Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

Özet

Burada, ortak ilgi bir viroid iskele ve bir bitki RNA içeren bir chimeric RNA ifade ederek Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol mevcut tRNA ligaz. Ana ürün arıtma homojenliği için kolaylaştırır dairesel bir moleküldür.

Özet

Giderek artan bir ilgi RNA biyoloji ve sofistike biyoteknolojik uygulamaları RNA molekülleri kullanımı, rekombinant RNA'ların büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sınırlıdır. Burada, biz bir viroid iskele ve bir bitki ilgi RNA içeren chimeric molekülünün ortak ifade dayalı Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol tarif tRNA ligaz. Viroids daha yüksek bitkilerin bulaşıcı nispeten küçük, kodlamayan, son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA'lar vardır. Ana bitki tRNA ligaz olan RNA daireselleşmesi viroid çoğaltma sırasında aracılık Avsunviroidae, patlıcan gizli viroid (ELVd), gibi ailesine ait viroids tarafından işe bir enzim. Her ne kadar ELVd E. coliçoğaltmak değil, bir ELVd öncül verimli E. coli RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ve bakteri hücreleri içinde katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenen ve elde edilen monomerleri tarafından circularized ortak ifade tRNA ligaz dikkate değer bir konsantrasyon ulaşan. Bir RNA ilgi ELVd iskele içine ekleme normal laboratuvar koşullarında bakteriyel kültürünün litre başına rekombinant RNA miligram onlarca üretimini sağlar. RNA ürün ana bir kısmını yuvarlaktır sanal homojenliği için rekombinant RNA arıtma kolaylaştırır bir özellik. Bu protokol için tamamlayıcı DNA (cDNA) faiz RNA için karşılık gelen bir ELVd cDNA belirli bir pozisyon, patlıcan tRNA ligaz, ortak ifade etmek için plazmid E. colidönüştürmek için kullanılan bir ifade plazmid olarak eklenir. Güçlü kurucu Rehberleri kontrol altında her iki moleküllerin ortak ifade rekombinant RNA büyük miktarda üretim için açar. Rekombinant RNA bakteriyel hücrelerinden çıkarılan ve onun Döngüsellik yararlanarak bakteriyel RNA'ların toplu ayrılmış.

Giriş

DNA ve proteinler aksine kolay, verimli ve düşük maliyetli üretim RNA büyük miktarda protokollerde bol değildir. Ancak, biyoteknolojik uygulamaları, çok özel aptamers olarak bunların kullanımı da dahil olmak üzere araştırma ve Sanayi talep onların benzersiz biyolojik özellikleri¹araştırmak veya istihdam için bu biomolecules miktarda artan sofistike ², terapötik ajanlar³veya selektif pestisit⁴. İn vitro transkripsiyon ve kimyasal sentez yaygın olarak araştırmada RNA üretmek için kullanılır. Ancak, büyük miktarda ürün gerekli olduğunda bu yöntemler önemli sınırlamalar gerektirecektir. Mantıksal alternatif hücresel arkadaşları faiz RNA'lar ayırmak için bir arıtma işlemi ardından yaşam hücrelerinin endojen transkripsiyon makine kullanmaktır. Bu stratejiyi yöntemleri geliştirilmiştir laboratuvar dostu gibi bakteri hücreleri içinde rekombinant RNA'ların üretmek için Escherichia coli⁵ veya deniz mor Kemotrofik Alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum ⁶. bir tRNA ya da RNA ilgi olduğu bir rRNA⁷eklenen gibi bakterilerde rekombinant RNA üretmek için pek çok yöntem bir yerel son derece kararlı RNA iskele ifade üzerinde güveniyor. İlave RNA varlığı⁸karşıdan akış uygulamaları için bir sorun ise bu çıkar chimeric molekül RNA bırakmadan gerekliliği getirir. Başka bir kavram olarak rekombinant RNA biyoteknoloji istenen ürün başına olabilir veya faiz^{9RNA kararlılığını artırmak için koruyucu bir strateji olarak kullanılan rekombinan Ribonükleoprotein kompleksleri yapımıdır, 10}. Benzer şekilde, dairesel RNA'ların üretimi daha istikrarlı ürünleri¹¹oluşturmak için bir strateji olarak sürülmüştür.

Biz son zamanlarda üç yukarıdaki kavramlar katılan E. coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yeni bir yöntem geliştirdik: son derece kararlı bir dairesel RNA iskele ilgi RNA ve ortak bir ifade ekleme bakteriyel dikkate değer miktarlarda biriken büyük olasılıkla istikrarlı Ribonükleoprotein karmaşık üretmek için rekombinant RNA etkileşen bir protein ile¹²hücreleri. Aksine önceki gelişmeler, E. coliiçin yani bir viroid tamamen yabancı bir RNA iskele kullandık. Viroids sadece nispeten küçük tarafından (246-401 nt) oluşturulan daha yüksek bitkilerin bulaşıcı ajanlar çok özel bir türü vardır son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA¹³. İlginçtir, viroids RNA'ların kodlamayan ve kendi proteinler hiçbir yardımıyla, onlar virüslü ana¹⁴karmaşık bulaşıcı döngüleri tamamlamak mümkündür. Bu döngüleri çekirdeği veya kloroplast, viroid aile bağlı olarak RNA, RNA-RNA çoğaltma dahil —Pospiviroidae veya Avsunviroidae, sırasıyla — hareket virüslü bitki ve konak savunma yanıtının kaçakçılığı. Viroids doğada, çıplak bir dairesel RNA olmak ve enfekte bitki hücreleri düşmanca bir ortamda hayatta kalmak sahip bir sonucu olarak en istikrarlı RNA'ların arasında yer gerekir. Bu özellik viroids iskele rekombinant RNA biyoteknolojik yaklaşımlar stabilize etmek için özellikle uygun hale getirebilir. Buna ek olarak, yeni yöntemi ile etkileşen bir bitki protein viroid iskele iş ifade temel alır. Viroids hangi ana enzimler işleminin farklı adımları katalizler işe bir haddeleme-daire mekanizması ile çoğaltma. Özellikle bazı viroids, özellikle bu aile Avsunviroidae¹⁵' e, ait Ayrıca çoğaltmaya katılan çokluğunun içerir. Viroid tür bağlı olarak, viroid RNA transkripsiyonu RNA polimeraz II ana bilgisayar veya chloroplastic kodlanmış nükleer RNA polimeraz (NEP) tarafından aracılık ettiği. Viroid RNA işleme görünmek-e doğru ev sahibi tarafından katalize tip III RNase, her ne kadar viroids ile çokluğunun oligomeric RNA içinde ara ürün çoğaltma sırasında kendi kendine ayırmak. Son olarak, elde edilen viroid monomerleri, viroid aile bağlı olarak, ana bilgisayar DNA ligaz 1 veya chloroplastic izoformu tRNA ligaz^16,17circularized. Bu son enzim ligasyonu patlıcan gizli viroid (ELVd)¹⁸gibi aile Avsunviroidae, viroids monomeric formları ilgilenmektedir.

Patlıcan (Solanum melongena L.) tarafından tanıma belirleyen sıralı ve yapısal gereksinimlerini ELVd analiz etmek için bir çalışma sırasında tRNA ligaz, biz ortak ifade E. coli hem moleküllerin dayalı deneysel bir sistem kurmak ¹⁹. biz birim daha uzun ELVd transkript verimli katıştırılmış hammerhead çokluğunun ile E. coli hücrelerde kendi kendine ayırmak olduğunu ve elde edilen viroid monomerleri ile 5'-hidroksil ve 2' 3'-fosfodiester termini olduğunu fark verimli bir şekilde birlikte ifade patlıcan tRNA ligaz tarafından circularized. Daha da, elde edilen dairesel viroid RNA E. coli, beklenmeyen bir yüksek konsantrasyon endojen rRNA'lar¹²olanların aşan ulaştı. Çoğaltma intermediates yokluğu ELVd RNA, RNA-RNA amplifikasyon bu bakteri hücreleri içinde eksikliği gösterilir. İlginçtir, viroid molekülünün belirli bir konumda Contegra RNA'ları ekleme döngüsel viroid kaynaklı RNA'ların¹²birikimi ılımlı bir etkisi vardı. Bu gözlem bize rekombinant RNA'ların bakterilerde büyük miktarlarda üretmek için bir yöntem öngörülüyor yaptı. Bu yöntemde, faiz RNA'lar için karşılık gelen cDNAs ELVd cDNA eklenir ve elde edilen chimeric RNA güçlü bir bünye organizatörü E. coli ifade edilir. Sistemin çalışması için E. coli patlıcan tRNA ligaz ifade etmek için bir plazmid ile birlikte dönüştürülmesi gerekir. ELVd elde edilen birim daha uzun transkript katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenir ve uygun termini ile elde edilen monomerleri tanınır ve ortak ifade tRNA ligaz tarafından circularized. Bu şekilde ilgi RNA çok kararlı bir dairesel iskele viroid dairesel molekülünün oluşan eklenir. Bu rekombinant chimeric RNA en büyük ihtimal daha fazla bir Ribonükleoprotein tRNA ligaz ile etkileşimi aracılığıyla karmaşık oluşumu tarafından E. coli hücrelerin içinde stabilize. Bu yöntemi kullanarak (bkz: protokolü aşağıdaki), RNA aptamers, saç tokası RNA'ların ve diğer yapısal RNA'ların edilmiş kolayca litre başına miligram E. coli kültür düzenli laboratuvar koşullarında onlarca miktarda üretilen ve alarak homojenliği için saf Döngüsellik¹²avantajı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. plazmid İnşaat

1. PCR (veya Ters transkripsiyon bir RNA şablonundan yola PCR) yükseltmek RNA ifade plazmid derlemeye izin vermek için 5' uzantısıyla primerler kullanılarak ilgi karşılık gelen cDNA. İstenmeyen mutasyonlar önlemek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanın.
   1. CDNA ifade plazmid Gibson derleme²⁰tarafından eklemek için aşağıdaki 5' uzantıları PCR astar ekle: ileri, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; geri, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X nükleotit homolog faiz RNA terminal sonuna kadar temsil eder.
   2. 30 için kuluçkaya s 98 ° C'de 10 30 döngüsü tarafından takip 98 ° c, 30 s s 55 ° C ve 30 s 72 ° C ve 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı
2. Plazmid pLELVd-BZB 10 U türü IIS Restriksiyon enzimi BPI ile in Özet 100 ng ben 0,5 ml 20 µL tepki olarak 37 ° C'de 1 h için G (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl arabellekte tüp 0.1 mg/mL BSA).
   Not: Tüm plazmid yazarın isteğine sağlanmaktadır. BPI Bbs için eşdeğer ben.
3. PCR ve sindirim ürünleri TAE arabelleği (40 mM Tris, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA, pH 7.2) % 1'özel jel elektroforez ile ayırın. Jel 15dk için 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür 200 mL içinde sallayarak leke. UV transilluminator kullanarak DNA görselleştirmek ve güçlendirilmiş cDNA ve bir neşter bıçak kullanarak BPI -sindirmek plazmid (2046 bp) karşılık gelen grup kesti.
   Not: BPI Ben pLELVd-BZB hazım da serbest bırakmak LacZ mavi-beyaz muhabir için karşılık gelen bir 528 bp ürün.
4. Silika jel sütunları (DNA kurtarma seti malzemeleri tablojel) kullanarak jel parçaları DNA'lar elute ve DNA toplama göre spektrofotometrik analiz ölçmek.
5. Güçlendirilmiş cDNA ve sindirilmiş plazmid kullanarak bir Gibson derleme tepki kadar ayarla. Vektör karşı Ekle²⁰3 kat molar fazlalığı kullanın. 1s 50 ° c için kuluçkaya ve reaksiyon ürünleri bir silika jel sütun (DNA temiz ve yoğunlaştırıcı kiti Malzemeler tablo) kullanarak arındırmak.
6. Electroporate yetkili Gibson derleme tepkimden arıtılmış ürünleri kullanmak E. coli DH5α hücreleri. 1-mm Elektroporasyon cuvettes kullanarak, aşağıdaki ayarlar uygulanır: 1,500 V ve 5 Bayan Incubate catabolite baskı ile süper optimize et suyu içinde 37 ° C'de 1 h için (SOC; 20 g/L tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 0.5 g/M NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂ 20 mM glikoz, pH 7,0) sıvı orta ve sonra yayılmasını Luria-Bertani üzerine (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 10 g/M NaCl) agar (% 1.5) içeren 50 µg/mL ampisilin tabaklar.
   1. Dönüştürülmüş E. coli için karşılık gelen kolonileri için ekran büyük olasılıkla INSERT, electroporated hücreleri kaplama önce 15 dk dahil klonlar yayılmış olarak 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) içinde 30 µL dimethylformamide. Tabak gecede 37 ° C'de kuluçkaya
7. Beyaz sömürgeler almak ve sıvı LB medya 37 ° C'de gecede büyümek. Arındırmak bir miniprep kullanarak plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve boyutlarının TAE arabelleği % 1'özel jel elektroforez tarafından analiz.
8. Elektroforetik geçiş pLELVd-BZB denetimine göre temel olasılıkla rekombinant plazmid seçin. Astar 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3 kullanarak sıralama tarafından seçilen plazmid dizi Onayla ' ve 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' pLELVd-BZB tüm ifade kasete kuşatın.
   Not: Bu plazmid faiz cDNA tarafından değiştirilir LacZ marker ile 528 bp polylinker içerdiğini unutmayın. Kısıtlama eşleme şu rekombinant plazmid seçmek için yardımcı olabilir.

2. RNA ifade

1. Co-electroporate (1.6 koşullara bakınız) seçilen E. coli süzün (E. coli BL21 veya BL21 türevi) ile pLELVd BZB ilgi ve plazmid p15LtRnlSm RNA ortak ifade etmek için karşılık gelen cDNA içeren türev Patlıcan tRNA ligaz. E. coli RNase III²¹yoksun, HT115(DE3) RNA'ların uzun çift iplikçikli bölgeleri ile ifade etmek için kullanın.
   Not: Her iki RNA ilgi ve tRNA ligaz mRNA transkripsiyonu E. coli RNA polimeraz tarafından. Bu lysogen varlığı hiçbir zararlı etkisi yoktur rağmen hiçbir DE3 lysogen için hızlı T7 RNA polimeraz e.coli suşu gerekir.
2. SOC sıvı ortamda 37 ° C'de 1 h kuluçka sonra 50 µg/mL ampisilin ve 34 µg/mL kloramfenikol içeren LB katı orta electroporated bakteri plaka. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
3. Bir koloni almak ve bir 1 L aşılamak Erlenmeyer şişesi 250 mL sıvı müthiş suyu (TB) orta ile şaşkın (12 g/L tryptone, 24 g/L maya ekstresi, %0,4 gliserol, 0,17 M KH₂PO₄ve 0,72 M K₂HPO₄), 50 µg/mL ampisilin içeren ve 34 µg/mL kloramfenikol. 37 ° C'de (devir/dakika) dakikada 180 devrimler, güçlü sallayarak ile kuluçkaya. Bakteri 12 ve 16 s arasında kültür aşı sonra hasat.

3. RNA çıkarma ve arıtma

1. Analitik amaçlı 2 mL aliquots kültür arzu etmek zaman puan almak ve 14.000 x g 2 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi ve TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 1 mM EDTA) 50 µL hücrelerde vortexing tarafından resuspend.
   1. Bir birim (50 µL) (su ile doymuş ve pH 8.0 Tris-HCl, pH 8.0 ile equilibrated) fenol 1:1 (v/v) karışımı ekleyin ve kloroform. Tarafından dinç vortexing hücreler kırmak ve sulu ve organik aşamaları Santrifüjü 14.000 x gde 5 min için tarafından ayrı.
   2. Toplam bakteri RNA içeren sulu aşamaları (üst) dikkatli bir şekilde kurtarmak.
      Not:-20 ° c daha sonraki analiz için hazırlıklar depolanabilir.
2. Partiye hazırlık amacıyla kültür 250 mL santrifüj şişe ve 14.000 x g için 10 dk. atma süpernatant hücreleri aşağı spin içine dökün. Hücreleri 30 mL su resuspending tarafından yıkayın. Bir santrifüj tüpü aktarmak ve spin hücreleri tekrar aynı koşullar altında aşağı.
3. Süpernatant atın ve 10 mL Kromatografi arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA) hücrelerde vortexing tarafından resuspend.
   Not: Şu anda, hücreleri arıtma her an devam etmek için-20 ° C'de donmuş olabilir.
4. Taze veya çözdürülen bakteriyel hazırlık kullanarak, hücreleri 1 birim (10 mL) ekleyerek fenol: kloroform break (bkz. Adım 3.2) ve vortexing şiddetle.
5. 12.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi, sulu faz yeniden elde etmek ve aynı koşullar altında kloroform 1 hacmi (10 mL) ile yeniden ayıklayın.
   Not: RNA hazırlık bu aşamada-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
6. Daha fazla toplam bakteri RNA anyon-Satım Kromatografi tarafından arındırmak. RNA hazırlık bir 45 µm şırınga filtre ve 1 mL diethylethanolamine (DEAE) sütun üzerindeki yükü üzerinden filtre.
   1. Kromatografi arıtma için 1 mL/dk debi sıvı kromatografi sistemi kullanın. Yükleme örnek önce sütun Kromatografi arabellek 10 mL ile equilibrate (bkz. Adım 3.3 kompozisyon için).
   2. Örnek yüklemek ve sütun Kromatografi arabellek 10 mL ile yıkayın. RNA elüsyon arabellek (50 mM Tris-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 mM EDTA) ile 20 mL elute ve 1 mL aliquots toplamak.
      Not: RNA hızlı bir şekilde ilk kesirler elutes. Sütunu daha da purifications için yeniden kullanılabilir. Bunun için sütun 10 mL su ile yıkayın ve % 20 etanol içinde 4 ° C'de depolayın.
7. Rekombinant RNA E. coli içinde dairesel formda biriken önemli bir bölümünü beri bu özellik arıtma homojenliği¹²kazançlı. Dairesel RNA'ların doğrusal karşıtları sigara denaturing ve (8 M üre) koşulları^12,22denaturing birleştiren iki boyutlu polyacrylamide jel elektroforez tarafından (2D sayfa) ayırın.

4. RNA Analizi

1. %5 polyacrylamide jel hazırlamak (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, kütle oranı) TBE tampon (89 mM Tris, 89 mM Borik asit, 2 mM EDTA) içeren 8 M üre içinde.
2. Mix 20 µL RNA hazırlıkların arabellek (% 98'i formamide, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, %0.0025 bromophenol mavi ve %0.0025 ksilen cyanol), yükleme 1 birim (20 µL) ile 95 ° c Isıtma bloğundaki 1,5 dk için kuluçkaya ve serin buz üzerinde oturtun.
3. Polyacrylamide jel örneklerinde yük ve Elektroforez jel boyutları (140 x 130 2,5 h için 2 mm jelleri x 200 V çalıştırmakÖrneğin,) bağlı olarak uygun koşullar çalıştırın. 15 dakika içinde 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür jel leke, su ile yıkayın ve UV ışığı altında RNA görselleştirmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Rekombinant RNA E. coli ELVd kaynaklı sistem¹²kullanarak üretmek için faiz RNA bir ELVd RNA iskele aşılı. Bu chimeric RNA E. colipatlıcan tRNA ligaz boyunca ortak ifade. İşlenen, i ciddi ve circularized sonra chimeric dairesel RNA, RNA ilgi içinden dışarı çıkar, büyük olasılıkla bir Ribonükleoprotein bakteri hücreleri ( dikkat çekici konsantrasyon ulaşır ortak ifade patlıcan enzim ile karmaşık formla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

ELVd sırası ve yapısı gereksinimleri tanıma patlıcan tRNA ligaz ile ilgili araştırma yaparken, biz liderliğindeki viroid dairesel büyük beklenmedik bir birikimi olmayan ana bilgisayar E. coli hem moleküllerin Co bu ifadeyi fark formları bakteri hücreleri¹⁹. Biz viroid RNA E. coli olarak büyük birikimi en büyük olasılıkla son derece kararlı bir RNA molekülü, nispeten küçük gibi ortak ifade sonucu olduğunu anladım (333 nt), son derece dayalı eşleştiri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarose	Conda	8010	D1 low EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Acetic acid	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Ethidium bromide	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel DNA Recovery	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Tryptone	Intron Biotechnology	Ba2014
Yeast extract	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicillin	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-Dimethylformamide	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plasmid	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glycerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Phenol	Scharlau	FE04791000	90%
Chloroform	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Boric acid	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamide	PanReac AppliChem	A0937,2500
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xylene cyanol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine	Sigma-Aldrich	A4929-5G