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要約

ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA から細菌細胞トランスクリプトームの決意をトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングシーケンス。両方のアプローチは、ゲノムの利点と細胞内細菌フィットネスを高めるトランスクリプトーム適応への洞察力を提供します。

要約

ヒトのマクロファージによって貪食に抵抗する能力とそのような細胞内増殖する能力は他の腐生抗酸菌から結核菌 abscessusを区別するもの。これらの病原性の特徴は、特に嚢胞性線維症、気管支拡張症、結核などの基になる構造の肺疾患脆弱なホストで、病原性M. abscessusをレンダリングします。M. abscessusと感染になる患者は不明のまま。多くの抗酸菌とは異なりM. abscessus環境で発見されていないが、アメーバ、 M. abscessusの潜在的な貯留層を表す環境食細胞の内部に存在可能性があります。確かに、 M. abscessus amoebal 貪食に耐性があるし、内アメーバ生活の感染実験モデルにおけるM. abscessus病原性を高めるようです。しかし、少しM. abscessus病原性自体について知られています。M. abscessus細胞内生活に利点を付与する遺伝子を解読するには、 M. abscessusトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングが開発されました。並行して、アメーバとの共培養後抗酸菌の細胞からの RNA 抽出法が開発されました。このメソッドは検証され全体M. abscessusの順序を許可したセル内トランスクリプトーム初めて、 M. abscessus細胞内生活適応上のグローバル ビューを提供します。両方のアプローチは私たちヒトの気道を植民地化するM. abscessusを有効にするとm. abscessus病原因子に洞察力を与えます。

概要

属には菌には種無害な腐生生物から人間の主要な病原体に至るまでにはが含まれます。結核菌、抗酸菌 marinum マイコバクテリウムの ulceransなどよく知られている病原性の種は、成長の遅いのサブグループに属する抗酸菌 (SGM)。対照的に、急速な成長のサブグループ抗酸菌 (ガンダム) は寒天培地で 7 日以内に目に見えるコロニーを形成する能力によって特徴付けられます。RGM グループは以上 180 種、主に非病原性の腐生抗酸菌で構成します。彼らのホストと RGM の相互作用に関する研究アラビノースイソメラーゼに主に焦点を当てているし、マクロファージの殺菌作用によって、これらの抗酸菌が急速に除去されることを示します。

結核菌 abscessusは人間に病原性のある珍しい RGM の一つです、感染症皮膚および軟部組織感染症から肺や播種性感染症に至るまでの広い範囲を担当。M. abscessusと見なされます、マイコバクテリウム ・ アビウム、とともに嚢胞性線維症患者1のメインの抗酸菌病原体。

M. abscessusに対して様々 な研究を示すこの結核菌が細胞内の病原体、肺および RGM で通常見られない皮膚線維芽細胞とマクロファージの殺菌の応答で生存可能なように動作します。2,3,4. M. abscessusゲノム解析が環境微生物土壌との接触で一般的に見られる代謝経路を発見、植物と水生環境、無料のアメーバが多い5を提示します。M. abscessusは腐生と非病原性の RGM は、おそらく集めるかもしれない遺伝的交流に有利なニッチ市場での遺伝子の水平伝達によって買収に見つかりませんいくつかの病原性遺伝子に恵まれていることをも示しています。様々 なアメーバ耐性菌。

実験的に、最初の顕著な結果の 1 つだったM. abscessusの結核6としてもマクロファージの細胞内増殖の観察です。M. abscessusは、ファゴソーム、アポトーシス、オートファジー、感染2細胞の抵抗の 3 つの重要なメカニズムの酸性化も抵抗します。でも、 M. abscessusはファゴソームと細胞質、細菌の増殖2を好むかもしれないより栄養豊富な環境の間の直接通信を確立することが示されています。M. abscessusが所有するか、または細胞内の環境で生存できるように取得してゲノムの利点についてほとんど知られています。アメーバ共は、結核菌 massiliense7,8として多くの新しいアメーバ耐性菌の分離を許可する効率的な方法です。アメーバ内で増殖する能力は、 M. abscessusのm. abscessus4に増加病原性を授けることができるマウスでエアロゾル化のモデルで観察されました。1 つの仮説は、 M. abscessusが他の非病原性 RGM とは異なる貪食細胞で生き残るためにこの環境内で発生した遺伝形質を開発していたことです。これらの買収は、感染する能力と人間のホストに対する病原性を好むかもしれない。

