ガラス化と地球温暖化の手順中に胚盤胞の行動の客観的評価のための形態のプロトコル

要約

タイムラプス形態プロトコル previtrification 介入および地球温暖化後の復旧中に再拡張胚盤胞の収縮の強さを次にご紹介します。プロトコルのアプリケーションは体外受精所タイムラプス顕微鏡装備で可能であるし、最適な胚盤胞のガラス化法の開発にお勧めします。

要約

この資料では、ガラス化の前後に個々 のフェーズ中に変更する胚盤胞の量の正確な監視のタイムラプス顕微鏡写真に基づいて胚盤胞の形態の非侵襲的方法について説明します。メソッドは、胚盤胞の収縮と再拡張別の前と後のガラス相を観察することによって胚盤胞凍結保護剤の濃度の異なる暴露の最適のタイミングを探しに役立ちます。この方法では、胚盤胞ガラス化プロトコルを最適化できます。この計測法の有用性の良いデモ、ガラス化のための 2 つの異なる胚盤胞準備のプロトコルが比較されます。折りたたみ人工の胞胚腔を使用して 1 つとガラス化する前にこの介入なし。両方、胚盤胞の体積はタイムラプス顕微鏡写真に続いて、写真編集ソフトウェア ツールで測定されました。Previtrification の段階で 20 秒ごとと 5 分後に地球温暖化の期間に、測定されます。時間ユニットごとの胚盤胞の寸法の変更は、線図でグラフィカルに表示されます。そのまま胚盤胞が縮小する最初と、ゆっくりとリフィルを胞胚腔は、液体で満たされた胞胚腔とガラスに入る長い平衡 previtrification 相を示した。人工的に折りたたまれた胚盤胞の全体の平衡の段階によって縮められた段階のままです。ガラス化段階では、それも変更されませんそのボリューム。以来、胚盤胞の形態は、previtrification ステップの間に人工的に折りたたまれた胚盤胞の一定量を示しています、それはこの段階が短いかもしれないようです。記述されていたプロトコル中に、速度とボリュームの変更、一部胞胚腔収縮または合計胚盤胞の数の強度に基づいて凍結保存後胚盤胞の多くの追加比較パラメーターを提供します崩壊し孵化する、または合計胞胚腔の再膨張する時間。

概要

プログラムには体外受精 (IVF) 着床前胚の凍結保存は最近ほとんど体外受精研究室でルーチンの練習です。特定の凍結と氷核生成 (シード) が誘導されたとき、-7 ° C までの胚の制御冷却を可能にしたコンピューター制御冷凍庫の導入により、1985 年に臨床的に使用される遅い胚凍結法を始めた、周辺凍害中¹。連続冷却による氷の結晶成長、hyperosmolality の残りの液体の部分と、その結果、脱水症状を引き起こしていると胚細胞の収縮。-30 ° C または-80 ° C で、胚は長期保管のため、液体窒素に飛び込んだでしょう。冷却中に胚や卵子で起こっていた凍結プロトコル²を改善する助けバリアフリー cryomicroscopes だけで観察できます。高いボリュームおよびより多くの流体に含まれる胎生期胚盤胞の凍結は、これらの日³の少ない有望な臨床結果を与えた。

画期的な胚盤胞の凍結保存細胞の脱水が高濃度の凍結保護剤⁴を使用して冷却する前に場所を取ったガラス化法の導入であった。2 栄養外胚葉細胞⁵間機械開口することによってガラス化する前に胞胚腔から液体の除去が可能します。新鮮な転送後、子宮腔内に胚盤胞の凍結融解の転送は結果にほぼ匹敵するガラス化と温暖化後即時胚盤胞の生存率は 90% と臨床結果次の上この凍結保存法の胚は、まだされていない標準化された^6,7。ガラス化プロトコルと (a)、(b) previtrification ステップ数凍結保護剤の濃度 (c) 個々 のステップ、(d) ガラスの前に崩壊か、人工の胞胚腔の利用期間によって異なります (e)。⁸を砥石で胚がする必要がありますメソッド、(f) 胚盤胞拡張ステージ、および (g) 平衡/ガラス化温度を崩壊します。凍結保護剤は、細胞毒性することができます、ので、定義もこれらのソリューションに胚盤胞の露出時間。ただし、いくつかの凍結保存メディア メーカーは、非常に柔軟なプロトコルを許可します。

