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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir zwei Protokolle, um die Phagozyten -Mycobacterium Abscessus Interaktionen zu untersuchen: das Screening ein Transposon mutierten Bibliothek für bakterielle intrazellulären Mangel und die Bestimmung der bakteriellen intrazellulären Transkriptom von RNA Sequenzierung. Beide Ansätze geben Einblick in die genomische vor- und transkriptomischen Anpassungen intrazelluläre Bakterien Fitness verbessern.

Zusammenfassung

Was aus anderen saprophytischen Mykobakterien Mycobacterium Abscessus unterscheidet, ist die Fähigkeit, durch menschliche Makrophagen Phagozytose widerstehen und die Fähigkeit, innerhalb solcher Zellen vermehren. Diese Virulenz Eigenschaften Rendern M. Abscessus pathogenen, vor allem in gefährdeten Hosts mit zugrunde liegenden strukturellen Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose, Bronchiektasen oder Tuberkulose. Es bleibt unklar, wie Patienten mit M. Abscessus infiziert werden. Im Gegensatz zu vielen Mykobakterien M. Abscessus findet sich nicht in die Umwelt aber befinden sich vielleicht innen Amöben, ökologische Phagozyten, die eine potenzielle Reservoir für M. Abscessusdarstellen. In der Tat M. Abscessus ist resistent gegen amöbenzelle Phagozytose und der Intra-Amöben Leben scheint M. Abscessus Virulenz in einem experimentellen Modell der Infektion erhöhen. Über M. Abscessus Virulenz an sich ist jedoch wenig bekannt. Um die Gene ein Vorteil zum M. Abscessus intrazellulären Leben zu entschlüsseln, war eine Vorführung einer M. Abscessus Transposon mutierten Bibliothek entwickelt. Parallel entwickelte eine Methode der RNA-Extraktion aus intrazellulären Mykobakterien nach kokultur mit Amöben. Diese Methode wurde validiert und erlaubt die Sequenzierung des gesamten M. Abscessus Transkriptom innerhalb der Zellen; zum ersten Mal eine globale Sicht auf M. Abscessus Anpassung an intrazelluläre Leben vorsieht. Beide Ansätze geben uns einen Einblick in M. Abscessus Virulenzfaktoren, mit denen M. Abscessus , die Atemwege des Menschen besiedeln.

Einleitung

Die Gattung umfasst Mycobacterium Arten von harmlosen saprophytischen Organismen bis hin zu großen menschlichen Krankheitserreger. Bekannte pathogene Arten wie Mycobacterium Tuberculosis, Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Ulcerans gehören zur Untergruppe der langsam wachsende Mykobakterien (SGM). Im Gegensatz dazu die Untergruppe der schnellsten wachsenden Mykobakterien (RGM) zeichnet sich durch ihre Fähigkeit, in weniger als 7 Tagen auf Agar Medium sichtbare Kolonien bilden. Die RGM Gruppe umfasst mehr als 180 Arten, vor allem nicht-pathogenen Mykobakterien saprophytischen. Studien zur RGM Interaktionen mit ihren Gastgebern konzentrierten sich hauptsächlich auf Mycobacterium Smegmatis und zeigen, dass diese Mykobakterien schnell durch die bakterizide Wirkung von Makrophagen beseitigt werden.

Mycobacterium Abscessus ist eines der seltenen RGM, die für den Menschen pathogen sind und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Infektionen von Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu Lungen- und disseminierten Infektionen. M. Abscessus , zusammen mit Mycobacterium Avium, gilt die wichtigsten mykobakteriellen Erreger von Mukoviszidose-Patienten1.

Verschiedene Studien durchgeführt auf M. Abscessus zeigen, dass diese Mycobacterium verhält sich wie eine intrazelluläre Erreger, die in der Lage, zu überleben die bakterizide Antwort von Makrophagen und Fibroblasten in den Lungen und Haut, die in der Regel keine in RGM beobachtet wird 2 , 3 , 4. M. Abscessus Genomanalyse identifizierte Stoffwechselwege, die typischerweise in ökologischen Mikroorganismen in Kontakt mit dem Boden, Pflanzen und aquatischen Umgebungen, wo freie Amöben oft sind5. Sie haben auch gezeigt, dass M. Abscessus , mit mehreren Virulenz-Gene in die saprophytischen und nicht-pathogenen RGM ausgestattet ist, wahrscheinlich erworben durch horizontalen Gentransfer in einer Nische günstig zu genetischen Austausch, der sammeln könnte nicht gefunden verschiedene Amöben resistenter Bakterien.