このレポートでは、ツールとアメーバの環境で生き残るためにm ・ abscessusに与えられるゲノムの利点を強調する方法について説明します。この目的のためM. abscessusトランスポゾン変異体のスクリーニングは、アカント アメーバ castellanii型株の細胞内増殖の突然変異体の欠陥の識別を可能にするに、まず説明します。マクロファージの二次検診も人間のホストでこの問題が解決しないかどうかを確認する報告されました。第二に、 M. abscessus貪食での生活に適応するために利用されているどのメカニズムを理解する細胞と動物のホスト、 M. abscessus用メソッドに対する病原性は増加開発,共培養後アメーバの存在下で amoebal 内の細菌からの総 RNA の抽出を許可しています。結果として、細胞内の生活に必要なM. abscessus遺伝子の包括的なビューが開発されました。

プロトコル

1. ライブラリのスクリーニング

  1. Tn変異ライブラリーの構築
    1. トランスポゾンのライブラリを取得します。
      注: この実験トランスポゾン変異ライブラリーは E.J. rubin 氏は、公衆衛生のハーバード学校、ボストン、米国から得られました。ライブラリは、 M. abscessus複雑な (M. abscessus病菌massiliense) のM. abscessusシングルテネシー州のランダムな挿入を許可に導入 phagemid と滑らかな臨床的ひずみ (43) から構築されました。TA 型 ( M. abscessusのゲノムの 91,240 シーケンス TA) に。詳細については、「ルービンらのリファレンス」を参照してください。9 Laencinaら10。
  2. ライブラリとプレートM. abscessusTn変異体の保全の滴定
    注: これは 1 週間かかります。
    1. 氷の上のライブラリを解凍します。1 mL の水 (10-1 10-15) のシリアル希薄を実行することによって、細菌の濃度を決定します。250 mg/mL カナマイシンと 7 H 11 寒天媒体を含んでいるシャーレに各希釈のドロップをプレートします。3-4 日間の 37 ° C で版を孵化させなさい。
      注: ここでは、1011細菌/mL の滴定が回収された.
    2. ライブラリの濃度を決定した後 25% グリセリン水 10 mL で 3,000 細菌/mL の最終的な集中にライブラリを希釈します。約数 10 cryotubes 1 ml の各チューブのライブラリのライブラリ。因数-80 ° C で保存します。
    3. 氷の上の希薄化後のライブラリの 1 つの因数を解凍し、37 ° c. で孵化の 3-4 日後に 200 から 300 の個々 のコロニーを回復する (サイズ 12 cm) 10 の正方形ミューラー ・ ヒントン (MH) の寒天にライブラリの 100 μ L を追加を使用する準備ができたら、
    4. 滅菌つまようじ、96 ウェルのプレートに個々 のコロニー (60 x 96 ウェル プレートで約 6,000 コロニー) 満ちて 7 H の 200 μ L 9 培 0.2% のグリセロール、1% ブドウ糖 250 mg/mL カナマイシンの転送。振ることがなく、5 日間の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. 文化 (ステップ 1.2.4) の 100 μ L を 7 H 9 の 100 μ L を含む 96 ウェル プレートに転送中] 40% のグリセロールで。-80 ° C で順序付けられたライブラリを保存します。
    6. 1.2.3 のステップを繰り返します。1.2.5 を。10,000 の個々 のクローンまでライブラリの残りの部分 (約 100 x 96 ウェル プレート、30 MH 板) がリカバリされます。
  3. アメーバの準備
    1. セルの行11の増幅に PYG 媒体 (表 1) の 30 mL で室温 (RT) で 75 cm2培養フラスコでアメーバアカント castellanii (AC) の文化します。
      注: 多数の消化液胞と大型の接着細胞から成熟した栄養型、顕微鏡ではっきりと見える。75 cm2培養フラスコの初期文化の 3 分の 1 を広めることで 3 日おきが増幅された 25 h. 細胞細胞倍加時間は推定されます。