科学者の関心は通常注入^6,9,10のより良い予測を用いた新しいバイオ マーカーを見つけることを目的に胚盤胞の再拡張能力を勉強に焦点を当てた。ヒト胚盤胞ガラス化胚盤胞のガラス化と温暖化後はどう前に凍結保護剤を追加する別の手順で水分を取り除く、どのようにいつ凍結細胞と胚盤胞が水分補給方法から削除するが、温暖化の後を再展開でなく説明も理解はします。目的のための方法論の開発と異なる凍結保存の手順中に胚盤胞の行動の定量化された監視は、したがって、理論的根拠です。

様々 なメーカーのタイムラプス顕微鏡だは今前の胚盤胞の挙動と後ガラス化フェーズを監視することが可能。追加のコンピューターのツールを含む、によって (形態) のサイズの測定も可能です。減少を測定や、特定の時間で胚のサイズが増加の退避と復元の間に胚の形態制御の評価を客観化することが可能です。

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プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、2016 年 4 月 19 日 (号 0120-204/2016-2) に国立医療倫理委員会で承認されています。

1. 顕微鏡記録システムのセットアップ

1. 顕微鏡の加熱プレートをオフにします。
2. すべての治療前にカメラ付きの倒立顕微鏡下で胚盤胞のスナップショットを取る。胚盤胞の記録の倍率に注意してください。

2. 選択と胚盤胞のガラス化のための Prepreparation

1. 唯一完全に展開された日 5 または日 6 胚盤胞、少なくともいくつかの内部細胞質量 (ICM) と凝集栄養外胚葉と凍結保存用を選択します。
2. レーザー治療胚盤胞崩壊した胞胚腔での件名に至る 4.3 9.4 μ m 穴径の短いレーザー パルス (0.4 - 0.7 ms) に胚盤胞は透明帯と 2 つの隣接した trophectodermal 細胞の接合部で接線方向監督。5 分間完全にまたは部分的に崩壊に胚盤胞を許可します。
3. そのまま胞胚腔と未処理胚盤胞のガラス化保存前に特定の治療法実行しません。
   注: これらの胚盤胞はそのままと見なされます。

3. 平衡相の保護剤の検討とシャーレの準備

1. 無菌平衡メディアに合わせて卵母細胞侵食 (直径 135 μ m) の使用 pithe ピペット (20% 7.5% エチレング リコール、7.5 %dmso を M-199 HEPES バッファー媒体 DSS) 身障者用 9 よくペトリ皿の液滴領域の穴に微速度顕微鏡観察と記録。
   注: 卵母細胞の侵食は卵丘細胞卵母細胞の周囲を削除するプロセスです。卵母細胞の侵食のためピペットの使用は、空気の泡の作成を回避するのに役立ちます。
2. 平衡メディアの 30 μ L で液滴領域をオーバーレイします。

4. 平衡ソリューションで胚盤胞の転送

1. 室温 (平衡の段階) で 10 分間点滴皿の液滴領域の下部に平衡する媒体にレーザー治療、あるいはそのまま胚盤胞が水没します。
2. 平衡の中に胚盤胞を転送できるだけ早く 10 分のカウント ダウンを開始します。