Experimentell, war eines der ersten markanten Ergebnisse der Beobachtung des intrazellulären Zunahme von M. Abscessus Makrophagen sowie für M. Tuberculosis6. M. Abscessus widersteht auch die Versauerung von Phagosom, Apoptose und Autophagie, drei wesentliche Mechanismen der zellulären Widerstand zur Infektion2. Es hat auch gezeigt, dass M. Abscessus ist in der Lage, eine unmittelbare Kommunikation zwischen den Phagosom und Zytosol, einer mehr nährstoffreiche Umgebung, die bakterielle Vermehrung2begünstigen könnte. Sehr wenig bekannt über die genomische Vorteile, die M. Abscessus besitzt oder erwirbt Überleben in einer intrazellulären Umgebung zu ermöglichen. Amöbe-Coculture ist eine effiziente Methode, die die Isolation von vielen neuen Amöbe resistenten Bakterien wie Mycobacterium Massiliense7,8erlaubt. Die Fähigkeit, innerhalb Amöben vermehren wurde beobachtet, in einem Modell der Aerosolization von M. Abscessus bei Mäusen, die eine höhere Virulenz, M. Abscessus4verleihen können. Eine Hypothese ist, dass M. Abscessus genetische Merkmalen begegnet in dieser Umgebung überleben in phagocytic Zellen, die sich von anderen nicht-pathogenen RGM entwickelt hatte. Diese Akquisitionen könnten die Fähigkeit, zu verbreiten und seine Virulenz im menschlichen Wirt begünstigen.

Dieser Bericht beschreibt Werkzeuge und Methoden, um die genomische Vorteile, M. Abscessus in Amöben Umgebung überleben übertragen wurden. Zu diesem Zweck ist das Screening von M. Abscessus Transposon Mutanten, auf dem Acanthamoeba Castellanii Typ Stamm erstbeschrieben ermöglicht die Identifizierung von Mutant defekt für intrazelluläre Wachstum. Eine zweite Überprüfung in Makrophagen wird auch berichtet, zu bestätigen, wenn dieser Mangel in der menschlichen Wirt fortbesteht. Zweitens entwickelt um zu verstehen, welche Mechanismen in M. Abscessus zur Anpassung an das Leben in phagocytic genutzt werden Zellen und erhöhen Sie seine Virulenz im tierischen Wirt, eine Methode, die speziell für M. Abscessus war, nach kokultur in Anwesenheit von Amöben, die die Gewinnung von Gesamt-RNS aus Intra-amöbenzelle Bakterien erlaubt. Infolgedessen entwickelte sich ein umfassender Überblick über M. Abscessus Gene, die für eine intrazelluläre Leben erforderlich sind.

