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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

Abstract

Con il crescente interesse per la biologia del RNA e l'impiego di molecole di RNA in sofisticate applicazioni biotecnologiche, i metodi per produrre grandi quantità di RNA ricombinante sono limitati. Qui, descriviamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli basato su co-espressione di una molecola chimerica che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Viroidi sono relativamente piccole, non codificanti, altamente abbinati in base RNAs circolari che sono infettivi per piante superiori. L'host pianta tRNA ligasi è un enzima reclutato da viroidi che appartengono alla famiglia Avsunviroidae, quali melanzane viroid latente (ELVd), per mediare circularization di RNA durante la replica di viroide. Anche se ELVd non replica in Escherichia coli, un precursore di ELVd è efficientemente trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli ed elaborato dai ribozimi hammerhead incorporato nelle cellule batteriche e i monomeri risultanti sono circolarizzazione della co-espressi ligasi di tRNA raggiungendo una notevole concentrazione. L'inserimento di un RNA di interesse in patibolo ELVd consente la produzione di decine di milligrammi di RNA ricombinante per litro di coltura batterica in condizioni normali di laboratorio. Una frazione principale del prodotto RNA è circolare, una caratteristica che facilita la purificazione del RNA ricombinante ad omogeneità virtuale. In questo protocollo, un corrispondente di DNA (cDNA) complementare al RNA di interesse viene inserito in una particolare posizione del cDNA ELVd in un plasmide di espressione che viene utilizzata, lungo il plasmide per co-esprimere melanzana-ligasi tRNA per trasformare e. coli. Co-espressione di entrambe le molecole sotto il controllo di promotori costitutivi forti porta alla produzione di grandi quantità di RNA ricombinante. il RNA ricombinante può essere Estratto da cellule batteriche e separato dalla massa di RNA batterico, approfittando della sua circolarità.

Introduzione

A differenza del DNA e proteine, protocolli per la produzione di semplice, efficiente ed economica di grandi quantità di RNA non sono abbondanti. Tuttavia, ricerca e industria domanda quantità crescenti di queste biomolecole per studiare le loro proprietà biologiche uniche1, o per essere impiegati in sofisticate applicazioni biotecnologiche, tra cui il loro uso come aptameri altamente specifico 2, agenti terapeutici3o pesticidi selettiva4. Sintesi chimica e trascrizione in vitro sono comunemente usati nella ricerca per produrre RNA. Tuttavia, questi metodi comportano limitazioni importanti quando grandi quantità di prodotti sono richiesti. La logica alternativa consiste nell'utilizzare i macchinari di trascrizione endogena delle cellule viventi, seguita da un processo di purificazione per separare il RNA di interesse dai compagni cellulari. Seguendo questa strategia, sono stati sviluppati metodi per produrre RNA ricombinante in cellule batteriche, quali il laboratorio-friendly Escherichia coli5 o la Marina viola phototrophic alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. maggior parte dei metodi per produrre RNA ricombinante nei batteri si basano sull'espressione di un'impalcatura nativa di RNA altamente stabile, come un tRNA o un rRNA, in cui il RNA di interesse è inserito7. Questo impone la necessità di liberare il RNA di interesse fuori la molecola chimerica, se la presenza di RNA supplementare è un problema per le applicazioni a valle8. Un altro concetto a ricombinante biotecnologie RNA è la produzione di complessi della ribonucleoproteina ricombinante che può essere il prodotto desiderato per sé o utilizzato come una strategia di protezione per aumentare la stabilità del RNA di interesse9, 10. Analogamente, la produzione di RNA circolare inoltre è stata suggerita come una strategia per generare più stabile prodotti11.

Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in e. coli che partecipa a tre dei concetti qui sopra: l'inserimento di RNA di interesse in un'impalcatura di RNA circolare altamente stabile e la co-espressione della RNA ricombinante con una proteina d'interazione probabile produrre una ribonucleoproteina stabile complessa che si accumula in quantità notevole in batterico cellule12. In contrasto con sviluppi precedenti, abbiamo usato un'impalcatura di RNA completamente estraneo ad e. coli, vale a dire un viroide. Viroidi sono un tipo molto particolare di agenti infettivi di più alte piante che sono costituite esclusivamente da un relativamente piccolo (246-401 nt) altamente abbinati in base circolare RNA13. Interessante, viroidi sono RNA non codificanti e, senza alcun aiuto di proprie proteine, sono in grado di completare cicli complessi infettive nel host infetti14. Questi cicli includono la replica di RNA-a-RNA nei nuclei o cloroplasti, a seconda della famiglia di viroide —Pospiviroidae o Avsunviroidae, rispettivamente — movimento attraverso la pianta infetta e l'evasione della risposta difensiva ospite. Viroidi devono essere allineati fra il RNAs più stabile in natura, come conseguenza di essere un RNA circolare nudo e dover sopravvivere in un ambiente ostile di cellule vegetali infetti. Questa proprietà può rendere particolarmente adatto come scaffold per stabilizzare ricombinante RNA in approcci biotecnologici viroidi. Inoltre, il nuovo metodo si basa sulla co-espressione dell'impalcatura viroide con un'interazione della pianta. Viroidi replicano attraverso un meccanismo di rotolamento-cerchio in quale host vengono reclutati gli enzimi per catalizzare le diverse fasi del processo. In particolare alcuni viroidi, in particolare quelli che appartengono alla famiglia Avsunviroidae15, contengono ribozimi che sono anche coinvolti nella replica. A seconda della specie di viroide, trascrizione di viroide RNAs è mediato dall'host RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi cloroplastica codificate (NEP). Elaborazione di viroide RNA sembra essere catalizzata da un host RNAsi di tipo III, anche se in viroidi con RNA oligomerici ribozimi intermedi self-fendono durante la replica. Infine, i monomeri viroide risultante sono circolarizzazione, a seconda della famiglia di viroide, la ligasi del DNA ospite 1 o l'isoforma cloroplastico di tRNA ligasi16,17. Questo ultimo enzima è coinvolto nella legatura delle forme monomeriche di viroidi nella famiglia Avsunviroidae, come melanzane viroid latente (ELVd)18.

Nel corso di un lavoro per analizzare i requisiti strutturali e sequenza di ELVd che determinano il riconoscimento di melanzana (Solanum melongena L.) ligasi tRNA, abbiamo istituito un sistema sperimentale basato sulla co-espressione di entrambe le molecole dentro e. coli 19. abbiamo notato che le trascrizioni di ELVd più lungo rispetto a unità self-fendono in modo efficiente in cellule di Escherichia coli attraverso i ribozimi hammerhead incorporato e che i monomeri viroide risultante con 5'-idrossile e 2', 3'-fosfodiestere termini erano in modo efficiente circolarizzazione dalla ligasi di tRNA melanzane co-espressi. Ancora di più, il RNA circolare viroide risultante ha raggiunto un'inattesa alta concentrazione in e. coli, superiori a quelle del endogeno rRNAs12. Assenza di replica intermedi indica la mancanza di amplificazione ELVd RNA-a-RNA in queste cellule batteriche. Interessante, inserimento di eterologa RNA in una particolare posizione della molecola viroide ha avuto un effetto moderato su accumulazione del RNAs circolare viroide-derivato12. Queste osservazioni ci ha fatto immaginare un metodo per produrre grandi quantità di ricombinante RNAs in batteri. In questo metodo, i cDNA corrispondente per il RNA di interesse vengono inseriti nel cDNA ELVd e il RNA chimerico risultante è espressa in e. coli attraverso un forte promotore costitutivo. Perché il sistema funzioni, e. coli devono essere co-trasformati con un plasmide per esprimere la melanzana ligasi di tRNA. La trascrizione di più-di-unità ELVd-derivato viene elaborata dai ribozimi hammerhead incorporato e i monomeri risultanti con termini appropriati sono riconosciuti e circolarizzazione dalla ligasi di tRNA co-espressi. In questo modo, il RNA di interesse viene inserito in un'impalcatura circolare molto stabile che consiste della molecola circolare viroide. Questo RNA chimerico recombinant molto probabilmente si è ulteriormente stabilizzata all'interno delle cellule di Escherichia coli mediante la formazione di una ribonucleoproteina complessa attraverso l'interazione con ligasi di tRNA. Utilizzando questo metodo (Vedi il protocollo qui sotto), RNA aptameri, hairpin RNA e altro RNAs strutturato è stati facilmente prodotto in quantità di decine di milligrammi per litro di coltura di Escherichia coli in condizioni di laboratorio regolari e purificato ad omogeneità prendendo vantaggio di circolarità12.

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Protocollo

1. plasmide costruzione

  1. Amplificare mediante PCR (o da trascrizione d'inversione PCR se partendo da un modello di RNA) il cDNA corrispondente al RNA di interesse utilizzando primer con 5' estensione che consente un assemblaggio nel plasmide di espressione. Per evitare indesiderate mutazioni, utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
    1. Per inserire il cDNA nel plasmide di espressione di Gibson Assemblea20, aggiungere le seguenti estensioni di 5' per gli iniettori PCR: in avanti, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; inverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X rappresenta nucleotidi omologhi alle estremità terminale del RNA di interesse.
    2. Incubare per 30 s a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C e un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
  2. Digest 100 ng di plasmide pLELVd-BZB con 10 U di enzima di restrizione di tipo-IIS Bpi I per 1h a 37 ° C in una reazione di 20 µ l in un 0,5 mL tubo nel buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Tutti i plasmidi sono disponibili su richiesta all'autore corrispondente. BPI È equivalente a Bbs ho.
  3. Separare i prodotti PCR e la digestione mediante elettroforesi in un gel di agarosio 1% in tampone TAE (40 mM Tris, 20 mM acido acetico, 1 mM EDTA, pH 7,2). Macchia del gel per 15 min agitando in 200 mL di 0,5 µ g/mL di bromuro di etidio. Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV e tagliare le bande corrispondenti a cDNA amplificato e il Bpi ho digerito plasmide (2046 bp) usando un bisturi.
    Nota: BPI Ho la digestione di pLELVd-BZB rilascia anche un prodotto bp 528 corrispondente al reporter LacZ blu-bianco.
  4. Eluire il DNAs dai frammenti gel utilizzando colonne di gel di silice (gel kit di recupero di DNA in Tabella materiali) e quantificare la concentrazione di DNA mediante analisi spettrofotometrica.
  5. Impostare una reazione di assemblaggio Gibson usando il cDNA amplificato e il plasmide digerito. Utilizzare un eccesso molare di 3 volte di inserto versus vettoriale20. Incubare per 1 h a 50 ° C e purificare i prodotti di reazione utilizzando una colonna di gel di silice (DNA pulito & kit di concentratore in Tabella materiali).
  6. Utilizzare i prodotti purificati della reazione Gibson assieme a electroporate competenti le cellule DH5α di e. coli . Utilizzando 1 mm elettroporazione cuvette, applicare le seguenti impostazioni: 1.500 V e 5 ms. Incubare per 1h a 37 ° C in brodo super ottimizzato con la repressione dei cataboliti (SOC; tryptone di 20 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, 0,5 g/L NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl2 20 millimetri di glucosio, pH 7.0) mezzo liquido e quindi diffusione sul Luria-Bertani (LB; tryptone di 10 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, 10 g/L NaCl) piastre di agar (1,5%) contenente 50 ampicillina di µ g/mL.
    1. Per schermare per colonie corrispondente trasformato Escherichia coli cloni che probabilmente incorporato l'inserto, 15 min prima di placcatura delle cellule elettroporate, diffondere 30 µ l di 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) in dimetilformammide. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C.
  7. Scegli diverse colonie bianchi e crescere durante la notte a 37 ° C in terreno liquido LB. Purificare plasmidi utilizzando un miniprep kit (Vedi Tabella materiali) e analizzare le loro dimensioni mediante elettroforesi in un gel di agarosio 1% in tampone TAE.
  8. Selezionare il plasmide ricombinante probabilmente basato su migrazione elettroforetica rispetto al controllo pLELVd-BZB. Confermare la sequenza del plasmide selezionato dall'ordinamento utilizzando primer 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' e 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' che fiancheggiano la cassetta di espressione tutta in pLELVd-BZB.
    Nota: Ricordate che questo plasmide contiene un grado di bp 528 con il marcatore di LacZ che viene sostituito con il cDNA di interesse. Mappatura di restrizione può aiutare a selezionare i plasmidi ricombinanti destra.

2. RNA Expression

  1. Co-electroporate (Vedi condizioni nella 1.6) il selezionato Escherichia coli ceppo (e. coli BL21 o un derivato di BL21) con il pLELVd-BZB-derivato che contiene il cDNA corrispondente al RNA di interesse e plasmide p15LtRnlSm co-esprimere il melanzana ligasi di tRNA. Utilizzare l' e. coli HT115(DE3), che manca di RNAsi III21, per esprimere RNAs con regioni lungo double-stranded.
    Nota: Sia il RNA di interesse e la ligasi di tRNA mRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli . Nessun lisogene DE3 per espresso T7 RNA polimerasi è necessaria nel ceppo di e. coli , anche se la presenza di questo lisogene ha effetti deleteri.
  2. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C in terreno liquido SOC, piastra individulamente batteri in mezzo solido LB contenente 50 µ g/mL ampicillina e cloramfenicolo µ g/mL 34. Incubare per una notte a 37 ° C.
  3. Scegli una Colonia e inoculare un 1L sconcertato beuta da 250 ml di liquido di copertura eccezionale brodo (TB) (tryptone di 12 g/L, 24 g/L di lievito estratto, 0,4% glicerolo, 0.17 M KH2PO4e 0,72 M K2HPO4), contenente ampicillina di 50 µ g/mL e 34 µ g/mL cloramfenicolo. Incubare a 37 ° C con agitazione vigorosa a 180 giri al minuto (rpm). Raccogliere batteri tra 12 e 16 ore dopo l'inoculazione di cultura.

3. RNA estrazione e purificazione

  1. Per scopi analitici, prendere le aliquote di 2 mL della cultura presso i punti di tempo desiderato e centrifugare a 14.000 x g per 2 min. scartare il supernatante e risospendere le cellule in 50 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA) nel Vortex.
    1. Aggiungere un volume (50 µ l) di una miscela 1:1 (v/v) di fenolo (imbevuto di acqua ed equilibrato pH 8.0 con Tris-HCl, pH 8.0) e cloroformio. Rompere le cellule nel Vortex vigoroso e separare le fasi acquose e organiche mediante centrifugazione per 5 min a 14.000 x g.
    2. Attentamente e recuperare la fase acquosa (in alto) contenente RNA batterico totale.
      Nota: Preparazioni possono essere conservate a-20 ° C per la successiva analisi.
  2. Ai fini della preparativa, versare cultura in un flacone da 250 mL centrifuga e centrifugare le cellule a 14.000 x g per 10 min. Discard surnatante. Lavare le cellule di risospensione in 30 mL di acqua. Trasferimento in una provetta da centrifuga e rotazione verso il basso le cellule ancora nelle stesse condizioni.
  3. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di tampone di cromatografia (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0,2 mM EDTA) nel Vortex.
    Nota: In questa fase, le cellule possono essere congelate a-20 ° C procedere con purificazione in qualsiasi altro momento.
  4. Usando una preparazione batterica fresca o scongelata, rompere le cellule aggiungendo 1 volume (10 mL) di fenolo: cloroformio (Vedi punto 3.2) e Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugare per 10 min a 12.000 x g, recuperare la fase acquosa e ri-estrarre con 1 volume (10 mL) di cloroformio nelle stesse condizioni.
    Nota: La preparazione di RNA può essere memorizzata a-20 ° C a questo punto.
  6. Purificare ulteriormente RNA batterico totale dalla cromatografia di scambio anionico. Filtrare la preparazione di RNA attraverso un 45 µm siringa filtro e carico su una colonna di diethylethanolamine (DEAE) di 1 mL.
    1. Per la purificazione di cromatografia, utilizzare un sistema di cromatografia liquida ad una portata di 1 mL/min. Prima di caricamento dei campioni, equilibrare la colonna con 10 mL di buffer di cromatografia (Vedi punto 3.3 per composizione).
    2. Caricare l'esempio e lavare la colonna con 10 mL di buffer di cromatografia. Eluire RNA con 20 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, NaCl di 1m, 0,2 mM EDTA) e raccogliere le aliquote di 1 mL.
      Nota: RNA eluisce rapidamente nelle frazioni iniziale. La colonna può essere riutilizzata per ulteriori purificazioni. Per questo, lavare la colonna con 10 mL di acqua e conservare a 4 ° C in etanolo al 20%.
  7. Da una parte importante del ricombinante che RNA si accumula dentro e. coli in una forma circolare, questa proprietà può essere profittata per purificazione di omogeneità12. Separare il RNAs circolare dalle controparti lineare mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide bidimensionale (2D pagina) che unisce non-denaturante e denaturazione (8m urea) condizioni12,22.

4. RNA analisi

  1. Preparare un gel di poliacrilammide del 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, rapporto tra massa) in TBE buffer (89 mM Tris, acido borico 89 mM, 2 mM EDTA) contenente 8 M urea.
  2. Mix 20 µ l di preparazioni di RNA con 1 volume (20 µ l) di caricamento buffer (98% formammide, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,0025% blu di bromofenolo e 0,0025% xilene cianolo), Incubare 1,5 min a 95 ° C in un blocco di riscaldamento e pressione cool sul ghiaccio.
  3. Caricare i campioni nel gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi a condizioni appropriate a seconda delle dimensioni del gel (ad esempio, eseguire 140 x 130 x 2 mm gel per 2,5 h a 200 V). Macchiare il gel per 15 min a 0,5 µ g/mL di bromuro di etidio, lavare con acqua e visualizzare RNA sotto luce UV.

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Risultati

Per produrre RNA di ricombinante in e. coli usando il sistema ELVd-derivato12, il RNA di interesse si innesta in un'impalcatura di RNA ELVd. Questo RNA chimerico è co-espresso lungo la melanzana ligasi di tRNA in e. coli. Una volta elaborati, spaccati e circolarizzazione, il RNA chimerico circolare, dalla quale sporge il RNA di interesse, costituisce probabilmente una ribonucleoproteina complessa con l'enzima di melanzane co-espresso che raggiung...

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Discussione

Mentre la ricerca i requisiti di struttura coinvolti nel riconoscimento della melanzana ligasi di tRNA ed ELVd sequenza, abbiamo notato che co-espressione di entrambe le molecole nel non host Escherichia coli ha condotto ad un grande accumulo imprevisto di viroide circolare forme in cellule batteriche19. Abbiamo capito che il grande accumulo di viroide RNA in e. coli era più probabilmente la conseguenza di cheesprimono una molecola di RNA altamente stabile, ad esempio il relativ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la tecnologia descritta in questo protocollo è stato brevettato (US Patent No. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP da Spagnolo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanziati fondi FEDER).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

Riferimenti

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