5. 平衡段階で胚盤胞の記録

1. カメラ付き顕微鏡液滴煮は、胚盤胞を転送します。同じ胚盤胞のスナップショットの前に同じ倍率を使用します。位置、液滴料理記録の中心部に約胚盤胞が表示されるようです。
2. 顕微鏡の録音ソフトで録音を開始します。録音を開始するカウント ダウン時間に注意してください。
   注: は、平衡の解決に 10 分露出の間に、そのまま (図 1ビデオ 1) と折りたたまれた胚盤胞 (図 2ビデオ 2) の録音の代表の結果を参照してください。

6. 胚盤胞のガラス化保存

1. 無菌シャーレのカウント ダウンが終わる前に 2 分でガラス固化ソリューション (15 %dmso、エチレング リコール 15%、20 %dss、0.5 M ショ糖中 HEPES バッファー M-199) の 50 μ L ドロップを施します。
2. 10 分のカウント ダウンが終了し、30 のガラス固化ソリューションに胚盤胞をすばやく転送を記録を停止室温で s。
3. 優しくピペットの胚盤胞ガラス化ソリューション内で少なくとも 1 つの x。
4. 胚盤胞の読み込みにガラス化のわらを使用します。読み込み、シール、およびわらのガラスに突入 80 内液体窒素 (LN) s、110 を超えない s ガラス化溶液への初期の暴露後。

7 平衡相の間に記録された胚盤胞のビデオ編集

1. 録画したビデオ ファイルをビデオ編集ソフトウェアにインポートします。
2. この時点で、タイムライン スライダーを 20 s. 注フレーム番号に移動します。
   注: 不要なビデオ フレームを台無しにこの番号が使用されます。フレームのみのすべての 20 秒が使用されます。
3. [ビデオ] タブの [フレーム レート...をクリックします。[フレーム レート変換、デシメーションでフィールドを確認し、上記フレーム番号を入力します。[Ok]をクリックして確定します。ファイル→エクスポートをクリックして画像。
4. 出力形式として JPEG を選択保存した画像のシーケンスを保持するディレクトリを設定し、 [ok]をクリックします。
   注: 記録された胚盤胞まで 30 の画像のシーケンスでガラス化の平衡の段階でディレクトリを作成これが。

8. 胚盤胞の平衡の段階で作成したイメージから断面積の測定

1. ビデオ分析ソフトウェアを開きます。[ウィンドウ] タブをクリックし、タイムラインを選択します。
2. タイムライン ウィンドウで、フィルム ストリップの記号をクリックし、ガラス化の平衡化フェーズの前に胚盤胞のイメージを追加するメディアを追加... ] を選択、いずれかがあった場合、レーザーの介入の前に。
   注: このイメージは、ほとんどの拡大された状態で胚盤胞を表示され、その断面積が参照として使用されます。
3. 以前 (ガラス化の平衡の段階) のビデオ編集ソフトウェアで生成された対応する胚盤胞の画像シーケンスを追加します。
4. イメージ→解析→データ ポイントを選択する行くカスタムデータ ポイントを選択] ウィンドウを開きます。
5. すべてのデータ ポイントを選択解除領域だけを選択し、 [ok]をクリックして確認します。
6. [タイムライン] ウィンドウで最初の画像をタイムライン スライダーを移動します。
7. ウィンドウのタブをクリックし、ツールを選択します。
   注: これは左側のツール パネルをアクティブになります。
8. クイック選択ツールを選択します。
9. 胚盤胞の端をタッチする胚盤胞の内部ツール マーカーを配置します。クリックすると胚盤胞の外側の端にツール マーカーを配置することによって胚盤胞を概説し、マウスの左ボタンを押したまま、全体の胚盤胞の断面積まで胚盤胞の外側のエッジに沿ってツール マーカーをドラッグすることを選択します。
   注: 透明帯はありませんする必要がありますので、測定の一部除外 (図 5)。
10. タイムライン ウィンドウで計測ログ] をクリックし、計測値を記録ボタンを押します。
    注: これは選択した領域を記録します。
11. タイムラインに戻る、画像の上を右クリックし、選択を解除を選択します。
12. 下にある対応するタイルをクリックしてタイムライン スライダーを次の画像に移動します。
13. クイック選択ツールで新しいイメージの胚盤胞を概説します。測定を繰り返します。
14. この手順 (手順 8.9 8.13) した画像を繰り返してすべての画像の断面積を測定し、記録します。
15. 最後に、計測ログに領域の変数の下のすべての測定を選択し、.txt ファイルでエクスポートするを移動します。
    注: 断面積の単位は、正方形ピクセルです。