Protokoll

(1) Bibliothek Screening

  1. Aufbau der Tn mutierten Bibliothek
    1. Erhalten Sie eine Transposon-Bibliothek.
      Hinweis: Für dieses Experiment wurde eine Transposon mutierten Bibliothek von e.j. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA erhalten. Die Bibliothek wurde aus einem glatten klinischen Stamm (43) aus der M. Abscessus Komplex (M. Abscessus subspecies Massiliense) mit einem Phagemid in M. Abscessus erlaubt die zufällige Einfügung eines einzigen Tn eingeführt gebaut. in einer TA-Dinucleotide (91.240 TA-Sequenzen im Genom M. Abscessus ). Weitere Informationen finden Sie unter Referenz der Rubin Et al. 9 und Laencina Et al. 10.
  2. Titration der Bibliothek und der Erhaltung der M. AbscessusTn Mutanten in Platten
    Hinweis: Dies dauert eine Woche.
    1. Die Bibliothek auf dem Eis Auftauen. Bestimmen Sie die Bakterienkonzentration von Verdünnungsreihen in 1 mL Wasser (10-1 bis 10-15) durchführen. Einen Tropfen von jeder Verdünnung auf eine Petrischale mit 7H 11 Agar Medium mit 250 mg/mL Kanamycin-Platte. 3 – 4 Tagen inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C.
      Hinweis: Hier eine Titrierung von 1011 Bakterien/mL wiederhergestellt wurden.
    2. Nach Bestimmung der Konzentration der Bibliothek, die Bibliothek, um eine Endkonzentration von 3.000 Bakterien/mL in 10 mL 25 % Glycerin-Wasser zu verdünnen. Aliquot der Bibliothek in 10 Cryoröhrchen mit 1 mL der Bibliothek in jedem Röhrchen. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
    3. Wenn Sie bereit sind, zu verwenden, tauen Sie ein Aliquot der verdünnten Bibliothek im Eis auf und 10 Quadratmeter Mueller-Hinton (MH)-Agarplatten (Größe 12 cm) fügen Sie 100 µL der Bibliothek hinzu, um 200 bis 300 einzelnen Kolonien nach 3 – 4 Tagen Inkubation bei 37 ° c zu erholen
    4. Mit sterilen Zahnstocher, Übertragung der einzelnen Kolonien (etwa 6.000 Kolonien in 60 x 96-Well Platten) in 96-Well-Platten mit 200 µL 7 H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose, 250 mg/mL Kanamycin gefüllt. 5 Tage ohne schütteln bei 37 ° C inkubieren.
    5. Übertragen von 100 µL der Kultur (Schritt 1.2.4) auf einer 96-Well-Platte mit 100 µL 7H 9 mittlere mit 40 % Glycerin. Speichern der bestellten Bibliothek bei-80 ° C.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3. auf 1.2.5. mit dem Rest der Bibliothek bis 10.000 einzelnen Klone werden (ca. 100 x 96-Well-Platte und 30 MH Platten) wiederhergestellt.
  3. Vorbereitung der Amöben
    1. Kultur-Amöbe Acanthamoeba Castellanii (AC) in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen bei Raumtemperatur (RT) in 30 mL PYG Medium (Tabelle 1) zur Verstärkung der Zelle Zeile11.
      Hinweis: Reife Trophozoiten von große anhaftende Zellen mit zahlreichen Verdauungs Vakuolen sind gut sichtbar am Mikroskop. Die Verdopplungszeit Zelle wird geschätzt, um 25 h. Zellen werden alle 3 Tage durch die Verbreitung ein Drittel der ursprünglichen Kultur in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen verstärkt wurden.
    2. Entfernen Sie das PYG Medium mit einem 25-mL-Pipette. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL AC Puffer (Tabelle 2), die keiner Kohlenstoff oder Stickstoff Quellen12enthält. Wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
      Hinweis: AC Puffer, keine Kohlenstoff oder Stickstoff Quellen enthält, vermeidet das extrazelluläre Wachstum von Mykobakterien. Diese minimale Medium führt zu die halbgefrorenen Amöben. Um dies zu begrenzen, Hitze-inaktivierten e.coli hinzugefügt wurden als Substrat (Schritt 1.4) Amöben und sehr kurze kulturzeiten (48 h für Mutant screening) und 4 h oder 16 h Kultur für RNAseq Experimente gefördert wurden. Alternativ können Sie dieses Medium aber angereichert mit PYG Medium (in der Regel 10 %).
    3. Lösen Sie die Amöbe von der Unterseite des Kolbens mit einem einzigen kräftigen Schütteln der Gewebekultur-Küvette.
    4. Anzahl Zellen mit eine Hemocytometer Anpassung der Zellkonzentration bis 5 x 105 Amöben/mL verdünnt in AC-Puffer.
  4. Vorbereitung von Hitze-inaktivierten Escherichia coli Bakterien, Amöben nach der Infektion zu ernähren
    1. Wachsen Sie die E. Coli klinische isolate Belastung aus einem Glycerin-bestand in 100 mL von der Brühe Luria (LB) über Nacht bei 37 ° C.
    2. Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1.835 X g für 10 min in 50 mL-Tuben. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet mit 10 mL 10 % Glycerin-Wasser aufschwemmen. Wiederholen Sie das Waschen noch zweimal.