    2. 25 mL のピペットで PYG のメディアを削除します。10 mL の AC バッファー (表 2)、炭素や窒素源12が含まれていないセルを洗浄します。さらに 2 回の洗浄を繰り返します。
      注: 炭素または窒素ソースを含まない AC バッファーは、抗酸菌の細胞の成長を回避できます。この最小媒体はアメーバの胞子形成につながります。これを抑えるには、熱不活性大腸菌がアメーバには基板 (手順 1.4) として追加された、非常に短い培養時間が (突然変異体スクリーニングの 48 h) と RNAseq 実験のため 4 時間または 16 時間の文化を推進しました。また、PYG 媒体 (通常 10%) を富ませたが、この媒体を使用します。
    3. 組織培養用フラスコの 1 つ活発なシェイク フラスコの底からアメーバをデタッチします。
    4. 5 x 105アメーバ/mL に細胞濃度を調整する検定とセルを数える AC バッファーで希釈。
  4. 調製された大腸菌熱不活化細菌感染後アメーバをフィードするには
    1. 100 mL ルリア スープ (LB) の 37 ° C で一晩のグリセロール ストックからエシェリヒア属大腸菌の臨床分離株を成長します。
    2. 50 mL チューブで 10 分間 1,835 × gで遠心分離によって細菌を収穫します。上清を捨てます。10 ml の 10% グリセロール-水ペレットを再懸濁します。さらに 2 回の洗浄を繰り返します。
    3. 5 ml の 10% グリセロール-水ペレットを再懸濁します。1.5 mL チューブに分注 0.5 mL。シリアル希薄を実行する LB 寒天培地プレートに希釈液を追加することによって、細菌/mL の量を決定します。因数-80 ° C で保存します。
    4. アメーバ感染前に、の日は、氷の上の 1 つの因数を解凍し、60 分の 70 ° C でチューブの孵化によって熱殺害に進みます。
      メモ: は、37 ° C で一晩 LB 寒天培地プレート上不活化細菌の 100 μ L をめっきによって不活化を確認します。植民地べきである目に見える文化の 1 つの夜を過ごした後。
    5. AC バッファーの 50 μ L の 10 の7細菌の集中を熱殺された細菌を希釈し、1 週間以上 4 ° C で希薄化後の細菌を格納します。
  5. アメーバ -M. abscessus Tn変異体の培養: 最初の画面
    注: これは、6,000 の突然変異体のスクリーニングのための 3-4 ヶ月かかります。
    1. アメーバ/よく AC バッファーの 100 μ L の 96 ウェル プレートに 5 × 104を広めます。振ることがなく 32 ° C で 1 時間インキュベートします。井戸に準拠する浮動アメーバ trophozoïtes 時間を許可します。
      1. 抱卵中、1 h の氷の上の細菌を解凍します。
    2. 電子マルチ チャンネル ピペットと解凍細菌文化の 5 μ L を追加します。96 ウェル プレートTn変異株から 6,000 個別クローン周り 1.5 h. 画面のために感染します。
      注: MOI はプロトコルのこの段階で知られています。ただし、 Tnの変異体を含むすべての 96 ウェル プレートは、まったく同じ方法で栽培しました。この最初の画面は、すぐに菌密度変化を考慮することがなく細胞内変異を識別するために目指しています。
    3. 感染症の 1.5 h 後、ヒューム フードの下で AC 媒体を削除する滅菌金属製のトレイは、滅菌ガーゼの 96 ウェル プレートを反転します。AC 中の 200 μ L で補充します。この洗浄を 2 回以上を繰り返します。
    4. 残りの細胞外抗酸菌を排除するために 100 μ g/mL アミカシンと新鮮な培の 200 μ L を追加します。
    5. 3 追加洗浄前に、2 h (前述の手順 1.5.3 で) 孵化させなさい。洗浄後、AC バッファーの 200 μ L で 50 μ g/mL アミカシンと文化を維持します。
    6. 感染症およびアメーバの胞子形成を防ぐためにすべての 24 の時間の終わりに (手順 1.4) から 5 x 107熱不活化エシェリヒア属大腸菌細菌を追加します。