9 平衡の段階で作成した画像から記録された胚盤胞の断面積データ ファイルの編集

1. .Txt ファイルから記録された胚盤胞の断面積のデータをスプレッドシート エディターに転送します。
2. 最初断面積の値基準値 1 と表現として (変換) の一部にする他のすべての値を参照値を使用します。
3. 新しい変数 Area_r を作成し、それの下で (参考値) を除くトランス コードの面積の値を貼り付けます。
4. Area_r 変数の横に時間の変数を作成し、最初の時刻値を追加します。
   注: 最初の時刻値は、胚盤胞が公開された瞬間からカメラ付きの顕微鏡の下で録音の発症に平衡化ソリューションに渡される時間を表します。
5. 20 を追加することによって、各次の連続した時間計算前の時間値に s。
   注: これは記録中に作成された不要なビデオ フレームを間引きで使用する時間間隔です。

10. 胚盤胞の温暖化

1. 地球温暖化のメディアを準備します。
   1. 前日、胚盤胞を温暖化には無菌 3 150 μ L 滴 4 よく皿にリカバリ媒体を調剤します。また、無菌調剤回復点滴 9 よく料理微速度顕微鏡観察のために設計、記録中。パラフィン オイルでリカバリ媒体をカバーし、6% の CO₂と 5% O₂の 37 ° C で preincubate。
      メモ: リカバリ媒体は追加したひと血清アルブミン (HSA) 胚盤胞期胚の培地です。リカバリ媒体の HSA は、12 mg/mL をする必要があります。9 よく皿に穴を埋めるためには、空気の泡の作成を避けるために卵母細胞の侵食のピペットを使用し、リカバリ媒体の 30 μ L で液滴領域をオーバーレイします。
   2. 胚盤胞を温暖化の日、無菌融解 4 よく料理の単一の井戸のソリューション (TS) 500 μ L を分注、CO₂インキュベーターで 37 ° C に温めることができます。
   3. 常温では無菌希釈液 (DS) の 1 つの 50 μ L ドロップと滴洗浄ソリューション (WS) の 50 μ L 滅菌シャーレに調剤に。パラフィン オイルと DS、WS1 と WS2 の滴をカバーします。
      注: シャーレの代わりに 4 も皿も使用できます。
2. 胚盤胞を温めます。
   1. LN ストレージから削除され、地球温暖化のプロシージャのための準備で LN 充填ポータブル タンクにわらをすばやく転送するガラス固化体の胚盤胞と HSV わらを識別します。
   2. 鉗子、わらを持ち上げて色処理ロッドを公開するだけで十分。自己調整ワイヤーストリッパーを使用して、色処理棒の高さでストローをカットします。
   3. 取り扱いロッドをつかむし、迅速なまだ制御された動きとストローから抽出直ちに処理ロッドの曲がりヘラを 37 ° C TS に突入します。
   4. 胚盤胞をデタッチし、TS の 1 分の合計のためにそれを残す処理ロッドを軽く旋回します。
   5. 常温で転送胚盤胞連続 DS、WS1 と WS2 各メディアで 4 分間。
   6. 地球温暖化の手順の後リカバリ媒体 4 よく皿に胚盤胞を転送し、軽くピペッティングそれによってすべての 3 滴でそれを洗います。
      注: 洗濯物は約 1 分に行われます。
   7. リカバリ媒体と時間経過 9 よく皿に胚盤胞を転送します。(6% CO₂と 5% O₂の 37 ° C) でインキュベーターでコマ撮りカメラの下で 9 よく皿を配置します。
      注: インキュベーターでコマ撮りカメラの下で 9 よく皿を置くことにつづく Thre 地球温暖化手順は、約 17 分続きます。