    3. Das Pellet mit 5 mL 10 % Glycerin-Wasser aufschwemmen. Aliquoten 0,5 mL in 1,5 mL Röhrchen. Bestimmen Sie die Menge an Bakterien/mL durch serielle Verdünnungen und Hinzufügen von Verdünnungen auf LB-Agar-Platten. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
    4. Am Vortag der Amöben-Infektion, tauen Sie eine Aliquote auf Eis auf und fahren Sie mit Hitze-Tötung durch das Rohr bei 70 ° C für 60 min Inkubation.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Inaktivierung durch Ausplattieren 100 µL inaktivierte Bakterien auf LB-Agar-Platten über Nacht bei 37 ° C. Keine Kolonien sollte nach einer Nacht der Kultur sichtbar sein.
    5. Die Hitze getötet Bakterien zu einer Konzentration von 107 Bakterien in 50 µL AC Puffer verdünnen und die verdünnten Bakterien bei 4 ° C nicht mehr als eine Woche lang zu speichern.
  5. Kokultur Amöben -M. Abscessus Tn Mutante: erster Bildschirm
    Hinweis: Dies dauert 3 – 4 Monate für das Screening von 6.000 Mutanten.
    1. 5 x 104 Amöben/gut zu einer 96-Well-Platte in 100 µL des AC-Puffers zu verbreiten. Inkubation für 1 h bei 32 ° C ohne schütteln. Lassen Sie die schwimmenden Amöbe Trophozoïtes Zeit zur Einhaltung der Brunnen.
      1. Während der Inkubation, tauen Sie Bakterien auf Eis für 1 h.
    2. Fügen Sie 5 µL der aufgetauten Bakterienkulturen mit einem elektronischen Mehrkanal-Pipette. Für 1,5 h Bildschirm um 6.000 individualisierte Klone aus der 96-Well-Platte Tn Mutanten Lager zu infizieren.
      Hinweis: Die MOI ist bei diesem Schritt des Protokolls unbekannt; jedoch wurden alle 96-Well-Platten mit Tn -Mutanten in genau der gleichen Weise angebaut. Diese ersten Bildschirm soll intrazelluläre mangelhafte Mutanten, schnell zu identifizieren, ohne Rücksicht auf die Variationen im Inokulum Dichte.
    3. Invertieren Sie nach einer Infektion die 1,5 h die 96-Well-Platte auf sterile Gazen gelegt in eine sterilisierte metalltablett, AC Medium unter einem Abzug zu entfernen. Füllen Sie mit 200 µL AC Medium. Wiederholen Sie diese zweimal waschen.
    4. Fügen Sie 200 µL frisches Medium ergänzt mit 100 µg/mL Amikacin, restlichen extrazelluläre Mykobakterien zu beseitigen.
    5. Inkubieren Sie für 2 h vor dem Fortfahren mit 3 zusätzlichen Waschungen (wie in Schritt 1.5.3 beschrieben). Nach dem Waschen, pflegen Sie die Kulturen mit 50 µg/mL Amikacin in 200 µL des AC-Puffers.
    6. Fügen Sie 5 x 107 Hitze-inaktivierten Escherichia-coli -Bakterien (aus Schritt 1.4) am Ende der Infektion und alle 24 h, halbgefrorenen der Amöben zu verhindern.
    7. Lösen Sie nach 48 h kokultur die Zellen durch Zugabe von 10 µL 10 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 min bei 32 ° C. Führen Sie die serielle Verdünnung und add-on Columbia Agarplatten mit 5 % Schafe Blut (COS-Platten), um die Anzahl der intrazellulären Mykobakterien zu bewerten. Dichtplatte mit der Parafilm und bei 37 ° c inkubieren
    8. Wenn Kolonien auf den Agarplatten nach 3-4 Tagen, Foto der Platte erscheinen und identifizieren die Mutanten durch Beobachtung der Einlagen mit der niedrigsten Anzahl der Bakterienkolonien für intrazelluläre Wachstum beeinträchtigt.
      Hinweis: Habe nichts dagegen Sie, über Form, Höhe und Dichte der Kolonie (Abb. 1A). 136/6000 Mutanten wurden identifiziert.
  6. Kokultur Amöben -M. AbscessusTn mutierte: Zweitbildschirm von Mutanten, die bei dem ersten Bildschirm erkannt
    Hinweis: Dies dauert 2 Wochen. Ein zweiter Bildschirm muss mit 136 abgeschwächten Mutanten erhalten nach dem ersten Bildschirm zu quantifizieren, gerade die Zahl der Bakterien beimpft und die Anzahl der intrazellulären überleben Bakterien 2 Tage nach der Infektion durchgeführt werden.
    1. Gewachsen 1 Kolonie von jedem betroffenen Mutante in 50 mL Tuben gefüllt mit 20 mL 7H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin. Die Bakterien, die exponentielle Phase zu erreichen (0,6 < OD < 0,8).
    2. Waschen Sie die Kultur durch Zentrifugieren (1.835 X g für 10 min.) in AC Medium. Verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie das Waschen zweimal mit 20 mL 7H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin ergänzt.
    3. Die Bakterien in 5 mL AC Puffer aufzuwirbeln.
    4. Bestimmen Sie die koloniebildenden Einheit (KBE) Konzentration der Mutanten. Fügen Sie in 24-Well-Platten 1 mL Wasser auf die zwei ersten Zeilen. Die erste Bohrung 100 µL der Bakteriensuspension hinzufügen. Mischen Sie mit einer Mikropipette dreimal. Aspirieren Sie dann gut 100 µL und Einzahlung in die zweite.
    5. Wiederholen Sie mit einer neuen Spitze Schritt 1.6.4 aus dem zweiten Brunnen auf der dritten, usw. bis zum zwölften gut.
    6. Aspirieren Sie 30 µL 10-12 Verdünnung und fügen Sie es ein COS-Platte. Wiederholen Sie für die anderen Verdünnungen.
