eine kontinuierliche Verabreichung von Isofluran während der Operation zu ermöglichen.
   6. In einem offenen System, verabreichen 2-3% Isofluran mit der gleichen Durchflussrate während der Operation und passen sich an den Fluss von Isofluran, um die Tiefe der Anästhesie zu halten.
   7. Minimieren Sie sowohl die Konzentration als auch die Dauer von Isofluran, das während der Operation verabreicht wird. db/db ^-/- Mäuse sind sehr empfindlich auf Anästhesie, so ist es am besten, Isofluran-Exposition auf ein Minimum zu halten. Wenn die Maus nach 2 min bei 5% Isofluran noch ansprechbar ist, sichern Sie den Nasenkegel und verabreichen Sie 3-5% Isofluran für 15-30 s, bevor Sie mit der Operation beginnen.
      1. Bestätigen Sie die richtige Anästhesisierung vor der Verwundung. Die Tiefe der Anästhesie wird durch mangelnde Reaktion auf körperliche Reize wie starke Zehenstiche bestätigt. Die Dauer der Maus unter eingeatmeter Anästhesie ist unter 5 min, so dass keine Tierarztsalbe auf die Augen angewendet wird.
3. Verletzt
   1. Sprühen Sie ein Papiertuch mit 70% Ethanol oder einem klinischen Ethanol-Handtuch und wischen Sie die Rückseite der Maus ab, um den Bereich der Wundstelle zu reinigen. Reinigen Sie die Oberfläche der Haut, damit der transparente Verband fest haften kann, da Staub aus der Bettwäsche, der Nahrung oder der Haut verhindern kann, dass der Verband richtig klebt (Abbildung 4A). Wischen Sie nicht übermäßig ab, oder es besteht die Gefahr, dass die auf der Haut vorhandenen Bakterien abgetötet werden.
   2. Bestimmen Sie die Position der Wundstelle. Der beste Ort, um die Wunde durchzuführen ist auf der rückenden Seite der Maus, zentriert und weg von Flecken der Haut mit höherer Pigmentierung.
      HINWEIS: Wir haben aus Erfahrung festgestellt, dass diese Mäuse nur der Last einer Wunde standhalten können.
   3. Erstellen Sie eine Wunde innerhalb von 30-45 s mit einem 7 mm Hautbiopsie-Punch, einer Pinzette und einer chirurgischen Schere. Drücken Sie den Biopsie-Punch leicht auf die gewünschte Wundstelle und drehen Sie den Stempel gerade tief genug, um einen leichten Eindruck vom Schlag zu hinterlassen (Abbildung 4B). Verbrauchen Sie die umrissene Haut, indem Sie die Mitte des Stempels mit einer Pinzette hochziehen und den Umriss mit einer chirurgischen Schere entlang schneiden (Abbildungen 4C-4E).
   4. Bedecken Sie die Wunde fest mit einem halben Stück transparenten Folienverband (6 cm x 3,5 cm).
   5. Stoppen Sie die Verabreichung von 2% Isofluran an die Maus (Abbildung 4F).

7. Post-Surgery Behandlung und Erholung

1. Verabreichen Sie die MSA-Behandlung nach Abschluss der Operation und das transparente Dressing wird wie in Schritt 5.3 beschrieben angewendet. Legen Sie MSA auf den Wundbereich unter dem Verband ab.
2. Legen Sie die Maus wieder in den kleinen Behälter auf dem Heizkissen für 30 min, um bei der Wiederherstellung zu helfen. Sobald sich die Maus erwärmt hat, legen Sie die Maus wieder in ihren Käfig. Die Wirkung des Isoflurans ist vorübergehend, und die Maus sollte sich kurz darauf bewegen.
3. Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt und kehren Sie sie nicht ins Vivarium zurück, bis die Mäuse genügend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbekehr aufrecht zu erhalten.
   HINWEIS: Die Anästhesie der Wahl bei der Arbeit mit diesen Mäusen ist Isoflurane gerade aufgrund seiner schnellen Induktion und der anschließenden Entstehung aus der Anästhesie.
   1. Hausmäuse, die einzeln operiert wurden, um zu vermeiden, dass eine Maus die chronische Wunde einer anderen stört. Wie bereits erwähnt, kehren sie erst wieder vollständig erholt in das Vivarium zurück.
4. Verabreichen Sie die zweite Dosis von Buprenex 6 h nach der Operation.
5. Beobachten Sie die Mäuse sorgfältig für die ersten 48 h nach der Operation.
   HINWEIS: Die Operation, gekoppelt mit den Inhibitoren, um die chronische Wunde zu schaffen, ist sehr stressig auf das Tier, das bereits diabetisch und fettleibig ist. Mäuse, die die ersten paar Tage nach der Operation überleben, überleben in der Regel die Dauer des Experiments.