    7. 培養 48 時間後 10 %sds (ドデシル硫酸ナトリウム) の 10 μ L を各ウェルに追加することによって、細胞を溶解し、32 ° C で 30 分間インキュベートシリアル希釈で進み、細胞マイコ バクテリアの数を評価する 5% 羊血液 (COS 板) を含むコロンビア寒天プレート上に追加します。プレート、パラフィルムでシールし、37 ° c. で孵化させなさい
    8. 3-4 日、写真プレート後寒天プレートに表示に植民地と突然変異体の細胞内増殖細菌のコロニーの最小の番号を持つ堆積物を観察することによって障害を識別します。
      注: 図形、高さまたは植民地 (図 1A) の密度について気にしません。136/6000 変異が同定されました。
  6. アメーバ -M. abscessusTn変異体の培養: 最初の画面の中に識別される突然変異体の 2 番目の画面
    注: これは 2 週間かかります。2 番目の画面は、正確に接種した菌の数や細胞内生存細菌感染 2 日後の数を定量化する 136 弱毒変異最初の画面後に得られる実行する必要があります。
    1. 50 mL の影響を受ける各変異体 1 コロニーを成長してチューブの 7 H の 20 mL で 0.2% のグリセロール、1% のグルコース, カナマイシン 250 mg/mL 9 培をいっぱい。指数の段階に到達する細菌を許可 (0.6 < OD < 0.8)。
    2. AC 中 (1,835 x gで 10 分間遠心分離によって文化を洗います。上清を捨てます。9 培 0.2% グリセロール、1% のグルコース カナマイシン 250 mg/mL と 20 ml の 7 H の詳細を 2 回これ洗う手順を繰り返します。
    3. 5 mL の AC バッファー内の細菌を再懸濁します。
    4. コロニー形成単位 (CFU) 変異体の濃度を決定します。24 ウェル プレートの 2 つの最初の行に 1 mL の水を追加します。最初の細菌懸濁液 100 μ L を追加します。マイクロ ピペット、3 回をミックスします。その後、吸引 100 μ L と 2 番目の預金も。
    5. 新しいヒントよく十二まで 2 番目の井戸から3 つ目等、1.6.4 ステップを繰り返します。
    6. 10-12希釈の 30 μ L を吸引し、コス板にそれを追加します。その他の希釈について繰り返します。
    7. コス板パラフィルムをラップし、37 ° C で 3-4 日間インキュベートコロニーを数えることによって濃度を決定します。
    8. 上記 AC 共同培養液 1 mL によくあたり 5 × 104アメーバと 24 ウェル プレートで 3 通の共同培養の試金を実行します。10 の感染 (MOI) の多様性と接種します。
    9. 培養 48 時間後に、1.5.7 の手順で説明するようセル換散と進みます。水 (10-610-1 ) のシリアル希薄を実行し、コス板に 30 μ L を追加します。CFU のカウントを進める前に 37 ° C で 4 日間の版を孵化させなさい。
      注: この 2 つ目の画面の後 60 136 変異体の保存されていた。
    10. 細胞の中生き残りの影響を受けて変異体を格納します。植民地を含む LB 培地グリセロール (20%)、または商用ソリューションと長期的な保全を支持、今後接種を容易にし、-80 ° C で保存ビーズを含む cryotube で cryotube に追加します。
    11. 600 光学濃度 (OD) を測定することによって評価の in vitro変異成長 nm ごとに 2 日間。
      1. 1 を育てる 50 の mL の管に影響を受ける各変異体のコロニーに満ちて 7 H の 20 mL 0.2% グリセロール、1% のグルコース, カナマイシン 250 mg/mL 9 培。指数の段階に到達する細菌を許可 (0.6 < OD < 0.8) 反応を開始する 0.01 外径を調整する前に。
      2. 欠陥を有する体外成長細胞変異のセットから WT 株と比較すると突然変異を除外します。
  7. マクロファージ -M. abscessus Tn内アメーバ生活のため不良で変異体の培養
    注: これは 1 ヶ月かかります。
    1. 豊富な媒体、10% の胎児の子牛血清 (FCS) DMEM の 1 mL で 24 ウェル プレートのウェルあたり 5 × 104 J774.2 マウス マクロファージを広めます。マクロファージの接着を許可する CO2を 37 ° C、5% で 24 時間のプレートを孵化させなさい。3 複製を提供します。
