Détermination de la compétence reproduction en confirmant début pubertaire et effectuer un test de fertilité chez des Rats et des souris

Résumé

Beaucoup de traitements et de mutations génétiques incidence sur le calendrier de la maturité sexuelle et la fertilité. Ce protocole décrit une méthode non invasive d’évaluation début pubertaire chez les souris et les rats avant la mise en place d’une étude de fertilité chez des animaux sexuellement matures.

Résumé

Évaluation de la compétence de reproduction est essentielle pour comprendre l’impact d’un traitement ou de la manipulation génétique sur l’axe de reproduction, également appelé l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique. L’axe de reproduction est un intégrateur de clés d’entrée interne et environnementaux s’adapter à des conditions favorables pour la reproduction, la fertilité. Avant de se lancer dans une étude de fertilité chez des rats et des souris, la maturité sexuelle est évaluée afin d’exclure la possibilité que les phénotypes de reproduction observés sont dus en retard ou absent début pubertaire. Ce protocole décrit une approche non invasive pour évaluer le début pubertaire chez les mâles grâce à la détermination de séparation préputiale et chez les femmes à travers l’orifice vaginal et premier oestrus. Après la confirmation de l’achèvement de la puberté et l’atteinte de la maturité sexuelle, une étude de fertilité peut être lancée. La procédure décrit les conditions de reproduction optimales pour souris et rats, comment mettre en place une étude sur la fertilité et quels sont les paramètres pour évaluer et déterminer si le traitement ou la délétion du gène a un impact sur la fertilité.

Introduction

La transition à la puberté est nécessaire pour atteindre la maturité sexuelle et génésique compétence. La transition pubertaire et le maintien de la fertilité à l’âge adulte est réglementée par l’axe de reproduction, également appelé l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (Figure 1). Le moment de déclenchement pubertaire et l’entretien de la fertilité sont étroitement contrôlées par des facteurs internes aussi bien qu’environnementales pour augmenter les chances de survie des parents et la progéniture de^1,2. Ce protocole prévoit une approche non invasive pour déterminer le début pubertaire chez les souris et les rats pour confirmer la maturité sexuelle avant la mise en place d’une étude de fertilité pour évaluer la compétence de reproduction.

Une étude de fertilité est effectuée chez des animaux sexuellement matures et peut être lancée après que les animaux sont passés par la puberté. Avant début pubertaire, l’axe de reproduction est quiescente, et le principal moteur de la maturation sexuelle, la gonadolibérine (GnRH), est sorti sur l’hypophyse en quantités insuffisantes pour initier la puberté (Figure 1). Début pubertaire est un processus complexe qui se traduit par une libération accrue de GnRH dans l’éminence médiane. GnRH favorise l’hormone lutéinisante (LH) et folliculo-stimulante (FSH) sécrétion par l’hypophyse, deux hormones essentielles pour la maturation des gonades et la fonction de reproduction (Figure 1)^3,4,5 .

Insultes à l’axe de reproduction entraînent une fertilité réduite et peuvent aussi avance ou le retard de déclenchement pubertaire. Conditions connues pour influer sur le moment de déclenchement pubertaire et reproduction compétence incluent l’exposition aux produits chimiques^6,7, une augmentation/diminution de corps poids^1,8, changements de perturbation endocrinienne jour longueur^2,9 et mutations génétiques^{10,11,12,13,14,15}.

L’apparition de la maturité sexuelle est une étape essentielle qui doit être achevée avant la mise en place d’un test de fertilité. Les avantages de la détermination de début pubertaire par séparation du prépuce, ouverture du vagin et premier oestrus, sont les caractéristiques non invasif de ces procédures, puisqu’ils ne nécessitent pas de prélèvement de sang ou de sacrifice des animaux^{16, 17}.

Après que le début pubertaire est déterminée, correctement mise en place d’une étude de fertilité fournira des informations importantes concernant l’intégrité de l’axe de la reproduction et a habituellement le deuxième avantage de produire des animaux de laboratoire pour poursuivre ses études (raffinement) ¹⁸. l’installation d’étude de fertilité décrite dans le présent protocole peut détecter mineures et majeures des déficits de compétence reproducteur mâles et femelles. Principaux paramètres évalués comprennent 1) temps de la première portée, 2) nombre de portées générées dans une taille donnée de la période de réalisation et de la litière 3). Enfin, les recommandations sur le type d’études qui peuvent être menées pour identifier la cause des troubles de la fertilité de suivi sont incluses.

Le protocole décrit se réfère à des souris et les données représentatives représentent les travaux effectués chez des souris transgéniques. Cependant, tous les protocoles inclus sont également valables chez les rats.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’utilisation de la Michigan State University et d’institutionnels animalier et menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Déterminez le début pubertaire

1. Suivez les directives institutionnelles pour l’habillement, au minimum, il est nécessaire de porter une blouse propre et gants propres. Toujours manipuler les souris portant des gants propres.
2. Préparer la zone de travail en plaçant un coussin sur la table.
   1. Placez une cage propre souris avec la grille vers le haut sur le pavé.
   2. Mettre en place une échelle dans la zone de travail. Placer un bécher propre 500 – 1000 mL sur l’ampleur et la tare.
   3. Placer une feuille à côté de l’aire de travail au poids record et séparation préputiale, ouverture vaginale ou premier oestrus.
3. Identifier les souris pour l’étude. Effectuer des inspections quotidiennes pour début pubertaire jusqu'à ce que la puberté est atteinte. Procéder à l’inspection en même temps de la journée tout au long de l’étude. Début pubertaire peut survenir dès le jour après la naissance, 11 et 12,¹⁹, cependant, dans des configurations plus expérimentales, suivi début pubertaire commence à ~ 22 jours.
4. Placer la cage de la souris dans la zone de travail (étape 1.2). Ouvrez la cage et placez le couvercle, la bouteille d’eau et le titulaire de la nourriture sur la table.
5. Déterminer la séparation du prépuce chez les souris mâles.
   1. Tout en maintenant la souris par la queue, placez-le sur le dessus de cage souris propre de l’étape 1.2.1. Tout en maintenant doucement sur la queue, laissez la souris explorer la grille du haut cage pendant ~ 5 s.
   2. Tirez doucement la queue en arrière ; Cela se traduit généralement par l’animal, aller de l’avant tout en tenant à la grille avec ses pattes avant. Approche de l’autre main sur la peau à proximité par le cou et les oreilles.
   3. Saisissez la peau entre les épaules et le cou avec le pouce et l’index. Il est important d’obtenir une bonne prise de la peau, car il va empêcher la souris de tourner sa tête de mordre.
   4. Prenez la peau sur le dos avec les doigts restants et maintenez-le en pressant contre la main. Tenez fermement sans entraver la respiration, de sang écoulement, ou dommageable d’os, des muscles ou de peau. Tourner à la main pour exposer le ventre de la souris, tout en soutenant le dos de la souris dans la paume de la main.
   5. Avec la main libre, doucement repousser la peau autour du pénis sans forcer. À la séparation du prépuce, la peau préputiale glisse vers l’arrière, exposant ainsi le gland du pénis (Figure 2 a, flèche indiquant séparation préputiale). Enregistrer la présence ou l’absence de séparation préputiale.
   6. Peser la souris en le plaçant délicatement dans le bécher de 500-1000 mL de l’étape 1.2.2 et consignez le poids.
   7. Réintroduire la souris dans la cage de logement en tenant le bécher 0-2 cm sur le plancher de la cage et lentement basculer dans le bécher permettant la souris sortir par ses propres. Nettoyer le bol avec l’eau et un détergent doux et séchez avant de retourner à l’échelle et le tarage de la balance.
6. Déterminer l’ouverture vaginale chez les souris femelles.
   1. Placer une boule de coton, gobelet et une bouteille d’eau stérile dans la zone de travail (étape 1.2). Versez l’eau dans le bécher. Humidifier la boule de coton avec l’eau stérile et placez-le à côté le dessus de la cage de l’étape 1.2.1.
   2. Placer la cage de la souris dans la zone de travail (étape 1.2) et passer la souris de sa cage maison vers le haut de la cage (étape 1.2.1) en le tenant à la base de la queue. Tirez doucement la queue afin d’encourager un mouvement vers l’avant de la souris.
   3. Soulevez la queue tout en soutenant les hanches avec les doigts libres. Permettre à des membres postérieurs de rester en contact avec le dessus de la cage. Si la souris se déplace trop, tenez-le dans la main comme décrit dans les étapes 1.5.1-1.5.4.
   4. Nettoyer doucement la vulve avec la boule de coton humidifié d’eau de l’étape 1.6.1. Utilisez une boule de coton humidifié propre pour chaque souris. Pour déterminer l’ouverture vaginale, d’examiner la vulve et de déterminer si le vagin est complètement ouvert (Figure 2 a, femelle ouverture vaginale).
   5. Compte rendu si ouverture vaginale s’est produite. Peser la souris et remettez-le dans la cage, comme décrit dans les étapes 1.5.6-1.5.7.
7. Premier oestrus un indicateur de la première ovulation.
   1. Placer un bécher avec l’eau stérile, une lame de verre étiquetées et une pipette de 200 µL avec un embout propre dans la zone de travail (étape 1.2).
   2. Tenir la femelle comme décrit dans l’étape 1.6.2-1.6.3. Placer l’embout de la pipette contenant environ 50 µL d’eau stérile à l’ouverture du vagin.
   3. Doucement, rincer les cellules de la paroi vaginale en introduisant et en résorbant ~ 50 µL d’eau 2 - 4 fois. Etaler le contenu de la pipette sur une lame de microscope de verre étiquetées.
   4. Observer attentivement la morphologie cellulaire sur un microscope à fond clair à l’aide d’un 10 X ou 20 X, objectif ou laisser l’airdry frottis pendant environ 1 h et puis contre-coloration avec une solution de bleu de méthylène de 0,1 % (dissoute dans ddH₂O) (Figure 2 b). Pour contre-coloration, trempez la lame séchée dans la solution de bleu de méthylène de 0,1 % pour ~ 30 s. Sécher l’air de glisser pendant 1 h.
   5. Observer les diapositives de l’étape 1.7.4 à un microscope à champ lumineux à 10 X ou 20 X. Mettre en place la phase du cycle oestral (Figure 2 b)²⁰ en observant la morphologie cellulaire qui permet de distinguer les quatre étapes distinctes du cycle oestral (Figure 2 b).
      Remarque : Le métoestrus se caractérise par un mélange de cellules épithéliales squameuses cornéocytaire et leucocytes, dioestrus par les leucocytes, pro-oestrus par un mélange de leucocytes et cellules épithéliales nucléées et oestrus par les cellules épithéliales cornéocytaire (Figure 2 b) ²⁰.
   6. Noter le poids du corps et regagner sa cage maison de la souris comme décrit dans les étapes 1.5.6-1.5.7. Frottis vaginal sont terminent le jour quand la souris a son premier oestrus (Figure 2 b).

2. souhaitable salle Conditions de reproduction

1. S’assurer que la chambre d’élevage a une température d’environ 20-24 ° C, avec 55 ± 10 % d’humidité et homogène la salle lumière d’une intensité de ~ 300-400 lux à 1 m environ au-dessus de l' étage²¹. Cette intensité lumineuse permet l’intensité moyenne cage souhaitable de 25-80 lux. Pour tester l’intensité de la lumière, utiliser un posemètre.
2. Un système automatisé permet de contrôler l’éclairage dans la salle de reproduction pour s’assurer le moment approprié de l’éclairage tout au long de l’expérience. Conditions optimales de longueur de la journée afin d’évaluer la fertilité dans la gamme de rongeurs d’une journée de 12 h (12 h de lumière et l’obscurité de 12 h, LD12:12), aux conditions « estival » avec 14 h de lumière et 10 h d’obscurité (LD14:10)²¹.
3. Préparer des cages d’élevage.
   1. Préparer une cage propre souris avec couvercle, eau, nourriture, literie et de nidification par couple nicheur.
   2. Remplir les cartes de cage avec toutes les informations requises, y compris le sexe, date de naissance, souche de souris et la date où l’accouplement est mis en place.

3. étude de fertilité

1. Identifier les animaux destinés à être utilisés pour l’étude de fertilité. Veiller à ce que les animaux sont sexuellement matures (étape 1). Une tranche d’âge généralement utilisé pour mettre en place une étude sur la fertilité chez la souris est de 10 à 16 semaines d’âge, un âge où la maturation sexuelle est terminée dans des conditions plus expérimentales.
2. Sur une table propre, placez la cage de reproduction préparée à l’étape 2.3.
3. Attraper et maintenez le pointeur de la souris.
   1. Introduire lentement une main gantée dans la cage de la souris. Laisser la main dans la cage pendant une courte période de temps (~ 5-30 s), ce qui permet des souris pour s’adapter à l’odeur du gant et main. Éviter les mouvements trépidantes et saccadés.
   2. Abaisser la main creuse près du fond de la cage et approcher lentement à la souris. Il vont s’enfuir. Lorsqu’ils sont exécutés sur la main, piège à la queue d’une souris entre le pouce et l’index.
   3. Soulevez la souris par la queue pour 2-3 s. Si la souris doit être maintenu plus, agripper la queue et placer la souris dans la main creuse conservant la mainmise sur la queue.
4. Transférer 1 mâle et par la suite 1 femelle dans la cage d’élevage en les tenant par la queue (étape 3.3). Veiller à ce que les femelles sont en phase d’oestrus même lorsque vous configurez le test de fertilité. Déterminer le stade de œstrus des femelles en réalisant un frottis vaginal comme décrit dans l’étape 1.7.
5. Fermer le boîtier et veiller à ce que les souris ont matériel alimentaire et hydrique et imbrication. Visser le support de carte de cage avec la carte de la cage sur la cage.
6. Placer la cage de reproduction sur la grille du logement. Laisser la cage de reproduction aussi intacte que possible pendant toute la durée de l’étude de la fertilité. Procéder à l’étude de fertilité pendant 30 jours. Pour chaque paire de reproducteurs, des registres détaillés et note 1) la date de que l’accouplement est mis en place, 2) la date portées naissent et 3) le nombre de chiots nés, dont les petits morts ou vivants. Effectuer des vérifications de la litière par jour tout au long de l’étude.
7. Prolonger la fertilité étude pour une extension de 30 à 60 jours si aucun ou un faible impact sur la fertilité est établi en étape 3.6.

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Résultats

Les résultats présentés sont de deux modèles de souris transgéniques différente lorsque la transcription factor boîte homéotique antérieure ventrale 1 (Vax1) a été supprimée dans le corps entier sur un allèle, ici dénommé hétérozygote souris (HET)¹³, ou Vax1 a été supprimé sous certaines conditions au sein de la GnRH neurones²², ici appelée KO conditionnel (cKO). Avant la mise en place de l’étude de ...

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Discussion

Le bien-être global des souris est essentiel pour un succès de fertilité test²¹. Lorsque vous effectuez un test de fertilité, il est important de ne vérifier pas physiquement sur les souris tous les jours car cela peut causer un stress. Éviter les changements fréquents de cage, car ce sont aussi stressantes. Changements de la cage se fera idéalement pas plus de 1 à 2 fois par semaine. Exposition à la lumière pendant la période d’obscurité un impact négatif sur la reproduction chez ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile Cotton Balls	Fisher	22456885
Surface protector	Fisher	1420637
Light meter	VWR	21800-014
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Microscope Slides	Genesee Scientific	29-101
Optimouse rack with cages	AnimalCare systems	C89100
Water Bottle Basket	AnimalCare systems	C61011
Filtered Cage Tops	AnimalCare systems	C78210
Optimice Standard Feeder	AnimalCare systems	C40100SG
Cage Card Holder	AnimalCare systems	C43251
Cage Cards	AnimalCare systems	M52010
Bottle Assambley	AnimalCare systems	C79122P
Bed R'Nest Nesting	The Andersons	BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding	The Andersons	8B
Standard mouse chow	Teklad	7904 (7004)
Scale	VWR	10205-004
Polypropylene Beaker	Fisher	14-955-111F