思春期の発症を確認マウスおよびラットの不妊治療法を実行することで生殖能力の決定

要約

多くの治療法や遺伝的変異性成熟と不妊治療のタイミングに影響を与えます。このプロトコルでは、マウスおよびラットの性成熟動物で不妊治療研究を設定する前に思春期の発症を評価する非侵襲的な方法について説明します。

要約

生殖能力の評価は、治療や生殖の軸は、視床下部-下垂体-性腺軸とも呼ばれますに遺伝子操作の影響を理解する重要です。生殖軸は再生のための有利な条件に不妊治療の適応環境と内部の入力のキー インテグレーターです。マウスおよびラットの不妊治療研究に着手、前に性的に成熟を観察される生殖表現型に起因する可能性を除外する評価遅延または不在の思春期発症。このプロトコルでは、膣口と最初の発情を女性、男性包皮分離の決断のもとで思春期の発症を評価する非侵襲的なアプローチについて説明します。思春期の補完と性的成熟度の達成の確認後不妊治療研究を開始できます。プロシージャには、マウスとラット、不妊研究をセットアップする方法を評価し、治療や遺伝子欠失の肥沃度の影響があるかどうかを判断するパラメーターに最適な飼育条件がについて説明します。

概要

思春期までの移行は、性的成熟と生殖能力を達成するために必要です。思春期の転移と成人期の肥沃度の維持は、視床下部-下垂体-性腺軸 (図 1) とも呼ばれます、生殖軸によって調整されます。思春期発症のタイミングと肥沃度の維持が子孫、親^1,2の生存の可能性を高めるための内部として環境要因によって堅く調整されます。このプロトコルはマウスおよびラット生殖能力を評価するために不妊治療研究を設定する前に性的に成熟を確認する思春期の発症を決定する非侵襲的なアプローチを提供します。

不妊治療研究性成熟動物でされるので、動物は思春期を経て後開始することができます。思春期の発症する前に生殖の軸は静止、思春期 (図 1) を開始する不十分な量で下垂体に性の成熟、性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のキーのドライバーがリリースされます。思春期の発症は、正中隆起の GnRH 放出の増加の結果複雑なプロセスです。GnRH は黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモン (FSH) の分泌、下垂体から生殖腺の成熟と生殖機能 (図 1)^3,4,5に不可欠な 2 つのホルモンを促進します。.

生殖軸への侮辱減らされた豊饒とも事前または遅延思春期発症することができます。内分泌撹乱化学物質^6,7体の増加/減少体重^1,8の変更への露出のような思春期の発症と生殖能力のタイミングに影響を与える知られている状況日長^2,9と遺伝的変異^{10,11,12,13,14,15}。

性的成熟度の発症は、不妊治療法を設定する前に完了する必要がある重要なステップです。採血や動物^16,の犠牲を必要としない場合、包皮分離、腟口、最初の発情思春期発症の決定の利点はこれらのプロシージャの非侵襲的な特性¹⁷。

思春期の発症を決定したら不妊研究を正しく設定生殖軸の整合性に関する重要な情報を提供して通常 (改良) のさらなる研究のための実験動物の生成の 2 番目の利点は、¹⁸します。 このプロトコルで記述されている不妊治療研究のセットアップは男性と女性の生殖能力のマイナーおよびメジャーの赤字を検出できます。キー パラメーター評価 1) 最初のごみ、2) 所定の時間枠と 3) ゴミの大きさで生成リットル数時間が含まれます。最後に、フォロー アップの不妊治療障害の原因を識別するために行なうことができる研究の種類に関する推奨事項が含まれます。

記述されていたプロトコルはマウスと代表のデータ反映トランスジェニック マウスでの作業。ただし、含まれているすべてのプロトコルはラットで均等に有効です。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは機関動物ケアおよび使用委員会のミシガン州立大学によって承認されケアと実験動物の使用のためのガイドに従って実施します。