    7. Die COS-Platte mit Parafilm wickeln und 3 – 4 Tage bei 37 ° c inkubieren Bestimmen Sie die Konzentration durch das zählen der Kolonien.
    8. Führen Sie kokultur Assays, wie oben beschrieben in dreifacher Ausfertigung in einer 24-Well-Platte mit 5 x 104 Amöbe pro Bohrloch in 1 mL AC kokultur Medium. Impfen Sie mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10.
    9. Fahren Sie nach 48 h kokultur mit der Lyse der Zelle wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Führen Sie serielle Verdünnungen in Wasser (10-1 bis 10-6) und der COS-Platten fügen Sie 30 µL hinzu. 4 Tage bei 37 ° C, bevor Sie fortfahren mit KBE zählen inkubieren Sie die Platten.
      Hinweis: Nach diesem zweiten Bildschirm wurden 60 von 136 Mutanten konserviert.
    10. Speichern Sie die Mutanten, die für ihr Überleben in den Zellen beeinflusst. Fügen Sie eine Kolonie zu einem Cryotube mit LB-Medium mit Glycerin (20 % final) oder in eine kommerzielle Lösung mit Microbeads zugunsten einer langfristigen Erhaltung und künftige Impfung zu erleichtern und dann speichern bei-80 ° c cryotube
    11. Bewertung der in-vitro- mutierte Wachstum durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm alle 2 Tage.
      1. 1 wachsen Kolonie von jedem betroffenen Mutante in 50 mL Röhrchen gefüllt mit 20 mL 7H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin ergänzt. Die Bakterien, die exponentielle Phase zu erreichen (0,6 < OD < 0,8) vor der Einstellung der OD auf 0,01 um die Kinetik zu beginnen.
      2. Schließen Sie Mutanten mit einem in-vitro- Wachstum defekt im Vergleich mit dem WT-Stamm aus dem Satz von intrazellulären mangelhaft Mutanten aus.
  7. KokulturM. Abscessus Tn Mutante Makrophagen - defekt für eine Intra-Amöben Leben
    Hinweis: Dies dauert 1 Monat.
    1. Verbreiten Sie 5 x 104 J774.2 murine Makrophagen pro Bohrloch einer 24-Well-Platte in 1 mL reichen Medium, DMEM mit 10 % des fetalen Kalb Serum (FCS) ergänzt. Inkubieren Sie die Platten für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2 zu Makrophagen Haftung ermöglichen. Geben Sie 3 Wiederholungen.
    2. Führen Sie die Infektion. Tn -Mutanten mit einer MOI von 10, in DMEM mit 10 % FCS in einem Volumen von 100 µL verdünnt zu impfen.
    3. Führen Sie nach 3 h der Infektion drei Wäschen mit 1 mL DMEM (eine Vakuumpumpe kann verwendet werden). Dann gönnen Sie sich 250 µg/mL Amikacin (in DMEM mit 10 % FCS) für 1 h, restlichen extrazelluläre Mykobakterien zu beseitigen.
      1. Nach 3 weiteren mit 1 mL DMEM wäscht, pflegen Sie die Kulturen in 250 µg/mL Amikacin (in DMEM mit 10 % FCS) zu einem Endvolumen von 1 mL, extrazelluläre mykobakteriellen Multiplikation zu verhindern.
    4. 72 h nach kokultur, entfernen Sie das Medium und die Makrophagen durch Zugabe von 1 mL kaltem Wasser lösen. 30 min bei 4 ° c inkubieren
    5. Führen Sie KBE-Assays auf COS Platten zum Auswerten der Anzahl von intrazellulären Bakterien.
      1. Fügen Sie in einer 24-Well-Platte 1 mL Wasser auf die zwei ersten Zeilen. Die erste Bohrung 100 µL der Co Zelle lysate hinzufügen. Mischen Sie mit einer Mikropipette dreimal. Aspirieren Sie 100 µL und hinterlegen sie in der zweiten gut.
      2. Wiederholen Sie mit einer neuen Spitze die Verdünnung aus dem zweiten Brunnen auf der dritten, usw. bis zum zwölften gut. Dann Aspirieren Sie 30 µL 10-12 Verdünnung und fügen Sie es ein COS-Platte.
      3. Wiederholen Sie für die anderen Verdünnungen. Wickeln Sie die COS-Platte mit Parafilm und warten Sie 3-4 Tage zu beobachten und zählen der Kolonien.
  8. Identifizierung und Sequenzierung des Standortes der Einfügung des Tn in M. Abscessus Mutanten
    Hinweis: Dies dauert 1,5 Monate für 60 Mutanten.
    1. Genomische Extraktion der identifizierten M. Abscessus Mutanten
      1. Wachsen die Mutanten in der 50 mL-Tube mit 20 mL 7H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und Kanamycin 250 mg/mL zur exponentiellen Phase (OD600= 0,8).
      2. Sammle 10 mL der Kulturen (2.396 X g, 5 min). Verwerfen Sie den überstand. Aussetzen der Bakterien in 500 µL Lösung I (25 % Saccharose, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL Lysozym, 40 mM Thioharnstoff). Übertragen Sie die Lösung in 2 mL Röhrchen mit Schraubverschluss und 2 h bei 37 ° c inkubieren
      3. Fügen Sie 500 µL Lösung II (25 % Saccharose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Nach pipettieren und unten fügen Sie 5 - 10 mal hinzu, Zirkonium Perlen bis zu einem Volumen von 500 µL in der Röhre.