    2. 感染症を実行します。100 μ L のボリュームで 10 %fcs を DMEM で希釈した 10 の MOI でTnの突然変異体を接種します。
    3. 感染症の 3 h 後 1 ml DMEM (真空ポンプを使用することができます) の 3 つの洗浄を実行します。その後残りの細胞外抗酸菌を排除するために 1 時間 (10 %fcs を DMEM) で 250 μ g/mL アミカシンを扱います。
      1. 3 追加は DMEM の 1 mL で洗浄後、細胞マイコ バクテリアの増殖を防ぐために 1 mL の最終的なボリュームに (10 %fcs を DMEM) で 250 μ g/mL アミカシンの文化を維持します。
    4. 共培養後 72 時間はメディアを取り出してし、冷たい水の 1 mL を追加することでマクロファージを溶解させます。4 ° C で 30 分間インキュベートします。
    5. 細胞内の細菌の数を評価する COS プレート CFU アッセイを実行します。
      1. 24 ウェル プレートの 2 つの最初の行に 1 mL の水を追加します。第 1 のウェルに共同細胞ライセートの 100 μ L を追加します。マイクロ ピペット、3 回をミックスします。100 μ L を吸引し、2 番目によく預金。
      2. 新しいヒントも十二まで3 つ目等に 2 番目の井戸からの希釈を繰り返します。10-12希釈の 30 μ L を吸引し、コス板にそれを追加します。
      3. その他の希釈について繰り返します。コス板パラフィルムをラップし、観察し、コロニーをカウントする 3-4 日を待ちます。
  8. 身分証明書とM. abscessus変異体でTnの挿入のサイトのシーケンス
    注: これは 60 変異体の 1.5 ヶ月かかります。
    1. 特定のゲノム抽出M. abscessus変異体
      1. 7 H 9 の 20 mL と 50 mL のチューブの突然変異体の成長指数段階に 250 mg/mL 0.2% グリセロール、1% のグルコース, カナマイシンを添加した培地 (外径600= 0.8)。
      2. 文化 (2,396 × g、5 分) 10 mL を収穫します。上清を捨てます。500 μ L のソリューションの中の細菌を中断 (25% ショ糖、50 mM Tris pH 8、10 mg/mL リゾチーム, チオ尿素 40 mM)。2 mL スクリュー キャップ チューブにソリューションを転送し、37 ° C で 2 時間インキュベート
      3. ソリューション II (25% ショ糖、50 mM Tris pH 8、50 ミリメートルの EDTA) 500 μ L を追加します。ピペッティング後アップし、ダウン 5-10 倍、チューブで 500 μ L のボリュームまでジルコニウム ビーズを追加します。
      4. ホモジナイザーを用いたセル換散を続行 (3 x 6,000 rpm、45 s) 1 分インキュベーション各ラウンド間氷の上で。
      5. (最終的な 100 μ g/mL) 20 mg/mL プロティナーゼ K の 5 μ L を追加し、55 ° C で一晩サンプルをインキュベート
      6. ヒューム フードの下でフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール (25:24:1) の寒さの 1 mL を追加します。RT と 30 分 16,500 × gで遠心分離を進める前にボルテックスによってサンプルをミックスします。
      7. 遠心分離の後水性相を回復し、フードの下で冷たいフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール溶液の等しいボリュームを追加します。再び水相を回復する 30 分 16,500 x gでサンプルを遠心します。
      8. ヒューム フードの下で回復した水相に RT イソプロパノールの 0.7 のボリュームを追加します。ゆっくりと DNA の沈殿物を許可し、右で 5 分間インキュベートするチューブを反転します。16,500 × gおよび RT で 10 分間遠心し、