1. 思春期の発症を決定します。

1. 最低限の衣服制度ガイドラインに従ってください、きれいな白衣と清潔な手袋を着用する必要があります。常に清潔な手袋を着用してマウスを処理します。
2. テーブルの上にパッドを配置することによって作業領域を準備します。
   1. パッドの上向きグリッドとクリーン マウス ケージ上部に配置します。
   2. 作業領域のスケールを設定します。規模と風袋をクリーンの 500-1000 mL ビーカーを置きます。
   3. 作業領域は、レコードの体重と包皮分離、膣開口部または最初の発情の横にシートを配置します。
3. 研究用マウスを識別します。思春期に達するまで思春期発症の日常点検を実行します。研究を通して一日の同時検査を実行します。思春期の発症は早ければ生後 11 12¹⁹, 発生する可能性がしかし、最も実験的設定で思春期発症の監視が始まります 〜 22 日.
4. (ステップ 1.2) 作業領域にマウス ケージを配置します。ケージを開き、テーブルの上のふた、水のボトル、食品ホルダーを配置します。
5. 雄マウスの包皮分離を決定します。
   1. 尾、マウスを押しながらステップ 1.2.1 からクリーン マウス ケージ上に配置します。テールから軽く押し、ながら聞かせて 〜 5 のケージ上部のグリッドを探るマウス s。
   2. そっと尾を引いて後方。これは通常その脚でグリッドに保持しながら前進動物で起因します。皮膚へのアプローチ他の手には首と耳が近くです。
   3. 肩と首を親指と人差し指の間のたるんだ皮膚を把握します。それは噛まないようにしてその頭を回ってからマウスを防ぐ、皮膚の良いホールドを得ることが重要です。
   4. 残りの指で背中の皮膚をつかんで手を押すことによってそれを保持します。呼吸、血流、または有害な骨は、筋肉や皮膚を妨げることがなくしっかり保持します。手の手のひらにマウスの背中を支えながらマウスの腹を公開する手をオンにします。
   5. 無料の手でゆっくり押し戻しますペニスの周りの皮膚を行わず。包皮分離で包皮の皮膚はスライド後方陰茎亀頭(図 2 a、包皮分離を示す矢印) を公開します。包皮分離の有無を記録します。
   6. ゆっくりステップ 1.2.2 から 500-1000 mL ビーカーにそれを配置することによって、マウスの重量を量る、重量を記録します。
   7. ケージの床にビーカー 0-2 cm を保持することによって住宅ケージ内マウスを再導入し、独自に終了するマウスを許可するビーカーの上ゆっくりとヒントします。きれいに水と中性洗剤でビーカーとスケールにそれを返すとスケールを風袋の前にそれを乾燥させる。
6. 雌マウスの膣に開口部を決定します。
   1. 作業領域 (ステップ 1.2) に綿ボール、ビーカーと滅菌水のボトルを置きます。ビーカーに水を注ぐ。滅菌水でコットン ボールを湿らせるし、ステップ 1.2.1 からケージ上部の横に配置します。
   2. (ステップ 1.2) 作業領域でマウス ケージを配置し、尾の根元を持ち、ホーム檻からケージ上部 (ステップ 1.2.1) へマウスを転送します。軽くマウスの前方への動きを奨励する尾部を引き戻します。
   3. 無料の指を使って腰をサポートしながら、尾を持ち上げます。ケージの上部が付いている接触を維持するために後肢を許可します。マウスがあまりにも多く、それを保持する、手 1.5.1-1.5.4 の手順で説明するように。
   4. ゆっくりステップ 1.6.1 から水加湿コットン ボールで外陰部をきれいに。各マウスのクリーン加湿コットン ボールを使用します。膣口、外陰部を検査、膣が完全に開いているかどうかを判断する (図 2 a、女性の膣口)。
   5. 膣口が発生した場合に記録します。マウスの重さし、手順 1.5.6-1.5.7 で説明したよう、ホームのケージに戻る。
7. 最初の発情初回排卵のインジケーター。
   1. 作業領域 (ステップ 1.2) に滅菌水、ラベルの付いたガラス スライド クリーン チップ 200 μ L ピペットとビーカーを置きます。
   2. 手順 1.6.2-1.6.3 で説明したように女性を保持します。膣の開口部に滅菌水の 〜 50 μ L を含むピペットの先端を配置します。
   3. 優しく膣壁から導入し、2-4 倍 〜 50 μ L の水を再吸収によってセルをフラッシュします。ラベルの付いたガラス顕微鏡スライド上にピペット チップからコンテンツを塗りつけます。
   4. 慎重に 10 倍または 20 × 対物を用いた明視野顕微鏡で細胞の形態を観察または ~ 1 h の汚れセンサーをしましょうと、対比染色 (ddH₂O に溶解) 0.1% メチレン ブルー溶液で (図 2 b)。0.1% メチレン ブルー溶液に乾燥したスライドを浸し、対比染色に 〜 30 s。スライドの空気を 1 時間乾燥してみましょう。
   5. ステップ 1.7.4 10 X、20 X の明視野顕微鏡のスライドを確認します。発情周期 (図 2 b) の 4 つの段階を区別することができる細胞の形態を観察することによって発情周期 (図 2 b)²⁰のステージを確立します。
      注: Metestrus は、白血球と核の上皮細胞と角化上皮細胞 (図 2 b) による発情の混合物によって角化扁平上皮細胞、白血球、白血球による発情、proestrus の混合物によって特徴付けられます。²⁰。
   6. 体重を記録し、手順 1.5.6-1.5.7 で示すように、その家のケージにマウスを返します。腟脂膏ときマウスが (図 2 b)、最初の発情日に終了します。

