エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

要約

ウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ RNA の共発現による大腸菌の組換え RNA の大量に生産するためのプロトコルを提案するここでは、tRNA のリガーゼ。主な製品は、同質性に浄化を促進する円形分子です。

要約

RNA 生物学とバイオ テクノロジーの高度なアプリケーションで RNA 分子の使用の関心の高まり、大量の組換え Rna を生成する方法が制限されます。ここでは、多量のウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ分子の共発現による大腸菌の組換え RNA を生成するプロトコルについて述べる tRNA のリガーゼ。ウイロイドは、高等植物の感染性は比較的小さく、非コーディング、高いベース対の円形 Rna です。ホスト植物 tRNA リガーゼ ウイロイド レプリケーション中に RNA 環状を仲介するAvsunviroidae、ナスの潜在ウイロイド(ELVd) などの家族に属しているウイロイドによって募集される酵素であります。ELVd が大腸菌では複製されませんが、ELVd 前駆体が効率的にエシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写し細菌のセルに埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理し、結果モノマーによって円形が、共発現 tRNA のリガーゼ顕著な濃度に達する。ELVd 足場に関心の RNA の挿入組換え RNA 標準実験室の条件で細菌培養のリットル当たりのミリグラムの数十のことができます。RNA 製品の主要な割合は円形で、仮想の同質性に組換え RNA の精製を容易にする機能。このプロトコルでは関心の RNA に対応する相補的 DNA (cDNA) が、共同ナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドに沿って変換するためE. 大腸菌発現プラスミドの ELVd cDNA の特定の位置に挿入されます。強い構成プロモーターの制御の下で両方の分子の共発現は、多量の組換え RNA の生産に します。組換え RNA を細菌の細胞から抽出した、その循環を利用して細菌の Rna の大部分から分離することができます。

概要

DNA やタンパク質と対照をなして、簡単、効率的でコスト効果の高い生産多量の RNA のためのプロトコルは豊富ではないです。ただし、彼らのユニークな生物学的特性の¹を調査するまたはで使用されるこれらの生体分子の量を増やす研究と産業の需要が特異性の高いアプタマーとして彼らの使用を含むバイオ テクノロジー アプリケーションを洗練された²、治療薬³、または選択的な殺虫剤⁴。生体外のトランスクリプションと化学合成の研究では、RNA を生成するが使用されます。ただし、これらのメソッドは、大量の製品が必要な場合の重要な制限を伴います。論理の代替は、細胞の仲間から関心の Rna を分離する精製プロセスに続いて、生きた細胞の内因性転写機械を使用することです。この戦略は、次の研究室向けなど、細菌の細胞における組換え Rna を生成する手法が開発されたエシェリヒア属大腸菌⁵または、海洋紫光合成アルファ-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum⁶。 細菌における遺伝子組換え RNA を生成するほとんどのメソッドはネイティブの非常に安定した RNA の足場の式に依存、tRNA または、rRNA、関心の RNA が、挿入⁷のようです。余分な RNA の存在が下位アプリケーション⁸の問題の場合、これはキメラ分子から関心の RNA の要否を課しています。組換え RNA バイオ テクノロジーのもう一つの概念は、製品自体がありますまたは関心^{9、RNA の安定性を高める保護戦略として使用する組換えリボ核蛋白質複合体の生産 10}。同様に、円形の Rna の生産より安定した製品¹¹を生成するための戦略として提案されています。

我々 は最近多量の上記の概念の 3 つに参加するエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA を生成する新しい方法を開発した: 非常に安定した円形 RNA 足場への関心の RNA との共発現の挿入、遺伝子組換えの RNA 相互作用の蛋白質を持つ可能性が高い安定したリボ核蛋白質の複雑なを生成する細菌の顕著な量の蓄積は細胞¹²です。以前の開発と対照をなして完全にエシェリヒア属大腸菌、すなわちウイロイドに外国人、RNA 足場を使用しました。ウイロイドは非常に特定のタイプのみによって構成され、比較的小さい (246 401 nt) 高等植物の病原菌の円形の RNA の高いベース対¹³。興味深いことに、ウイロイドが非コード Rna と、独自のタンパク質からヘルプはありません、彼らが感染したホスト¹⁴で複雑な感染サイクルを完了することができます。これらのサイクルは、核や葉緑体、ウイロイド家族によって RNA を複製-PospiviroidaeまたはAvsunviroidae、それぞれ、感染した植物と宿主の防御的な応答の回避運動。ウイロイドは裸円形 RNA、感染植物細胞の敵対的な環境で生き残るために持っていることの結果として、本質的に最も安定した Rna にランクする必要があります。このプロパティは、バイオ テクノロジーの手法で組換え RNA を安定させるために足場として特に適してウイロイドをすることができます。さらに、新しいメソッドは、相互作用の植物蛋白質を持つウイロイド足場の共発現に基づいています。ウイロイドは、ホスト プロセスの別のステップを触媒する酵素を募集してローリング サークル メカニズムを介して複製されます。特にいくつかウイロイド、具体的に家族のAvsunviroidae¹⁵に属するものには、リボザイムもレプリケーションに関与しているが含まれています。ウイロイド種に応じてウイロイド Rna の転写は RNA ポリメラーゼ II のホストまたはクロロプ ラストのエンコードされた核 RNA ポリメラーゼ (NEP) によって媒介されます。ウイロイド処理ホストにより触媒されると思われる III 型 RNase オリゴマーの RNA をリボザイムとウイロイドの中間体は自己複製中に切断が。最後に、結果のウイロイド モノマーが円形、ウイロイド家族によってホスト DNA リガーゼ 1 または tRNA のリガーゼ^16,17のクロロプ ラストのアイソ フォームで。この最後の酵素は、ナスの潜在ウイロイド(ELVd)¹⁸などの家族Avsunviroidaeウイロイドの単量体の形態の結紮に関与しています。

ナス (ナスl.) によって認識を決定する ELVd のシーケンスと構造的要件を分析する作業の過程で tRNA のリガーゼ、エシェリヒア属大腸菌の両方の分子の共発現に基づく実験システムを設定¹⁹. 単位よりも長い ELVd 成績証明書は、自己効率的に埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによるエシェリヒア属大腸菌のセルでクリーブ、結果ウイロイドの単量体 5'-水酸基と 2'、3'-リン酸ジエステル テルミニいた私たちは気づいた共発現ナス tRNA のリガーゼによって効率的に円形。さらに、生じる円形ウイロイド RNA は、内因性 Rrna¹²を越えるエシェリヒア属大腸菌、予期しない高濃度に達した。複製中間体の不在では、これらの細菌細胞の ELVd RNA を増幅の欠如が示されます。興味深いことに、ウイロイド分子の特定の位置における異種 Rna の挿入は、円形のウイロイド由来 Rna¹²の蓄積でそれなりの効果を持っていた。これらの観測では、大量の組換え細菌における Rna を生成する方法を想像できた。この方法で ELVd cDNA に関心の Rna に対応する Cdna が挿入されます、結果の想像上の RNA は強力な構成のプロモーターを介して, 大腸菌で発現します。動作するようにシステムの大腸菌はナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドの共同変換しなければなりません。ELVd 派生ユニットよりも長くトラン スクリプトが埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理され、適切なテルミニを結果として得られるモノマーを認識し、共発現の tRNA のリガーゼによって円形します。このように、関心の RNA はウイロイド円形分子から成る非常に安定した円形の足場に挿入されます。この組換え想像上の RNA はおそらく更にエシェリヒア属大腸菌の細胞内のリボ核蛋白質 tRNA のリガーゼとの相互作用を介して複雑な形成による安定化します。このメソッドを使用して (以下のプロトコルを見なさい)、RNA アプタマー、ヘアピン Rna とその他の構造化された Rna 簡単に万人通常の実験室の条件で大腸菌文化の 1 リットルあたりミリグラムの量で生産され撮影の同質性に浄化されました。真円度¹²の利点。

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プロトコル

1. プラスミド構築

1. 逆転写 PCR RNA テンプレートから始める場合 (または) pcr 法による増幅 cDNA 発現プラスミドにアセンブリを許可する 5' 拡張子のプライマーを使用して興味の RNA に対応します。望ましくない突然変異を避けるため、ハイファイ DNA ポリメラーゼを使用します。
   1. ギブソン アセンブリ²⁰によって、発現プラスミドの cDNA を挿入する次の 5' 拡張子を PCR のプライマーに追加: 前方、5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';逆、5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';X は、関心の RNA のターミナルの両端に核酸の相同性を表します。
   2. 30 間インキュベート 98 ° c、s に続いて 10 の 30 サイクル 98 ° c、30 秒 55 ° C と 30 s 72 ° C、72 ° c. で 10 分の最終的な拡張で s
2. プラスミド pLELVd-IIS 型制限酵素Bpiの 10 U BZB のダイジェスト 100 ng 0.5 mL に 20 μ L 反応で 37 ° C で 1 時間私は G (10 mM pH 7.5、10 mM MgCl₂、50 mM NaCl トリス塩酸バッファー内チューブします。、0.1 mg/mL BSA)。
   注:すべてのプラスミドの対応する著者にリクエストも承ります。Bpi私は、掲示板に相当私。
3. TAE バッファー (40 mM 20 mM 酢酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.2 トリス) の 1% の agarose のゲルの電気泳動で PCR および消化製品を区切ります。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドの 200 mL の振動による 15 分のためのゲルを染色します。UV transilluminator を用いた DNA を視覚化し、 Bpi私消化プラスミド (2046 bp) メス刃を使用して増幅 cDNA に対応するバンドを切断します。
   注:Bpi私 pLELVd BZB の消化も LacZ 青白記者に対応する 528 bp 製品をリリースします。
4. (ゲルの材料表で DNA の回復キット) シリカゲル カラムを使用してゲル片から Dna を溶出して吸光光度分析法による DNA 濃度を定量化します。
5. アセンブリのギブソン反応増幅 cDNA と消化のプラスミドを使用して設定します。ベクター²⁰対挿入の 3 倍モル超過分を使用します。50 ° C で 1 時間インキュベートし、(DNA クリーン &テーブルの材料にコンセントレーター キット) シリカゲル カラムを用いた反応生成物を浄化します。
6. Electroporate 主務にギブソン アセンブリ反応の精製品を使用大腸菌 DH5α 。次の設定を適用 1 mm エレクトロポレーション キュベットを使用して、: 1,500 V と 5 さん加温カタボライト抑制と超最適化されたスープで 37 ° C で 1 時間 (SOC; 20 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、0.5 g/L の NaCl、KCl、2.5 mM 10 mM MgCl₂、20 mM グルコース、pH 7.0) 液体培地とルリア ベルターニカミラを広めにして (LB; 10 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 10 g/L) 寒天 (1.5%) を含む 50 μ G/ml アンピシリン プレートします。
   1. 変換されたエシェリヒア属大腸菌に対応するコロニーのための画面に挿入、electroporated 細胞をメッキする前に 15 分を組み込む可能性が高いクローンを広める 50 mg/mL の 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 30 μ Lジメチルホルムアミド。37 ° C で一晩版を孵化させなさい
7. いくつか白人の植民地をピックアップし、37 ° c 液体の LB 媒体で一晩成長します。浄化、miniprep を用いたプラスミド キット (材料の表を参照) とそのサイズを TAE バッファーに 1% の agarose のゲルの電気泳動によって分析します。
8. PLELVd BZB コントロールと比較して電気泳動の移行に基づいて最も可能性の高い組換えプラスミドを選択します。3 を使用してプライマー 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC - シーケンスで選択したプラスミドのシーケンスを確認 ' と 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' pLELVd BZB カセット式全逃げ。
   注:興味の cDNA に置き換えられます LacZ マーカーで 528 bp polylinker がこのプラスミドに含まれていることに注意してください。制限のマップ右のプラスミドを選択に役立ちます。

2. RNA 発現

1. Co electroporate (1.6 の条件を参照してください) 選択した大腸菌ひずみ (大腸菌BL21 または BL21 派生物) 共同を表現する興味およびプラスミド p15LtRnlSm の RNA に対応する cDNA を含む pLELVd-BZB-微分と、ナスの tRNA のリガーゼ。領域の長い二重鎖 Rna を表現するのにエシェリヒア属大腸菌RNase III²¹が不足している、HT115(DE3) を使用します。
   注: RNA 両方エシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写、mRNA の関心と tRNA のリガーゼ。この lysogen の存在は有害な影響を与えませんが、大腸菌の菌株で特急の T7 RNA ポリメラーゼ DE3 lysogen する必要はありません。
2. SOC 液体培地で 37 ° C で 1 時間培養後 electroporated 50 μ G/ml アンピシリンと 34 μ G/ml クロラムフェニ コールを含む LB 固体培地で細菌をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。
3. コロニーをピックアップし、1 L を接種する液体の素晴らしいスープ (TB) 媒体の 250 mL で三角フラスコを困惑 (12 g/L トリプトン 24 g/L 酵母エキス、0.4% のグリセロール、0.17 M KH₂PO₄、および 0.72 M K₂HPO₄)、50 μ g/mL アンピシリンを含む34 μ G/ml クロラムフェニ コール。180 回転/分 (rpm) で活発な動揺と 37 ° C で孵化させなさい。文化接種後 12 と 16 h の間の細菌を収穫します。

3. RNA の抽出・精製

1. 分析の目的のため必要な時点で文化の 2 mL 因数を取る 14,000 x gで 2 分間破棄上清の遠心分離機し、ボルテックスで TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、および 1 mM EDTA) の 50 μ L で細胞を再懸濁します。
   1. フェノール (水で飽和し、トリス-HCl、pH 8.0、8.0 ph 平衡) の 1:1 (v/v) ミックスの 1 つのボリューム (50 μ L) を追加およびクロロホルム。積極的なボルテックスしてセルを解除し、14,000 x gで 5 分間遠心分離して水溶液と有機相を分離します。
   2. 総細菌 RNA を含む水性相 (上側) を注意深く回復します。
      注: 準備は、その後の分析のための-20 ° C で保存できます。
2. 分取用 250 mL 遠心ボトルと 14,000 × g 10 分破棄上清のために細胞をスピンに文化を注ぐ。30 mL の水で再によってセルを洗浄します。遠心管に移し、再び同じ条件下で細胞をスピンします。
3. 上澄みを廃棄し、ボルテックスで 10 mL のクロマトグラフィー バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5, 150 mM の NaCl、0.2 mM EDTA) の細胞を再懸濁します。
   注:この時、他の瞬間に浄化を続行する-20 ° C で細胞を固定できます。
4. 新鮮なまたは解凍細菌の準備を使用して、1 ボリューム (10 mL) を追加することによりフェノール: クロロホルムの細胞を破る (3.2 を参照) とボルテックス精力的に。
5. 12,000 × gで 10 分間遠心、水性相を回復し、再 1 ボリューム (10 mL) の同じ条件の下でクロロホルムで抽出します。
   注:RNA の準備は、-20 ° C でこの時点で保存できます。
6. さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる総細菌 RNA を浄化します。45 μ m シリンジ フィルターと 1 mL ジエチルエタノールアミン (DEAE) 列の負荷によって RNA の準備をフィルター処理します。
   1. クロマトグラフィーの浄化のためには、1 mL/min の流速で液体クロマトグラフィー システムを使用します。サンプルの読み込みの前に 10 mL のクロマトグラフィー バッファーとコラムを平衡させ (手順 3.3 構成を参照してください)。
   2. サンプルをロードし、10 mL のクロマトグラフィー バッファーを洗い流します。20 ml の溶出バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5 では、1 M の NaCl、0.2 mM EDTA) の RNA を溶出し、1 ml を収集します。
      注: RNA はすぐに初期の分数でた。列はさらに精製再利用することができます。このため、10 mL の水を洗い流すし、20% エタノールで 4 ° C で保存します。
7. 組換え RNA 蓄積大腸菌で円形のフォームの大部分は、以降このプロパティは均質性¹²に浄化のため利益することができます。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (2 D ページ) 非変性と変性 (8 M 尿素) 条件^12,22の組み合わせによるリニア電源から円形の Rna を分離します。

4. RNA 解析

1. 5% のポリアクリルアミドゲルを準備 (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide、質量比) TBE バッファー (89 mM トリス、89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA) 含む 8 M 尿素で。
2. RNA 調剤のバッファー (98% ホルムアミド、10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.0025% ブロモフェノール ブルーと 0.0025% キシレンシアノール) 1 巻 (20 μ L) とのミックス 20 μ L 95 ° c 加熱ブロックで 1.5 分間インキュベートし、クールな氷の上。
3. ポリアクリルアミドゲルのサンプルをロードし、(例えば200 V で 2.5 h 2 mm ジェル x 130 x 140 を実行) のゲル寸法に応じて適切な条件で電気泳動を実行します。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドで 15 分間ゲルを染色、水で洗浄し、紫外線の下で RNA を視覚化します。

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結果

ELVd 派生システム¹²を使用してE. 大腸菌の組換え RNA を生産するには、目的の RNA は ELVd RNA 足場に移植しました。この想像上の RNA が共発現大腸菌でナスの tRNA のリガーゼに沿って。そこから関心の RNA が突出している、想像上の円形の RNA が可能性が高いリボ核タンパク質 (の細菌の細胞の顕著な濃度に達すると共発現ナ?...

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ディスカッション

ELVd シーケンスとナスの tRNA のリガーゼによって認識に関与する構造の要件を研究している間我々 は円形化ウイロイドの予期しない大規模な蓄積につながった非宿主大腸菌の両方の分子を共発現に気づいた細菌細胞¹⁹の形態。エシェリヒア属大腸菌の RNA ウイロイドの大きい蓄積最もおそらく比較的小さいなど、安定性の高い RNA 分子の共発現の結果であったこ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G