      9. 上澄みを除去し、フードの下の 70% エタノール 500 μ l 添加の餌を洗浄します。エタノールを削除する前に RT で 16,500 x gで 10 分間のチューブを遠心します。残りのアルコールの蒸発を許可する 10 分間インキュベートします。
      10. 最後に、DNase/RNase 自由水の 100 μ L の DNA の餌を中断します。分光光度計で DNA の収量、純度の DNA を特定します。
      11. 補助的クローニングTn挿入部位、1 泊分の 10 U ClaIのゲノム DNA およびダイジェストの 1 μ g を削除します。製造元のプロトコルを使用します。
        注: Cla私 M. abscessus ゲノム (2,173 制限サイト) で表される最も高い制限酵素の酵素であります。Cla私制限サイトも Tn 変異体のカナマイシン耐性カセットの Tn シーケンスを上流で発見します。したがって、 Cla私を介した subcloning Tn 挿入部位を識別するために有効にします。
    2. 補助的 Tn を含んでいるゲノムの DNA のプラスミッドのクローニング
      注: Tnを実行する前に- Claを追加、2,686 bp pUC19 のアンピシリン耐性プラスミドで subcloning 私プラスミッドの多重クローニング サイトの制限サイト。PUC19 プラスミドのシーケンスは、このリンクの https://www.addgene.org/50005/sequences/ で見つけることが。
      1. 従ってメーカー ダイジェストEcoRpUC19 プラスミドにプロトコル 's 私とハインドIII、51 の断片を解放 bp と 2635 跪くのフラグメントを浄化、51 を排除するために商業 PCR 精製キット二重消化ベクトル bpフラグメントをリリースしました。
      2. ミックス 1 μ L (濃度 25 pmol/μ L) 28 の 2 つの相補的なオリゴヌクレオチド (5 'agct 2008 年 7 タタ AGATCT タタ ATCGAT TATA3' と 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') の bp Claを含む各私制限サイトとハインドIII の両端とEcoR私制限のサイト。100 ° C 10 分で保温し、それらをバインドするためにクールします。
      3. EcoRによって一対のプライマーのダイジェスト私とハインド製造元のプロトコルに従って III。
      4. 150 を縛るEcoRの ng 私/ハインドIII 制限 pUC19 プラスミド濃度 20 μ L の最終巻の 1 U の T4 DNA リガーゼと RT で 1 h の対のプライマー (50 pmol/μ L、25 pmol/μ L、2.5 pmol/μ L) の違いとチェック別クローン作成酵素の消化力。
      5. Claが付いている変更されたプラスミッドをダイジェスト私 37 ° C で 2 時間
      6. 50 を縛るCla私制限 pUC19 の ngプラスミッドおよび 50 Cla で ng の genomic DNA の消化10 μ L 1 U の T4 DNA リガーゼと RT で 1 h の私。
      7. 結紮 (2500 V、200 ω、25 μ F) の 5-10 μ L で大腸菌electrocompetent 細菌の変形に進みます。50 μ G/ml カナマイシン細菌 Tn シーケンスの部分でプラスミドを軸受を選択する 50 μ G/ml アンピシリンと補われた LB 寒天培地プレート上のクローンを選択します。
      8. 適切な抗生物質の選択 (50 μ G/ml カナマイシンと 50 μ G/ml アンピシリン) と LB 液体培地で一晩の抵抗性クローンを成長します。
      9. プラスミド DNA を抽出します。制限酵素による挿入の存在をチェックし、 Tnカナマイシンの最後 17 塩基対に対応するオリゴヌクレオチド (5' 3' TTGACGAGTTCTTCTGA) で破壊された遺伝子を識別するためにテネシー州の 3' 末端をシーケンス抵抗のカセット。
      10. ヌクレオチド blast (ブラスト N) を実行することによってm. abscessus行く 06 株に対するシーケンスを合わせます。

2. Rnaseq 分析のため細胞内の抗酸菌の RNA の抽出

注: これは実験のため 4 ヶ月 RNAseq 分析 4 ヶ月かかります。

  1. アメーバ -M. abscessusバッチでの共培養
    注: 次の実験では、細菌細胞の接触を支持する撹拌で 50 mL のチューブで共培養が行われます。
    1. 成長 7 h 9 M. abscessus 0.2% グリセロール、120 rpm で半ば指数段階に 1% グルコースを添加した培地。
    2. 10 mL の AC バッファーで 2 回細菌を洗浄します。
    3. 外径600 ナノメートルを測定することにより細菌濃度の推定 (1 OD600= 4 × 108抗酸菌)。AC 培地 10 mL に 10 の6アメーバ x 8.5 8.5 × 108抗酸菌に追加します。
    4. 穏やかな攪拌 (約 80 rpm) 30 ° C で 1 時間インキュベートします。
    5. 12 分削除上澄み 253 x gで遠心分離によってセルを収穫し、10 mL の AC バッファー内セルの中断します。この洗浄を 2 回以上を繰り返します。
    6. 10 mL の細胞外の細菌を除去し、穏やかな攪拌 (80 回転) 30 ° C で 4 時間インキュベートする 50 μ G/ml アミカシンを含む AC バッファーで細胞を再懸濁します。セルを 2 回もう一度洗います。
  2. 細胞内abscessus m.からの総 RNA の抽出
    注: は、有毒な試薬を使用するためヒューム フードの下の手順 2.2.1–2.2.3 を実行します。
    1. 最終洗浄後アメーバを妨害する β-メルカプトエタノールの即席 280 μ L で 4 mL の冷たい解決 III (表 3) に感染したアメーバを再懸濁します。これは、ためのチオシアン酸 (GTC) ステップです。リリースされた細胞内細菌をペレットに 2,396 x gで 30 分および 4 ° C の溶解の氷上で 10 分間遠心分離、細胞懸濁液を維持します。
    2. 上澄みを除去し、1 ml の冷溶液 III の細菌のペレットを中断します。4 ° C で 30 分間 2396 x gで細菌を収穫します。抽出バッファーと転送 (までチューブの 500 μ L グラデーション) ジルコニウム ビーズを含む 2 mL スクリュー管に 1 mL にペレットを再懸濁します。-80 ° C で 24 時間、少なくともチューブを格納します。
      注: 溶解試薬でストレージ RNases と細胞溶解の不活性化を許可します。
    3. 使用する準備ができたら、氷のサンプルを解凍し、25 の 6,000 rpm で 2 つのラウンドを実行することによってそれらを溶解ホモジナイザーを用いた 20 6,000 rpm で 1 ラウンドに続いて s s 1 分インキュベーション各ラウンド間氷の上で。
    4. サンプルを冷却するには、10 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。イソアミル アルコールで希釈したクロロホルムの 200 μ L を追加します。ボルテックス後 1 分のサンプルは 16,500 x gと 4 ° C で 15 分間遠心します。
    5. 水相に冷たいイソプロパノール 0.8 mL を追加し、20 ° C で 2-3 h のサンプルをインキュベート遠心分離機の 16,500 x gと 4 ° C で 35 分のサンプル上清を捨てます。
    6. 冷たい 70% エタノール 500 μ L を追加することにより RNA の餌を洗う (混在させないでください)。
    7. 16,500 × gエタノールを削除する 10 分間のサンプルを遠心します。ソリューションを吸引・遠心濃縮器で乾燥します。
    8. 一度乾燥、DNase/RNase 自由水の 100 μ L にペレットを再懸濁します。
      注: サンプルは、メーカーの推奨事項に従って DNA 汚染物質を除去する Dnase で二回扱われなければなりません。
    9. Agarose のゲルの RNA の整合性を評価し、チップ ベース キャピラリー電気泳動法による RNA の整合性数 (鈴) とリボソームの比を測定することによって確認します。
      注: RIN は、全体の電気泳動のトレースを考慮します。RIN は総 RNA の分類ソフトウェア アルゴリズムは、最も低下したプロファイルをほとんどそのまま 10 1 10 1 から番号付けシステムに基づいています。CDNA ライブラリの準備を進める、厘必要があります 8 とリボソームの比 [28/18]、可能な限り高い理想値 2、生物とその特異性によっています。
    10. シーケンスの cDNA ライブラリーの作製まで-80 ° c の RNA のサンプルを格納します。
  3. CDNA ライブラリーの作製
    1. ライブラリの準備を続行するには、製造元のプロトコルを使用して、市販の cDNA 合成キット (資材表) を使用します。
    2. DNA チップの品質・濃度のライブラリを確認します。
      注: より精密で正確な定量化は、微量蛍光定量アッセイで実行できます。
  4. ライブラリ シーケンス
    1. 2 サンプルを正規化 nM 流れ細胞組織によると多重に進みます。
    2. サンプル 1 の濃度を変化させなさい nM 0.1 N NaOH を用いた室温 5 分
    3. 22 でサンプルを希釈します。22 時のフロー ・ セルの各サンプルを読み込みます。
    4. 高スループット シーケンス システムにより、大規模なゲノムをシーケンスを続行します。ここで実行された SRM 実行 (SR: シングル リード、PE: ペアエンド リード、m: 多重サンプル) 51 サイクルを読む 7 のインデックス ベースの。
    5. 外部 FastQC プログラム13とシーケンスの品質を評価します。
    6. アダプター シーケンスのトリミング後の参照ゲノムに対する読み取りのアラインメントと進みます。サンプルの汚染を査定し、必要に応じて、非細菌性読み取りのトリミングを続行する真核細胞のゲノムに対する位置を合わせます。
  5. 統計解析
    1. 特異的発現遺伝子のセットを定義に使用可能ないくつかのソフトウェア プログラムを使用: R ソフトウェア、DESeq2 およびプラットフォームで開発された PF2tools パッケージ (バージョン 1.2.12) を含む Bioconductor パッケージ「トランスクリプトーム et Epigénome」(パスツール研究所、パリ)。

結果

M. abscessusに抵抗し、殺菌反応マクロファージやアメーバなど環境原生動物の脱出機能があります。M. abscessusはなる劇毒性のマウス4病原因子、アメーバと接触して育てられたときを表しています。これらのメソッドの最初の目標は、 M. abscessusの生存とアメーバ内で増殖可能で現在の遺伝子を識別するためにだった。

ディスカッション

M. abscessusの動作は、はるか RGM2に属する他のマイコ バクテリアよりも結核などの病原性の SGM の動作に似ています。SGM の病原性に重要な要素は、マクロファージなどの抗原提示細胞と樹状細胞内であっても乗算または存続する能力です。

M. abscessusは、真核生物の食細胞内で生き残るためにそのゲノム14の合計の順序...

謝辞

我々 は大きく変異の貴重な贈り物の広報 E.J. ルービン (ハーバード大学医学部、ボストン、米国) を認めるライブラリ、および原稿の修正のための博士ベン マーシャル (医学部、英国・ サウザンプトン大学)。我々 は大きく金融支援 (RF20150501377) 嚢胞性線維症」Vaincre ラ Mucoviscidose「と"でグレゴリー ・ Lemarchal」のフランス語の患者会を認めます。また地方イルド フランス (ANR プログラム DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) 総合庁感謝 (ドメーヌ水利 Majeur 病気 Infectieuses et 新興階級) V.L m 員を資金調達のため。L ・ L ですから博士研究員、「ミニステール期高等エ デ ラ凝った」。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ Equipment
24-well platesThermofisher11874235
96-well platesThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BioanalyzerAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop spectrophotometer 2000Thermofisher
QuBit fluorometerThermofisherQ33226
zirconium beads/silica beadsBiospec products11079101ZBeads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii ATCC30010strain
Amikacin Mylan150927-Apowder
B-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250solution
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granular anhydrous
Chloroform Fluka25666solution
ClaI enzymeNew England BiolabsR0197Senzyme
Columbia agar Biomerieux4304190 mm
D-GlucoseSigma-AldrichG8270 powder
DMEM Thermofisher11500596medium
DNase and RNase free water Invitrogen10977-035solution
E. coli electrocompetent Thermofisher18265017bacteria
EDTASigma-AldrichE4884powder
Escherichia coli Clinical isolatepersonal stockbacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf SerumGibco10270serum
GlycerolSigma-AldrichG5516solution
Guanidium thiocyanate EuromedexEU0046-Dpowder
Isopropanol Sigma-AldrichI9516solution
J774.2 macrophagesSigma-AldrichJ774.2Strain
kanamycin Sigma-Aldrich60615powder
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobasic, anhydrous
LB liquid medium Invitrogen12795-027powder
LysozymeRoche10837059001powder
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (cryotubes with beads)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 mediumSigma-AldrichM0428powder
Middlebrook 7H9 mediumThermofisher11753473powder
Müller-Hinton agarBiorad3563901powder
N-Lauryl-sarcosineMerckS37700 416powder
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Phenol/chloroforme Sigma-Aldrich77617solution
Proteinase KThermofisherEO0491powder
proteose peptoneBD211684enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmidNew England Biolabs54357plasmid
SDS  20%Biorad1610418solution
Sodium citrateCalbiochem567446powder
ThioureaSigma-Aldrich88810powder
TrisSigma-Aldrich154563powder
Trizol Thermofisher12044977solution
Tween 80Sigma-AldrichP1754 solution
Yeast extract BD212750
Kit
AMBION DNase kit Thermofisher10792877kit
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit ThermofisherK0503kit
PureLink PCR Purification kitInvitrogenK310001kit
Quant-It" assays kitThermofisherQ33140/Q32884kit
T4 DNA ligase InvitrogenY90001kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kitIllumina15032611kit

参考文献

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