2. 望ましい飼育部屋条件

1. 飼育室が温度 20 〜 24 ° C、55 ± 10% の湿度と同種ルーム 300 〜 400 の強さの光ルクス床²¹の上方約 1 m。この光の強度には、望ましい 25 80 ルクスの中期ケージ光強度ことができます。光の強度をテストするには、照度計を使用します。
2. 実験全体の照明の適切なタイミングを確保するための飼育室で照明を制御するのに自動システムを使用します。光と 10 h の闇 (LD14:10) のための²¹の 14 h で「夏のような"条件に 12 h 日 (12 h 光と闇 12 h、LD12:12) からの齧歯動物の範囲で不妊治療を評価するために最適な日長条件。
3. 繁殖ケージを準備します。
   1. 蓋、水、食糧、寝具および繁殖ペアあたりネスト クリーン マウス ケージを準備します。
   2. セックスを含むすべての必要な情報とケージのカード記入生年月日、マウス株とを交配を設定するときの日付。

3. 不妊治療研究

1. 不妊治療研究に使用される動物を識別します。動物が性的に成熟した (ステップ 1) であることを確認します。マウスにおける不妊治療を設定する一般的に使用される年齢は、年齢は、ほとんどの実験条件で性的成熟が完了した、年齢 10-16 週です。
2. きれいなテーブル ステップ 2.3 で準備飼育ケージを配置します。
3. キャッチし、マウスを押したまま。
   1. ゆっくりとマウス ケージに手袋をはめた手を紹介します。手袋と手の香りに合わせてマウスを許可する短い期間 (5 ~ 30 秒)、ケージに手をおきます。多忙なぎくしゃくした動きを避けます。
   2. ケージの底に近いカップ状の手を下げ、ゆっくりとマウスにそれに近づきます。彼らはすぐに実行されます。手を実行するときは、親指と人差し指の間の 1 つのマウスの尾をトラップします。
   3. 2-3 s の尾によってマウスを持ち上げます。マウスより長く保持される場合、尾を保持し、尻尾にホールドを維持するカップ状の手でマウスを置きます。
4. 尾 (ステップ 3.3) でそれらを保持することによって繁殖ケージに 1 男性とその後 1 女性を転送します。不妊治療法を設定するとき、女性同じ発情期にいるを確認します。ステップ 1.7 に従って膣スミアを実行することによって、女性の発情期を決定します。
5. ケージを閉じてマウスが食料、水、ネスティング材料を持っていることを確認します。ケージ ケージのカードとケージのカード ホルダーに取り付けます。
6. ハウジング ラックに飼育ケージを配置します。不妊研究の全期間放置飼育ケージとしてできるだけ妨げられていません。30 日間の不妊治療の研究を行います。各繁殖ペアの詳細記録を保つし、1) セットアップ交配日、2) 出産した日、3) 死者と生きている子犬を含む生まれ、子犬の数に注意してください。研究を通して毎日トイレ チェックを実行します。
7. 不妊治療を長引かせる手順 3.6 で追加の 30-60 日ない場合や不妊治療に対する弱い影響の研究が確立されます。

結果

これらの結果は、転写因子腹側前部ホメオ 1 (Vax1) ヘテロ マウス (HET)¹³、またはVax1 とここで呼ばれる 1 つの対立遺伝子に全身でされている 2 つの異なるトランスジェニック マウス モデルから内 GnRH ニューロン²²、ここで条件付き KO (cKO) と呼ばれる条件付きで削除されています。不妊治療研究を設定する前に、すべて?...

ディスカッション

マウスの全面的な福利は成功した不妊試金²¹にとって重要です。不妊治療法を実行すると、物理的にマウスを毎日チェックこれはストレスを引き起こす可能性があることが重要です。これらはストレスも、さらにケージの頻繁な変更を避けます。理想的には週に 1-2 回以上ケージの変更が行われます。暗い段階露光夜行性の齧歯動物の繁殖に悪影響します。暗い時間の間飼育...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile Cotton Balls	Fisher	22456885
Surface protector	Fisher	1420637
Light meter	VWR	21800-014
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Microscope Slides	Genesee Scientific	29-101
Optimouse rack with cages	AnimalCare systems	C89100
Water Bottle Basket	AnimalCare systems	C61011
Filtered Cage Tops	AnimalCare systems	C78210
Optimice Standard Feeder	AnimalCare systems	C40100SG
Cage Card Holder	AnimalCare systems	C43251
Cage Cards	AnimalCare systems	M52010
Bottle Assambley	AnimalCare systems	C79122P
Bed R'Nest Nesting	The Andersons	BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding	The Andersons	8B
Standard mouse chow	Teklad	7904 (7004)
Scale	VWR	10205-004
Polypropylene Beaker	Fisher	14-955-111F