      4. Fahren Sie mit der Lyse der Zelle mit einem Homogenisator (3 x 6.000 u/min, 45 s) mit einer 1 min Inkubation auf Eis zwischen jeder Runde.
      5. Fügen Sie 5 µL von 20 mg/mL Proteinase K (100 µg/mL Final) und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 55 ° C.
      6. Fügen Sie 1 mL kaltes Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol (25:24:1) unter einem Abzug. Mischen Sie die Proben durch Vortexen bevor mit Zentrifugation bei RT und 16.500 X g für 30 min..
      7. Erholen Sie nach Zentrifugation die wässrige Phase zu, und fügen Sie ein gleiches Volumen kaltes Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol-Lösung unter einer Haube. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 X g für 30 min in der wässrigen Phase wieder zu erholen.
      8. Die wiederhergestellten wässrige Phase unter einem Abzug 0,7 Volumen von RT Isopropanol hinzufügen. Kehren Sie langsam die Rohre, damit DNA Niederschlag und 5 min bei RT inkubieren Zentrifugieren Sie dann für 10 min bei 16.500 X g und RT.
      9. Entfernen Sie den überstand zu und waschen Sie das Pellet mit 500 µL 70 % Ethanol unter einer Haube. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 16.500 X g bei RT vor dem Entfernen des Ethanols. Inkubieren Sie für 10 min bis zum restlichen Alkohol verdampfen lassen.
      10. Schließlich hängen Sie das DNA-Pellet in 100 µL DNase/RNase freies Wasser. Bestimmen Sie die DNA-Ausbeute und Reinheit-DNA mit einem Spektrophotometer.
      11. 1 µg genomische DNA und verdauen mit 10 U ClaI für eine Nacht für die Tn Einstichstelle vor-Klonen zu entfernen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.
        Hinweis: Die Claich Enzym ist eines der stärksten vertretenen Restriktionsenzyme in M. Abscessus Genome (2.173 Restriktionsschnittstellen). Eine Claich Einschränkung Website findet sich auch in der Tn-Sequenz stromaufwärts der Kanamycin Resistenz Kassette Tn mutierte. Die Cla-vermittelten subcloning ermöglicht somit, um die Tn Insertionsstelle zu identifizieren.
    2. Vor-Klonen in ein Plasmid genomic DNA mit der Tn
      Hinweis: Bevor mit den Tn-subcloning in der 2.686 bp pUC19 Ampicillin-resistente Plasmid, fügen Sie ein Claich Einschränkung Standort in die Site mit mehreren Klonen des Plasmids. Die Reihenfolge der das Plasmid pUC19 finden Sie unter diesem Link https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Folgen Hersteller ist Protokoll zu verdauen das Plasmid pUC19 mit EcoRich und HindIII, die ein Fragment von 51 releases bp und ein Fragment von 2635 BP. reinigen den doppelte verdauten Vektor mit einem kommerziellen PCR Reinigung Kit zur Beseitigung der 51 bp Fragment veröffentlicht.
      2. Mix 1 µL (Konzentration 25 Pmol/µL) von zwei komplementären Oligonukleotiden (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' und 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') von 28 bp jeweils die Claich Einschränkung Website und an den Enden der HindIII und EcoR Ich Restriktionsschnittstellen. Bei 100 ° C für 10 min erhitzen Sie und kühlen Sie ab, um sie zu binden.
      3. Die gepaarten Primer von EcoRverdauen ich und HindIII laut Protokoll des Herstellers.
      4. Verbinden von 150 ng EcoRich /HindIII-eingeschränkten pUC19 Plasmid mit unterschiedlicher Konzentration von gekoppelten Primer (25 Pmol/µL, 50 Pmol/µL, 2,5 Pmol/µL) für 1 h bei RT mit 1 U T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 µL. Überprüfen Sie das Klonen von einem anderen enzymatische Verdauung.
      5. Das modifizierte Plasmid mit Clazu verdauen ich für 2 h bei 37 ° C.
      6. Verbinden von 50 ng der Cla-eingeschränkt pUC19Plasmid und 50 ng genomic DNA von Cla verdautich für 1 h bei RT mit 1 U T4 DNA-Ligase in 10 µL.
      7. Fahren Sie mit E. Coli Electrocompetent Bakterien Transformation mit 5-10 µL der Ligatur (2500 V, 200 Ohm, 25 µF). Wählen Sie die Klone auf Agarplatten LB ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Ampicillin die Bakterien tragen Plasmide mit Anteilen von Tn-Sequenzen auswählen.
      8. Wachsen Sie resistente Klone in LB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika Auswahl (50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Ampicillin) über Nacht.
      9. Extrahieren Sie Plasmid DNA. Überprüfen Sie das Vorhandensein des Einsatzes durch enzymatische Einschränkung und 3' Ende der Tn der gestörte gen zu identifizieren, mit einer Oligonukleotid (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') entspricht die letzten 17 Basenpaare der Tn Kanamycin-Sequenz Widerstand-Kassette.
      10. Richten Sie die Sequenz gegen M. Abscessus gehen 06 Belastung durch Ausführen einer Nukleotid-Explosion (BLAST-N).