8. Datenerfassung, Überlebensstrategien, Umgang mit Mäusen nach der Wundung und zusätzliche Tipps

1. Datenerfassung
   1. Machen Sie schon unmittelbar nach der Operation Fotos. Biofilme werden irgendwo zwischen 5-10 Tagen nach der Verwundung und bereits 3 Tage beobachtet.
   2. Wenn Bakterien im Mittelpunkt der Analyse stehen, rollen Sie einen sterilen Swap mit leichtem Druck um die Wunde für 10-15 s. Bewahren Sie den Tupfer in einem geeigneten Gefriermedium auf, um ihn zu kultivieren oder trocken zu halten, ohne Medien für eine kulturunabhängige Sequenzierungsanalyse bei -80 °C. Extrazelluläre Polymerstoffe über einen sterilen Metallspachtel in ein Mikrozentrifugenrohr sammeln und vor der Analyse bei -80 °C lagern.
   3. Verabreichen Sie der Maus während der Handhabung für die Biofilmsammlung oder die Aufnahme von Filmen keine Anästhesie. Legen Sie während dieser Prozeduren ein Stück Essen vor die Maus, um die Maus zu beruhigen und zu verhindern, dass sie abläuft. Die meisten Mäuse klettern auf das Essen, setzen sich darauf und bewegen sich nicht.
2. Da sekundäre Infektionen und unbeabsichtigte chronische Wunden oder Geschwüre entstehen können, wenn sich die Maus nicht richtig bewegt oder wenn der Verband nicht richtig aufgetragen wird, überprüfen Sie regelmäßig die Aktivität der Maus und der ventralen Seite auf Wunden. Reibung zwischen der Haut und nasser Bettwäsche(db/db^-/- Mäuse sind polyuric) kann die Haut stören, wenn die Käfige nicht häufig gewechselt werden.
   HINWEIS: Flüssigkeitsansammlungen unter dem Verband können dazu führen, dass der Klebstoff seine Klebrigkeit verliert und die Flüssigkeit austreten lässt. Tote Hautzellen, Bettwäsche und Fäkalien können dann auf der Haut kleben und aushärten. Diese getrockneten Flecken und Aggregate auf der Haut sollten umgehend gelöscht werden, um eine sekundäre Infektion zu verhindern.
3. Wenn die Mäuse stehen oder auf ihren Hinterbeinen sitzen, bewegen Sie diese Mäuse in einen Käfig, wo der Zugang zu Nahrung und Wasser viel geringer ist. Wenn die Position von Nahrung und Wasser im Käfig hoch ist, kann die Maus auf ihren Hinterbeinen stehen oder sitzen, um sie zu erreichen. Die meisten Mäuse werden kein Problem beim Essen und Trinken haben, wenn sie dies vor der Operation tun könnten, obwohl es eine Möglichkeit gibt, dass einige Mäuse auf ihren Rücken kippen könnten. Diese "Flipper" können große Schwierigkeiten haben, sich umzudrehen, so dass sie Hilfe und weitere Überwachung benötigen.
4. Lassen Sie das transparente Dressing auf der Haut für bis zu 20 Tage, wenn die Haut frei von Schmutz, flakey Haut und Haar ist. Wenn einer von ihnen auf der Haut auftritt, entfernen Sie den alten Verband und tragen Sie ein neues Stück auf.
   1. Um das Dressing auszuziehen, kneifen Sie die Haut leicht direkt hinter dem Kopf, dann ziehen Sie den Verband weg vom Kopf in einer glatten Bewegung.
   2. Um ein Stück Dressing sicher aufzuplatzieren, lassen Sie die Maus so still wie möglich bleiben. Es ist wichtig, dass die Haut sauber und frei von schuppigen abgestorbenen Hautzellen, Staub aus der Bettwäsche und Lebensmitteln ist. Legen Sie und drücken Sie dann das Dressing in die Haut um die Wunde, um zu sichern.
   3. Wenn das Platzieren eines Stücks Essen vor der Maus seine Bewegungen nicht begrenzt, dann legen Sie die Maus auf den Drahtkäfig. Sobald die Maus eine Schiene auf dem Käfig gegriffen hat, halten Sie den Schwanz so nah wie möglich am Körper und ziehen Sie mit minimaler Kraft. Wenn die Maus nach vorne zieht, wird sich der Rücken dehnen und richten für eine einfache Anwendung; legen Sie das Dressing an dieser Stelle sicher.
   4. Verwenden Sie niemals ein altes Dressing wiederverwenden. Tragen Sie immer neue Dressing auf der Rückseite für die größte Haftung.

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Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für eine Wunde ohne Behandlung von Inhibitoren, die sich in Richtung Wundverschluss bewegen, und eine Wunde mit der Behandlung von Inhibitoren, die in Richtung Chronik voranschreiten. Der transparente Verband wurde auf der chronischen Wunde belassen, so dass Biofilm und Flüssigkeitsansammlung sichtbar sind.

Chronische Wundinitiation findet in weniger als 6 Stunden st...

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Diskussion

Sobald chronische Wunden an den Mäusen entstehen, kann das Modell verwendet werden, um beeinträchtigte Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die an der Initiierung der Chronik beteiligt sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer breiten Palette von Chemikalien und Medikamenten zu testen, die chronische Wundentwicklung und beeinträchtigungsende Heilung umkehren und zu Wundverschluss und Heilung führen können. Es können verschiedene Zeitpunkte nach Beginn der Chronik untersucht werden: z...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers