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요약

여기, 선물이 식-진 균 abscessus 상호 작용을 공부 하는 두 개의 프로토콜: 세균 세포내 결핍 및 RNA에서 세균 세포내 transcriptome 결정 transposon 돌연변이 라이브러리의 심사 시퀀싱. 두 방법 모두 게놈 장점과 transcriptomic 적응 세포내 박테리아 체력 향상에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

초록

인간 대 식 세포에 의해 식 균 작용을 저항 하는 기능 및 이러한 셀 안에 번 식 능력은 다른 마저 mycobacteria에서 진 균 abscessus 차별화. 이러한 독성 특성 기본 구조 폐 질환, 낭 성 섬유 증, 기관지 확장 증, 결핵 등으로 취약 한 호스트에서 특히 병원 성 M. abscessus 를 렌더링합니다. 어떻게 환자 M. abscessus 감염 될 불분명 남아 있습니다. 많은 mycobacteria 달리 M. abscessus 환경에서 찾을 수 없습니다 하지만 amoebae, M. abscessus에 대 한 잠재적인 저수지를 나타내는 환경 식 세포 안에 있는 수 있습니다. 실제로, M. abscessus amoebal 식 균 작용에 저항 이며 내 아메바 인생 감염의 실험 모델에서 M. abscessus 독성을 증가 것으로 보인다. 그러나, 약간 그 자체에 M. abscessus 독성에 대 한 알려져 있다. M. abscessus 세포내 생활 이점이 부여 하는 유전자를 해독, M. abscessus transposon 돌연변이 라이브러리의 심사는 개발 되었다. 병렬로 amoebae 공동 문화 후 세포내 Mycobacteria에서 RNA 추출의 방법 개발 되었다. 이 메서드는 검증 되었고 전체 M. abscessus 의 시퀀싱을 허용 세포; 내부 transcriptomes 처음으로, 세포내 생활에 적응 하는 M. abscessus 에 글로벌 보기를 제공합니다. 두 방법 모두 인간의 기도 식민지로 M. abscessus 있도록 M. abscessus 독성 요인에 대 한 통찰력 주세요.

서문

속 진 균 종 무해 마저 유기 체에서 주요 인간 병원 체에 이르기까지 포함 되어 있습니다. 결핵균, 진 균 marinum 진 균 ulcerans 등 잘 알려진 병원 성 종 느린 성장의 하위 그룹에 속하는 mycobacteria (SGM). 반면, 급속 한 성장 비율 mycobacteria (RGM) 한 천 매체에 7 일 이내에 보이는 식민지를 형성 하는 그들의 기능에 의해 특징입니다. RGM 그룹 이상 180 종, 비 병원 성 마저 mycobacteria 주로 구성 되어 있습니다. RGM 그들의 호스트와 상호 작용에 대 한 연구는 주로 진 균 smegmatis 에 초점을 맞춘을 이러한 mycobacteria 대 식 세포의 살 균 작용에 의해 빠르게 제거 됩니다 설명.

진 균 abscessus 병원 성 인 간에 게는 드문 RGM 중 하나 이며 다양 한 피부 및 연 조직 감염에서 폐와 전파 감염에 이르기까지 감염에 대 한 책임입니다. M. abscessus 가 간주, 진 균 avium, 함께 낭 성 섬유 증 환자1주 mycobacterial 병원 체.

M. abscessus 에 수행 하는 다양 한 학문이 진이 균은 세포내 병원 체, 세포와 폐에 RGM에서 일반적으로 관찰 되지 않는 피부 섬유 아 세포의 살 균 응답 살아남을 수 있는 처럼 동작 표시 2 , 3 , 4. M. abscessus 게놈 분석 환경 미생물 토양 접촉에서 일반적으로 발견 하는 대사 경로 확인 했다, 식물 및 수 중 환경, 무료 amoebae는 종종 제시5. 그들은 또한 M. abscessus 수집 수 유전 교환에 유리한 틈새에서 수평 한 유전자 이동에 의하여 아마 인수 마저 및 비 병원 성 RGM에 없는 여러 가지 독성 유전자에 어우러진 시연 했다 다양 한 아메바 내성 박테리아입니다.

실험적으로, 첫 번째 눈에 띄는 결과 중 하나는 M. 결핵6에 관해서는 뿐만 아니라 세포에서 세포내 성장의 M. abscessus 관찰 했다. M. abscessus 또한 phagosome apoptosis, autophagy, 감염2에 세포질 저항의 세 가지 필수적인 메커니즘 산성화 저항. 그것은 심지어 M. abscessus 는 phagosome cytosol, 세균성 곱하기2를 선호 수 있습니다 더 많은 영양분이 풍부한 환경 간의 즉각적인 통신을 설정할 수가 표시 되었습니다. 아주 작은 게놈 장점 M. abscessus 소유 또는 세포내 환경에서 생존을 허용 하는 인수에 대 한 알려져 있다. 아메바 coculture 진 균 massiliense7,8로 많은 새로운 아메바 내성 세균의 분리를 허용 하는 효율적인 방법입니다. Amoebae 내에서 증식 하는 능력의 M. abscessus4증가 독성 부여 수 쥐에 M. abscessus 에의 aerosolization 모델에 관찰 되었다. 1 개의 가설은 이다 M. abscessus phagocytic 세포, 다른 비 병원 성 RGM 다른에서 살아남기 위해이 환경 내에서 발생 하는 유전 특성을 개발 했다. 이러한 인수 능력을 확산과 인간의 호스트의 독성 부탁 수 있습니다.

이 보고서에는 도구와 amoebae 환경에서 살아남으려면 M. abscessus 에 수 여 하는 게놈 장점 강조 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적에 대 한 M. abscessus transposon 돌연변이의 심사는 처음 설명, Acanthamoeba castellanii 유형 변형, 세포 성장에 대 한 돌연변이 결함 식별 수 있는에. 대 식 세포에서 두 번째 심사는이 결함 인간의 호스트에서 지속 되는지 확인 하, 또한 보고 됩니다. 둘째, 이해 하는 메커니즘은 M. abscessus phagocytic 생활 적응에 무력화 세포 및 동물의 호스트, 특별히 M. abscessus 에 대 한 적응 방법에에서 그것의 독성은 증가 개발, 공동 문화 후 amoebae 존재 하는 내부 amoebal 박테리아에서 총 RNA 추출 허용. 결과적으로, 세포내 생명에 필요한 M. abscessus 유전자의 포괄적인 보기 개발 되었다.

프로토콜

1. 라이브러리 심사

  1. 테네시 돌연변이 도서관의 건설
    1. Transposon 라이브러리를 가져옵니다.
      참고:이 실험을 위해 transposon 돌연변이 라이브러리 E.J. 루빈, 하버드 대학 공중 보건의, 보스톤, 미국에서 얻은 했다. 도서관은 phagemid M. abscessus 단일 Tn의 임의 삽입 허용에 도입 된는 M. abscessus 복잡 한 (M. abscessus subsp. massiliense)의 부드러운 임상 스트레인 (43S)에서 건설 되었다 따 디뉴클레오티드 (91,240 M. abscessus 게놈 시퀀스 TA)에. 대 한 자세한 내용은 참조의 루빈 외. 9 및 Laencina 외. 10.
  2. 라이브러리 및 격판덮개에 M. abscessusTn 돌연변이의 보존의 적정
    참고:이 1 주일 걸립니다.
    1. 라이브러리는 얼음에 녹여 물 (10-1 10-15) 1 mL에 직렬 희석을 수행 하 여 세균 농도 결정 합니다. 각 희석 250 mg/mL 대와 7 H 11 한 천 매체를 포함 하는 배양 접시에 한 방울 접시 3-4 일 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.
      참고: 여기, 1011 박테리아/mL의 적정 발견 했다.
    2. 라이브러리의 농도 결정 한 후 라이브러리의 25% 글리세롤-물 10 mL에 3000 박테리아/mL의 최종 농도를 희석. 약 수 각 관에서 도서관의 1 mL와 10 cryotubes에서 라이브러리. -80 ° c.에 aliquots 저장
    3. 때 사용 하 고, 얼음에 희석된 라이브러리의 한 약 수를 해 동 하 고 37 ° c.에 외피의 3-4 일 후 200 ~ 300 개별 식민지를 복구 하는 도서관의 100 µ L 10 평방 뮬러-힌 튼 (MH) 한 천 배지 (크기 12cm)를 추가 준비
    4. 살 균 이쑤시개, 전송 7 H의 200 µ L 9 매체와 0.2% 글리세롤, 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보완 가득 96 잘 접시에 개별 식민지 (60 x 96 잘 접시에 약 6000 식민지)와 떨고 없이 5 일 동안 37 ° C에서 품 어.
    5. 7 H 9의 100 µ L를 포함 하는 96 잘 접시를 문화 (1.2.4 단계) 100 µ L를 전송 40% 글리세롤과 중간. -80 ° c.에 정렬된 라이브러리를 저장
    6. 1.2.3 단계를 반복 합니다. 1.2.5 하. 10000 개별 클론까지 라이브러리의 나머지와 함께 (약 100 x 96 잘 접시와 30 수소 접시) 복구 됩니다.
  3. Amoebae의 준비
    1. 실내 온도 (RT) 셀 라인11의 확대를 위한 PYG 매체 (표 1) 30 mL에 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 아메바 Acanthamoeba castellanii (AC) 문화.
      참고: 수많은 소화 그들으로 큰 접착 세포에서 성숙한 trophozoites 현미경에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 시간을 두 배로 셀 25 헤 셀 수 있었다 증폭 매 3 일 마다 1/3의 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 초기 문화를 확산 하 여 추정 된다.
    2. 25 mL 피 펫을 PYG 매체를 제거 합니다. AC 버퍼 (표 2), 모든 탄소 또는 질소 소스12를 포함 하지 않는의 10 mL로 세포 세척. 두 번 더 세척을 반복 합니다.
      참고: 없습니다 탄소 또는 질소 소스를 포함 하는 AC 버퍼 mycobacteria의 extracellular 성장을 방지 합니다. 이 최소 매체 amoebae의 encystment에 지도 한다. 이 제한, 열 비활성화 대장균 amoebae를 기판 (1.4 단계)으로 추가 했다 고 문화를 매우 짧은 시간 (48 h 돌연변이 검사에 대 한) 및 RNAseq 실험 4 h 또는 16 h 문화 승진 했다. 또는, 하지만 농축이 매체를 사용 하 여 PYG 매체 (보통 10%).
    3. 조직 배양 플라스 크의 단일 활발 한 악수 술병의 바닥에서 아메바를 분리 합니다.
    4. 수 셀 셀 농도 5 × 105 amoebae/mL를 조정 하려면 hemocytometer AC 버퍼에 희석.
  4. 준비의 열 활동 되지 않 ㄴ 대장균 박테리아 감염 후 아메바를 피드
    1. 37 ° c.에 하룻밤 100 ml Luria 국물 (파운드)의 글리세롤 재고에서 대장균 임상 격리 스트레인 성장
    2. 50 mL 튜브에 10 분 동안 1,835 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 수확. 폐기는 상쾌한. 10% 글리세롤-물 10 mL와 펠 릿 resuspend 두 번 더 세척을 반복 합니다.
    3. 10% 글리세롤-물 5 mL와 펠 릿 resuspend 1.5 mL 튜브에 aliquot 0.5 mL입니다. 수행 하는 직렬 희석 파운드 한 천 배지에서 희석을 추가 하 여 박테리아/mL의 금액을 결정 합니다. -80 ° c.에 aliquots 저장
    4. 아메바 감염 전에 하루 한 약 수 얼음에 녹여 고 열 살인 튜브 60 분 동안 70 ° C에서 배양 하 여 계속 합니다.
      참고: 파운드 한 천 배지를 37 ° c.에 하룻밤 사이에 비활성된 박테리아의 100 µ L를 도금 하 여 비활성화 확인 아니 식민지 문화의 1 박 후 표시 됩니다.
    5. 열 살해 박테리아 AC 버퍼의 50 µ L에 107 박테리아의 농도를 희석 하 고 더 이상 1 주일에 4 ° C에서 희석된 박테리아를 저장 합니다.
  5. Amoebae-M. abscessus 테네시 돌연변이의 공동 문화: 처음 화면
    참고:이 6000 돌연변이의 심사에 대 한 3-4 개월 걸립니다.
    1. 5 x 104 amoebae/잘 AC 버퍼의 100 µ L에서 96 잘 접시에 확산. 32 ° C에서 1 시간 흔들어 없이 품 어. 우물에 부동 아메바 trophozoïtes 시간을 허용 합니다.
      1. 잠복기, 하는 동안 1 시간에 대 한 얼음에 박테리아를 녹여.
    2. 전자 멀티 채널 피 펫과 해 동된 박테리아 문화 5 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시 테네시 돌연변이 주식에서에서 6000 개별된 클론 주위 1.5 헤 스크린에 대 한 감염.
      참고:는 나는 알려진 프로토콜;의이 단계에서 그러나, 테네시 돌연변이 포함 하는 모든 96 잘 접시는 정확 하 게 같은 방식으로 재배 했다. 이 첫 번째 화면 inoculum 밀도 변화를 고려 하지 않고 세포내 결핍 돌연변이 신속 하 게 식별 하는 것을 목표로.
    3. 감염의 1.5 h 후 96 잘 접시 살 균 gauzes 연기 후드 AC 매체를 제거 하는 소독된 금속 트레이에 배치에 반전. AC 매체의 200 µ L로 리필. 이 세척 두 번 더 반복 합니다.
    4. 나머지 extracellular mycobacteria 제거를 100 µ g/mL amikacin와 보충 하는 신선한 매체의 200 µ L를 추가 합니다.
    5. 3 추가 빨 래와 함께 진행 하기 전에 2 시간에 대 한 품 어 (단계 1.5.3에서에서와 같이). 세척, 후 AC 버퍼의 200 µ L에서 50 µ g/mL amikacin와 문화를 유지 합니다.
    6. 5 x 107 열 비활성화 (1.4 단계)에서 대장균 박테리아 감염과 amoebae의 encystment를 방지 하기 위해 모든 24 h의 끝에 추가 합니다.
    7. 공동 문화 48 h 후 10 µ L 10 %SDS (라우릴 황산 나트륨)의 각 음을 추가 하 여 세포를 lyse와 32 ° c.에 30 분 동안 품 어 직렬 희석 진행 합니다 고 컬럼비아 한 천 배지 포함 하는 것은 세포내 mycobacteria의 수 평가 5% 양 혈액 (COS 접시)에 추가 합니다. 접시는 parafilm으로 밀봉 하 고 37 ° c.에 품 어
    8. 때 식민지 3-4 일 후, 사진 접시 한 접시에 표시 하 고 세균성 식민지의 가장 낮은 번호와 함께 입금을 관찰 하 여 세포 성장을 위한 장애인 돌연변이 식별 합니다.
      참고: 모양, 높이 또는 식민지 (그림 1A)의 밀도 대 한 상관 하지 않습니다. 136/6000 돌연변이 발견 됐다.
  6. Amoebae-M. abscessusTn 돌연변이의 공동 문화: 첫 번째 화면 동안 확인 된 돌연변이의 두 번째 화면
    참고:이 2 주 걸립니다. 두 번째 화면 136 감쇠 돌연변이 얻은 첫 번째 화면 후 주사 하는 박테리아의 수를 정확 하 게 및 세포내 생존 박테리아 2 일 감염 된 후 수 척도를 함께 수행 되어야 합니다.
    1. 50 mL에 각 영향 을된 돌연변이의 1 식민지 성장 튜브 가득 7 H 20 mL 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충. 허용 지 수 단계에 도달 하는 박테리아 (0.6 < OD < 0.8).
    2. 원심 분리 (1,835 x g 10 분 동안) AC 매체에 의해 문화를 씻어. 폐기는 상쾌한. 반복이 씻어 두 번의 7 H 20 mL와 함께 더 많은 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충 합니다.
    3. AC 버퍼의 5 mL에 박테리아 resuspend
    4. 콜로 니 형성 단위 (CFU) 돌연변이의 농도 결정 합니다. 24-잘 접시에서 두 첫 번째 행에 물 1 mL를 추가 합니다. 첫 번째 잘을 100 µ L 세균성 정지를 추가 합니다. micropipette와 세 번 혼합 합니다. 그런 다음, 발음 100 µ L와 두 번째 입금 잘.
    5. 새로운 팁 잘 12까지 세 번째, 등 두 번째 우물에서 1.6.4 단계를 반복 합니다.
    6. 10-12 희석의 30 µ L 발음 하 고 COS 접시에 추가 합니다. 다른 희석에 대 한 반복 합니다.
    7. Parafilm으로 COS 플레이트를 포장 하 고 37 ° c.에 3-4 일 동안 품 어 식민지를 계산 하 여 농도 결정 합니다.
    8. AC 공동 문화 매체의 1 mL에 잘 당 5 x 104 아메바와 24-잘 접시에 3 중에서 위에서 설명한 대로 공동 문화 분석을 수행 합니다. 10의 감염 (MOI)의 다양성으로 예방.
    9. 1.5.7 단계에서 설명한 대로 공동 문화 48 h 후 세포 세포의 용 해와 함께 진행 합니다. 직렬 희석 물 (10-1 10-6)에서 수행 하 고 COS 번호판 30 µ L를 추가 합니다. CFU 계산 진행 하기 전에 37 ° C에서 4 일 동안 격판덮개를 품 어.
      참고:이 두 번째 화면 후 136 돌연변이의 60은 보존 됩니다.
    10. 돌연변이 세포 안에 그들의 생존에 대 한 영향을 저장 합니다. 글리세롤 (마지막 20%)을 사용 하 여 또는 상용 솔루션 및 장기 보존을 선호 하 고 미래 접종 촉진-80 ° c.에 저장 microbeads cryotube 파운드 매체를 포함 하는 cryotube에 식민지를 추가
    11. 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 체 외에서 돌연변이 성장 평가 nm 매 2 일.
      1. 1 성장 50 mL 튜브에 영향 을된 각 돌연변이의 식민지 가득한 7 H 20 mL 9 매체와 0.2% 글리세롤 1% 포도 당, 250 mg/mL 대의 보충. 허용 지 수 단계에 도달 하는 박테리아 (0.6 < OD < 0.8) 활동 시작을 0.01 OD를 조정 하기 전에.
      2. 생체 외에 성장 결함 결핍 돌연변이 세포의 집합에서 WT 스트레인과 비교할 때 돌연변이 제외 합니다.
  7. 세포-M. abscessus 테네시 돌연변이 내 아메바 인생에 대 한 결함의 공동 문화
    참고:이 1 개월 걸립니다.
    1. 풍부한 매체, DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)의 보충의 1 mL에 24-잘 접시의 당 5 x 104 J774.2 murine 세포 확산. 대 식 세포 접착 있도록 37 ° C, 5% CO2 에서 24 h에 대 한 번호판을 품 어. 3 복제를 제공 합니다.
    2. 감염을 수행 합니다. 10, 100 µ L의 볼륨의 10% fcs DMEM에 희석의 나와 테네시 돌연변이 예방
    3. 감염의 3 h 후 DMEM (진공 펌프를 사용할 수 있습니다.)의 1 mL와 함께 3 개의 빨 래를 수행 합니다. 다음 1 h 나머지 extracellular mycobacteria 제거를 위해 (10% fcs DMEM)에 250 µ g/mL amikacin와 대우.
      1. 3 추가 DMEM 1 mL로 세척, 후 extracellular mycobacterial 곱셈을 방지 하기 위해 1 mL의 최종 볼륨을 (10% fcs DMEM)에 250 µ g/mL amikacin에 문화를 유지 합니다.
    4. 공동 문화, 후 72 h 매체를 제거 하 고 냉 수의 1 mL을 추가 하 여 대 식 세포를 lyse. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
    5. 세포내 박테리아의 수를 평가 하는 COS 접시에 CFU 분석을 수행 합니다.
      1. 24-잘 접시에 두 개의 첫 번째 행에 물 1 mL를 추가 합니다. 첫 번째 우물을 공동 세포 lysate의 100 µ L를 추가 합니다. micropipette와 세 번 혼합 합니다. 100 µ L를 발음 하 고 두 번째에 그들을 잘 입금.
      2. 새로운 팁 잘 12까지 세 번째, 등 두 번째 우물에서 희석을 반복 합니다. 그리고 10-12 희석의 30 µ L 발음 COS 접시에 그것을 추가 합니다.
      3. 다른 희석에 대 한 반복 합니다. Parafilm으로 COS 플레이트를 포장 하 고 관찰 하 고 식민지를 카운트 3-4 일을 기다립니다.
  8. 식별 및 M. abscessus 돌연변이에 테네시 의 삽입의 사이트의 시퀀싱
    참고:이 60 돌연변이 대 한 1.5 개월 걸립니다.
    1. 식별의 게놈 추출 M. abscessus 돌연변이
      1. 7 H 9의 20 mL 50 mL 튜브에 돌연변이 성장 매체 보충 0.2% 글리세롤, 1% 포도 당과 대 지 수 단계 250 mg/mL (OD600= 0.8).
      2. 문화 (2,396 x g, 5 분) 10 mL를 수확. 폐기는 상쾌한. 솔루션의 500 µ L에서 박테리아를 일시 중단 (25% 자당, 50 mM Tris pH 8, 10mg/mL lysozyme, 40mm thiourea). 나사 모자 2 mL 튜브에 솔루션을 전송 및 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
      3. 솔루션 II (25% 자당, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA)의 500 µ L를 추가 합니다. Pipetting 후 고 아래 5-10 배, 튜브에 500 µ L의 볼륨까지 지르코늄 구슬 추가.
      4. 세포 세포의 용 해는 균질 화기로 진행 (3 x 6000 rpm, 45 s) 각 라운드 사이 얼음에 1 분 부 화와.
      5. 5 µ L 20 mg/mL 가수분해 K의 (최종 100 µ g/mL)을 추가 하 고 55 ° c.에 하룻밤 샘플을 품 어
      6. 증기 두건에서 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 추위의 1 mL를 추가 합니다. RT 및 16500 x g 30 분 동안 원심 분리를 진행 하기 전에 vortexing에 의해 샘플을 믹스.
      7. 원심, 후 수성 단계를 복구 하 고 후드 아래 찬 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 합니다. 16500 x g 30 분 수성 단계 다시 복구에서 샘플 원심
      8. 증기 두건에서 복구 된 수성 단계로 RT 소 프로 파 놀의 0.7 볼륨을 추가 합니다. DNA 강수량 및 실시간 5 분을 품 어 튜브를 천천히 반전 다음 16500 x g 및 실시간에서 10 분 원심 분리기
      9. 상쾌한을 제거 하 고 후드 아래 70% 에탄올 500 µ L와 펠 릿을 세척. 에탄올을 제거 하기 전에 RT에 16500 x g 에서 10 분 동안 튜브를 원심. 나머지 알코올 증발 수 있도록 10 분 동안 품 어.
      10. 마지막으로, DNase/RNase 무료 물 100 µ L에서 DNA 펠 릿을 일시 중단 합니다. 분 광 광도 계와 DNA 수율 및 순도 DNA를 확인 합니다.
      11. 하위 Tn 삽입 사이트 복제 1 박 10 U ClaI 의 genomic DNA와 다이제스트의 1 µ g를 제거 합니다. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.
        참고: Cla나 효소 M. abscessus 게놈 (2,173 제한 사이트)에서 가장 높은 대표 제한 효소 중 하나입니다. Cla나 제한 사이트 또한 테네시 돌연변이의 대 저항 카세트의 테네시 시퀀스 상류에서 발견 된다. 따라서, Cla나 중재 subcloning Tn 삽입 사이트를 식별할 수 있습니다.
    2. 하위 테네시를 포함 하는 게놈 DNA의 플라스 미드에 클로닝
      참고: 이전 테네시와 진행- Cla추가 2,686 bp pUC19 암 피 실린 내성 플라스 미드, subcloning 나 플라스 미드의 다중 복제 사이트에 제한 사이트. 이 링크 https://www.addgene.org/50005/sequences/에 pUC19 플라스 미드의 시퀀스를 찾을 수 있습니다.
      1. 따라 제조 업체의 프로토콜 소화 EcoR와 pUC19 플라스 미드 나와 뒷 다리III, 51의 조각 출시 혈압과 2635 bp.의 조각 정화는 51를 제거 하는 상업 PCR 정화 키트와 함께 이중 소화 벡터 혈압 단편을 발표 했다.
      2. 믹스 1 µ L (농도 25 pmol / µ L) 28의 두 개의 상호 보완적인 oligonucleotides (5 'AGCT 타 타 AGATCT 타 타 ATCGAT TATA3' 및 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT 문신 A3')의 혈압 각 Cla를 포함 하 나 제한 사이트와 끝 뒷 다리III에와 EcoR 난 제한 사이트. 10 분 동안 100 ° C에가 열 하 고 그들을 바인딩하기 냉각 하십시오.
      3. EcoR에 의해 쌍된 뇌관 소화 나 고 뒷 다리제조 업체의 프로토콜에 따라 III.
      4. 150 선 EcoR의 ng 나 /뒷 다리III 제한 pUC19 플라스 미드 20 µ L. 마지막 볼륨에서 1 U의 T4 DNA 리가와 RT에 1 h 짝된 뇌관 (50 pmol / µ L, 25 pmol / µ L, 2.5 pmol / µ L)의 다른 농도와 다른에 의해 복제 확인 효소 소화입니다.
      5. Cla와 수정 된 플라스 미드를 소화 2 h 37 ° c.에 대 한 나
      6. 50 선 Cla나 제한 된 pUC19의 ng플라스 미드 및 50 ng genomic DNA의 Cla에 의해 소화10 µ L에 1 U의 T4 DNA 리가와 RT에 1 시간을 위한 나.
      7. 결 찰 (2500 V, 200 ω, 25 µ F)의 5-10 µ L로 대장균 electrocompetent 박테리아 변환으로 이동 합니다. 50 µ g/mL 대와 테네시 시퀀스의 부분을 가진 플라스 미드 베어링 박테리아 선택 하 50 µ g/mL 암 피 실린 보충 파운드 한 천 배지에서 클론을 선택 합니다.
      8. 하룻밤 파운드 액체 매체와 적절 한 항생제 선택 (50 µ g/mL 대 및 50 µ g/mL 암 피 실린) 저항 클론 성장 합니다.
      9. 플라스 미드 DNA를 추출 합니다. 제한 효소에 의해 삽입의 존재를 확인 하 고 시퀀스 테네시 대의 마지막 17의 기본적인 쌍에 해당 하는 oligonucleotide (5' 3' TTGACGAGTTCTTCTGA) 방해 유전자를 식별 하는 테네시 의 3' 끝 저항 카세트입니다.
      10. 뉴클레오티드 폭발 (폭발-N)를 수행 하 여 M. abscessus 가 06 스트레인에 대 한 시퀀스를 맞춥니다.

2. Rnaseq 분석에 대 한 세포내 Mycobacteria의 RNA 추출

참고:이 4 개월 실험에 대 한 RNAseq 분석에 대 한 4 개월 걸립니다.

  1. Amoebae-M. abscessus 일괄 처리로 공동 문화
    참고: 다음 실험에 공동 문화 셀 연락처에 박테리아를 선호 하는 동요와 함께 50 mL 튜브에서 수행 됩니다.
    1. 7 H 9에에서 M. abscessus 성장 매체 0.2% 글리세롤, 120 rpm 중반 지 수 단계에 1% 포도 당으로 보충.
    2. AC 버퍼의 10 mL로 두 번 박테리아를 씻으십시오.
    3. OD600nm 를 측정 하 여 박테리아 농도 추정 (1 OD600= 4 × 108 mycobacteria). 8.5 108 mycobacteria x 8.5 x 106 amoebae AC 매체의 10 ml에서를 추가 합니다.
    4. 부드러운 동요 (약 80 rpm)와 30 ° C에서 1 시간에 품 어.
    5. 253 x g 12 분 제거는 상쾌한에 centrifuging 여 세포를 수확 하 고 AC 버퍼의 10 mL에 셀 중단. 이 세척 두 번 더 반복 합니다.
    6. 포함 하는 extracellular 박테리아를 제거 하 고 부드러운 동요 (80 rpm)와 30 ° C에서 4 h에 대 한 품 어 50 µ g/mL amikacin AC 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 셀을 두 번 다시 세척.
  2. 세포내 M. abscessus 에서 총 RNA의 추출
    참고: 독성 시 약의 사용으로 인해 연기 후드 아래 단계 2.2.1–2.2.3을 수행 합니다.
    1. 마지막 빨 래 후 차가운 솔루션 III (표 3)의 4 mL에 감염된 amoebae β-mercaptoethanol amoebae 방해의 임기 280 µ L 함께 resuspend. 이것은 guanidinium 안산 (GTC) 단계 이다. 2,396 x g 30 분 및 4 ° C에 대 한 lysate 출시 세포내 박테리아를 펠 렛을 10 분 분리기는 셀에 대 한 얼음에 서 스 펜 션을 유지 합니다.
    2. 상쾌한을 제거 하 고 차가운 솔루션 III의 1 mL에 세균성 펠 릿을 일시 중단. 2396 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 박테리아 수확 추출 버퍼 및 지르코늄 구슬 (500 µ L 튜브의 그라데이션)까지 포함 된 2 mL 나사 튜브로 전송의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 적어도 24 h-80 ° c.에 대 한 튜브를 저장
      참고: 스토리지 세포 시 약에서 RNases 및 셀 해산의 비활성화를 허용합니다.
    3. 때 사용 하기 위해 준비 얼음 샘플을 녹여 고 25 6000 rpm에서 2 라운드를 수행 하 여 한 균질 화기와 그들을 lyse s, 20 6000 rpm에서 한 라운드 뒤 각 라운드 사이 얼음에 1 분 외피와 s.
    4. 샘플을, 10 분 동안 얼음에 그들을 품 어. 클로 프롬 isoamyl 알콜에 희석의 200 µ L를 추가 합니다. Vortexing 후 1 분 샘플 16500 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심
    5. 수성 단계에 찬 소 프로 파 놀의 0.8 mL을 추가 하 고 2-3 h 20 ° c.에 대 한 샘플을 품 어 35 분 16500 x g 와 4 ° c.에 대 한 샘플을 원심 폐기는 상쾌한.
    6. 차가운 70% 에탄올 500 µ L을 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 (혼합 하지 마십시오).
    7. 에탄올을 제거 하려면 10 분 16500 x g 에서 샘플 원심 솔루션을 발음과 원심 집중 장치에 건조 합니다.
    8. 일단 건조, DNase/RNase 무료 물 100 µ L에 산 탄을 resuspend.
      참고: 샘플 DNases 제조업체의 권장 사항에 따라 DNA 오염 물질 제거와 두 번 처리 되어야 합니다.
    9. Agarose 젤에 RNA 무결성을 평가 하 고 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 방법으로 RNA 무결성 번호 (린)와 ribosomal 비율을 측정 하 여 확인 합니다.
      참고:에 린 계정에 전체 전기 이동 추적을 걸립니다. 린 소프트웨어 알고리즘 총 RNA의 분류에 대 한 허용 가장 저하 프로필과 가장 그대로 되 고 10 되 고 1 10 1부터 번호 매기기 시스템을 기반으로 합니다. CDNA 라이브러리 준비를 진행 하는 신장은 이상적인 값 2, 유기 체 및 그것의 특이성에 따라 8 및 가능한 높은 ribosomal 비율 [28S/18] 이어야 합니다.
    10. CDNA 라이브러리의 시퀀싱에 대 한 준비까지-80 ° C에서 RNA 샘플을 저장 합니다.
  3. CDNA 라이브러리의 준비
    1. 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 상용 cDNA 합성 키트 (자료 테이블)를 사용 하 여 라이브러리 준비를 진행.
    2. 집중력과 DNA 칩에 품질에 대 한 라이브러리를 확인 하십시오.
      참고: 더 정확 하 고 정확한 정량화 민감한 형광 기반 정량 분석 실험을 수행할 수 있습니다.
  4. 라이브러리 시퀀싱
    1. 2 샘플 정상화 nM 흐름 세포 조직에 따라 다중화에 진행.
    2. 샘플 1의 농도에서 변성 nM 실시간 5 분에 대 한 0.1 N NaOH를 사용 하 여
    3. 10 시 샘플을 희석. 10 시 흐름 셀에 각 샘플을 로드 합니다.
    4. 높은 처리량 시퀀싱 시스템입니다 대규모 게놈을 시퀀싱을 진행. 여기 실행 SRM 실행 했다 (SR: 단일 읽기, PE: 짝-엔드 읽기, m: 다중화 샘플) 읽기 7 인덱스 기지와 51 주기의.
    5. 외부 FastQC 프로그램13시퀀싱의 품질을 평가 합니다.
    6. 어댑터 시퀀스 트리밍 후 읽기 정렬 참조 게놈에 대 한 진행. 진 핵 세포 게놈을 샘플 오염 평가 하 고, 필요한 경우, 진행 비 세균성 읽기 트리밍에 대 한 정렬.
  5. 통계 분석
    1. 사용 하 여 여러 가지 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 온라인 차동 표현한 유전자의 세트 정의: R 소프트웨어, DESeq2 등 PF2tools 패키지 (버전 1.2.12) 플랫폼에서 개발 된 Bioconductor 패키지 "Transcriptome 외 Epigénome" (파스퇴르 연구소, 파리)입니다.

결과

M. abscessus 저항 하 고 대 식 세포와 같은 amoebae 환경 원생 동물의 살 균 응답을 탈출 하는 기능이 있다. M. abscessus 는 악성에 게 쥐4독성 요인을 amoebae, 접촉 성장 될 때 표현 한다. 이러한 방법의 첫 번째 목적은 M. abscessus 그것의 생존 및 곱셈 amoebae 내에 존재 하는 유전자를 확인 했다.

이 위?...

토론

M. abscessus 동작은 RGM2에 속하는 다른 mycobacteria 보다 M. 결핵 등 병원 성 SGM의 행동에 훨씬 더 비슷합니다. SGM의 pathogenicity에 핵심 요소 생존 또는 심지어 대 식 세포와 같은 항 원 제시 세포와 수지상 세포 내에서 증식 하는 능력입니다.

M. abscessus 진 핵 phagocytic 세포 내에서 살아남기 위해 그것의 게놈14 의 전체 순서에 의해...

감사의 말

우리는 크게 돌연변이의 귀중 한 선물에 대 한 홍보 E.J. 루빈 (하버드의과 대학, 보스톤, 미국)를 인정 도서관과 원고의 교정에 대 한 닥터 벤 마샬 (의 학부, 사우스 햄튼 대학, 영국). 우리가 크게 그들의 재정 지원 (RF20150501377)에 대 한 낭 성 섬유 증 "Vaincre 라 Mucoviscidose" 및 "L'Association 그레고리 Lemarchal" 프랑스 환자 협회를 인정합니다. 우리 또한 감사 국립 기관 연구 (ANR 프로그램 DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d'Intérêt Majeur 외관 Infectieuses 동부 표준시 Emergentes) V.L m 박사 후 친목을 자금. L. L.는에서 박사 동료는 "Ministère de L'Enseignement Supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche".

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ Equipment
24-well platesThermofisher11874235
96-well platesThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BioanalyzerAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop spectrophotometer 2000Thermofisher
QuBit fluorometerThermofisherQ33226
zirconium beads/silica beadsBiospec products11079101ZBeads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii ATCC30010strain
Amikacin Mylan150927-Apowder
B-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250solution
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granular anhydrous
Chloroform Fluka25666solution
ClaI enzymeNew England BiolabsR0197Senzyme
Columbia agar Biomerieux4304190 mm
D-GlucoseSigma-AldrichG8270 powder
DMEM Thermofisher11500596medium
DNase and RNase free water Invitrogen10977-035solution
E. coli electrocompetent Thermofisher18265017bacteria
EDTASigma-AldrichE4884powder
Escherichia coli Clinical isolatepersonal stockbacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf SerumGibco10270serum
GlycerolSigma-AldrichG5516solution
Guanidium thiocyanate EuromedexEU0046-Dpowder
Isopropanol Sigma-AldrichI9516solution
J774.2 macrophagesSigma-AldrichJ774.2Strain
kanamycin Sigma-Aldrich60615powder
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobasic, anhydrous
LB liquid medium Invitrogen12795-027powder
LysozymeRoche10837059001powder
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (cryotubes with beads)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 mediumSigma-AldrichM0428powder
Middlebrook 7H9 mediumThermofisher11753473powder
Müller-Hinton agarBiorad3563901powder
N-Lauryl-sarcosineMerckS37700 416powder
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Phenol/chloroforme Sigma-Aldrich77617solution
Proteinase KThermofisherEO0491powder
proteose peptoneBD211684enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmidNew England Biolabs54357plasmid
SDS  20%Biorad1610418solution
Sodium citrateCalbiochem567446powder
ThioureaSigma-Aldrich88810powder
TrisSigma-Aldrich154563powder
Trizol Thermofisher12044977solution
Tween 80Sigma-AldrichP1754 solution
Yeast extract BD212750
Kit
AMBION DNase kit Thermofisher10792877kit
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit ThermofisherK0503kit
PureLink PCR Purification kitInvitrogenK310001kit
Quant-It" assays kitThermofisherQ33140/Q32884kit
T4 DNA ligase InvitrogenY90001kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kitIllumina15032611kit

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