2. RNA-Extraktion von intrazellulären Mykobakterien für Rnaseq Analyse

Hinweis: Dies dauert 4 Monate für Experimente und 4 Monate für die RNAseq Analyse.

  1. Kokulturen von Amöben-M. Abscessus in Chargen
    Hinweis: Im folgenden Experiment erfolgt kokultur in 50 mL Röhrchen mit Agitation, Bakterien zellkontakte zu bevorzugen.
    1. Wachsen M. Abscessus in 7 H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose in die Mitte-exponentielle Phase bei 120 u/min ergänzt.
    2. Waschen Sie die Bakterien zweimal mit 10 mL des AC-Puffers.
    3. Schätzen Sie die Bakterien-Konzentration durch die Messung der OD600nm (1 OD600= 4 x 108 Mykobakterien). 8,5 x 106 Amöben in 10 mL AC Medium 8,5 x 108 Mykobakterien hinzufügen.
    4. Inkubation für 1 h bei 30 ° C mit sanften Agitation (ca. 80 u/min).
    5. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 253 X g für 12 min. Überstands entfernen und hängen Sie die Zellen in 10 mL AC Puffer. Wiederholen Sie diese zweimal waschen.
    6. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 10 mL AC-Puffer mit 50 µg/mL Amikacin zur Beseitigung extrazellulärer Bakterien und 4 h bei 30 ° C mit sanften Agitation (80 u/min) inkubieren. Waschen Sie die Zellen noch zweimal.
  2. Extraktion von Gesamt-RNS von intrazellulären M. abscessus
    Hinweis: Führen Sie Schritte 2.2.1–2.2.3 unter dem Abzug durch den Einsatz von toxischen Reagenzien.
    1. Nach der endgültigen Wäschen Aufschwemmen der infizierten Amöben in 4 mL kalte Lösung III (Tabelle 3) mit aus dem Stegreif 280 µL der β-Mercaptoethanol, Amöben zu stören. Dies ist der Guanidinium-Thiocyanat (GTC)-Schritt. Pflegen Sie die Suspension auf Eis für 10 min. Zentrifuge der Zelle lysate für 30 min bei 2.396 X g und 4 ° C um die freigesetzten intrazellulären Bakterien pellet.
    2. Entfernen des Überstands und Aussetzen der bakteriellen Pellets in 1 mL kalte Lösung III. Ernten Sie die Bakterien bei 2396 X g für 30 min bei 4 ° C. Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL Extraktionspuffer und Überführung in eine 2 mL Schneckenrohr mit Zirkonium-Perlen (bis 500 µL Abstufung des Rohres). Speichern Sie die Rohre für mindestens 24 h bei-80 ° C.
      Hinweis: Lagerung in der Lyse-Reagenz ermöglicht die Inaktivierung von RNases und Zelle Auflösung.
    3. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, Proben auf Eis Auftauen und lösen sie mit einem Homogenisator durch Ausführen von zwei Runden bei 6.000 u/min für 25 s, gefolgt von einer Runde bei 6.000 u/min für 20 s mit einem 1 min Inkubation auf Eis zwischen jeder Runde.
    4. Um die Probe abkühlen, inkubieren sie für 10 min auf Eis. Dann fügen Sie 200 µL Chloroform in Isoamyl Alkohol verdünnt. Nach dem aufschütteln Zentrifugieren die Proben 1 min für 15 min bei 16.500 x g und 4 ° C.
    5. Die wässrige Phase 0,8 mL kaltem Isopropanol hinzu und inkubieren Sie die Proben für 2 – 3 h bei 20 ° C. Zentrifugieren Sie Proben für 35 min bei 16.500 x g und 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    6. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 500 µL kaltem 70 % igem Ethanol (nicht zu verwechseln).
    7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 X g für 10 min, das Ethanol zu entfernen. Aspirieren Sie die Lösung und Trocknen in einem zentrifugalen Konzentrator.
    8. Sobald getrocknet, Aufschwemmen der Pellets in 100 µL DNase/RNase freies Wasser.
      Hinweis: Proben müssen zweimal DNasen DNA Verunreinigungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers entfernen behandelt werden.
    9. Bewerten der Integrität der RNA auf einem Agarosegel und bestätigen durch die Messung der RNA-Integrität-Anzahl (RIN) und die ribosomale Verhältnis mit einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Methode.
      Hinweis: Der RIN berücksichtigt die gesamte elektrophoretische Spur. Die RIN Softwarealgorithmus ermöglicht die Klassifizierung von Gesamt-RNS, basierend auf eine Nummerierung von 1 bis 10, wobei 1 die meisten degradierten Profil und 10 ist der am besten erhaltenen. Zum Fortsetzen der cDNA Bibliothek Vorbereitung muss die RINs über 8 und die ribosomale Verhältnis [28 s/18] so hoch wie möglich, den idealen Wert 2, je nach Organismus und seine Besonderheiten.
    10. Lagern Sie RNA-Proben bei-80 ° C bis zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek für die Sequenzierung.
  3. Vorbereitung der cDNA-Bibliothek
    1. Zum Fortsetzen der Bibliothek Vorbereitung verwenden Sie eine handelsübliches cDNA Synthese Kit (Table of Materials) mit der Hersteller-Protokoll.
    2. Überprüfen Sie die Bibliothek für Konzentration und Qualität auf einem DNA-Chip.
      Hinweis: Genaue Quantifizierung kann sensible Leuchtstoff-basierte Quantifizierung Tests durchgeführt werden.
  4. Bibliothek-Sequenzierung
    1. Normalisieren Sie die Proben bis 2 nM und gehen Sie zum Multiplexen entsprechend der Organisation des Flows Zelle.
    2. Denaturieren die Proben in einer Konzentration von 1 nM mit 0,1 N NaOH für 5 min bei RT
    3. Verdünnen Sie die Proben an 22:00. Laden Sie jede Probe auf die Messzelle an 22:00.
    4. Sequenzierung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung System große Genomics können fortsetzen. Hier wurde der Lauf einer SRM-Ausführung (SR: einzelne lesen, PE: gepaart Ende liest, M: gemultiplext Proben) 51 Zyklen mit 7 Index-Grundlagen zu lesen.
    5. Die Qualität der Sequenzierung mit dem externen FastQC Programm13zu bewerten.
    6. Nach dem Trimmen des Adapter-Sequenzen, fahren Sie mit lesen Sie Achsen gegen ein Referenz-Genom. Richten Sie sich gegen die eukaryotic Zelle Genom zu bewerten Kontamination der Probe und wenn nötig, gehen mit dem Beschneiden von der nicht-bakteriellen liest.
  5. Statistische Analyse
    1. Verschiedene Software-Programme online verwenden, um Gruppen von differentiell exprimierten Genen definieren: R-Software, Bioconductor Pakete einschließlich DESeq2 und das PF2tools-Paket (Version 1.2.12) entwickelt, die auf der Plattform "Transkriptom et Epigénome" (Pasteur Institut, Paris).

Ergebnisse

M. Abscessus hat die Fähigkeit zu widerstehen und die bakteriziden Antworten von Makrophagen und Umwelt Einzeller wie Amöben zu entkommen. M. Abscessus drückt Virulenzfaktoren bei Kontakt mit Amöben, gewachsen, wodurch es mehr virulent in Mäusen4. Das erste Ziel dieser Methoden war, die im M. Abscessus , so dass seine überleben und die Vermehrung in Amöben Gene zu identifizieren.

Diskussion

Das Verhalten von M. Abscessus ist das Verhalten der pathogenen SGM wie M. Tuberkulose viel ähnlicher als jede andere Mykobakterien, RGM2angehören. Das zentrale Element in der Pathogenität der SGM ist ihre Fähigkeit zu überleben oder sich sogar in Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen vermehren.

M. Abscessus hat gewisse genomische Vorteile erworben, dargestellt durch die gesamtsequenz der Genom-

Danksagungen

Wir erkennen deutlich PR. e.j. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) für das kostbare Geschenk des mutierten Bibliothek und Dr. Ben Marshall (Faculty of Medicine, University of Southampton, UK) für die Korrekturen des Manuskripts. Für ihre finanzielle Unterstützung (RF20150501377) wird stark der französischen Patientenverband für Mukoviszidose "Vaincre la Mucoviscidose" und "L'Association Gregory Lemarchal" anerkennen. Wir danken auch der nationalen Agentur für Forschung (ANR-Programm DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) und der Region Ile de France (Domaine d'Intérêt Gewalt Maladies Infectieuses et Emergentes) für die Finanzierung des postdoctoral Fellowship V.L-m. L. L. ist ein Doktorand aus der "Ministère de L'Enseignement Supérieur et De La Recherche".

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ Equipment
24-well platesThermofisher11874235
96-well platesThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BioanalyzerAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop spectrophotometer 2000Thermofisher
QuBit fluorometerThermofisherQ33226
zirconium beads/silica beadsBiospec products11079101ZBeads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii ATCC30010strain
Amikacin Mylan150927-Apowder
B-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250solution
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granular anhydrous
Chloroform Fluka25666solution
ClaI enzymeNew England BiolabsR0197Senzyme
Columbia agar Biomerieux4304190 mm
D-GlucoseSigma-AldrichG8270 powder
DMEM Thermofisher11500596medium
DNase and RNase free water Invitrogen10977-035solution
E. coli electrocompetent Thermofisher18265017bacteria
EDTASigma-AldrichE4884powder
Escherichia coli Clinical isolatepersonal stockbacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf SerumGibco10270serum
GlycerolSigma-AldrichG5516solution
Guanidium thiocyanate EuromedexEU0046-Dpowder
Isopropanol Sigma-AldrichI9516solution
J774.2 macrophagesSigma-AldrichJ774.2Strain
kanamycin Sigma-Aldrich60615powder
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobasic, anhydrous
LB liquid medium Invitrogen12795-027powder
LysozymeRoche10837059001powder
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (cryotubes with beads)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 mediumSigma-AldrichM0428powder
Middlebrook 7H9 mediumThermofisher11753473powder
Müller-Hinton agarBiorad3563901powder
N-Lauryl-sarcosineMerckS37700 416powder
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Phenol/chloroforme Sigma-Aldrich77617solution
Proteinase KThermofisherEO0491powder
proteose peptoneBD211684enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmidNew England Biolabs54357plasmid
SDS  20%Biorad1610418solution
Sodium citrateCalbiochem567446powder
ThioureaSigma-Aldrich88810powder
TrisSigma-Aldrich154563powder
Trizol Thermofisher12044977solution
Tween 80Sigma-AldrichP1754 solution
Yeast extract BD212750
Kit
AMBION DNase kit Thermofisher10792877kit
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit ThermofisherK0503kit
PureLink PCR Purification kitInvitrogenK310001kit
Quant-It" assays kitThermofisherQ33140/Q32884kit
T4 DNA ligase InvitrogenY90001kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kitIllumina15032611kit

Referenzen

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