11 回復後温暖化中に胚盤胞の再拡大のコマ撮り録画

1. コマ撮り録画ソフトウェアを実行します。
2. 記録カメラを選択します。
3. ライブ モードのボタンを押します。
4. 画像にマウス カーソルを置いて、スクロール ボタンを使用して、それを拡大します。クリックし、マウスの左ボタンを押したままカーソルを画面の真ん中に胚盤胞で井戸を配置します。
5. フォーカシング、下胚盤胞の記録面を集中するのに上下の緑の矢印を使用します。下光の強度、光の強度を設定します。
6. 露光時間とガンマを設定するには、顕微鏡パラメーターをクリックします。
7. ライブ モードの終了キーを押します。
8. プロジェクトのスタートボタンを押すとプロジェクト データを入力、培養ディッシュ タイプ (3 x 3 または 4 x 4) を選択し、記録する 1 つを除くすべてのポジションをオフにします。、
9. 撮影を 5 分ごとにキャプチャ タイミングを設定します。
10. 承認ボタンを押すと録音を開始します。少なくとも 150 分を記録します。
11. プロジェクトを停止ボタンを押して録音を停止します。
    注: 地球温暖化後の回復期間中にそのまま (図 3) と折りたたまれた胚盤胞 (図 4) の録音の代表的な結果を参照してください。

12 後温暖化の再拡張の間に記録された胚盤胞のビデオ編集

1. プロジェクト フォルダーに移動し、約 80 KB のサイズは記録された画像を探します。
2. 別フォルダーを作成し、それにこれらの画像を転送します。作成時間に従って数の画像の名前を変更します。ビデオ編集イメージ シーケンスとしてソフトウェアにインポートします。
3. [ビデオ] タブ→フィルター → へ追加し、 Null 変換フィルターを選択します。
4. 右側の [トリミング] ボタンをクリックし、記録された胚盤胞と表示フィールドだけを残し、画像をトリミングします。[Ok]と[ok]もう一度確認してください。
5. ファイル→エクスポートをクリックして画像。出力形式として JPEG を選択保存した画像のシーケンスを保持するディレクトリを設定し、 [ok]をクリックします。
   注: これは、さらにビデオ解析ソフトウェアで測定のため用意されたサイズ (トリミング) 画像が作成されます。

13 コマ撮り録画ソフトウェアで作成されたイメージのビデオ分析ソフトウェアで計測スケールの設定

1. コマ撮り録画ソフトウェアのアナライザーを実行します。
2. 記録された胚盤胞を持つプロジェクトを開きます。
3. 記録された胚盤胞を持つフィールド [分析] ボタンをクリックします。
   注: 新しい分析ウィンドウが開きます。表示する測定ツール測定ボタンをクリックします。
4. 測定ツールを使用して、全体のイメージの幅を測定します。
5. 画像を右クリックし、それを保存します。プロパティで、画像の幅 (ピクセル単位) を確認します。
6. 幅 (ピクセル単位) でイメージの実際の幅を分割します。
   注: これは、このイメージの単一のピクセルの実際の長さを計算します。
7. ビデオ分析ソフトウェアを実行します。
8. [ウィンドウ] タブをクリックし、タイムラインを選択します。
9. タイムライン ウィンドウ フィルム ストリップの記号をクリックし、ポスト暖かい再拡大胚盤胞の画像シーケンスを追加するメディアを追加を選択します。
10. イメージ→分析→計測スケールを設定をクリックカスタム尺度] ウィンドウを開きます。ピクセル長 1; を入力してください。論理長ピクセル (13.6 のステップ) の以前に計算された実際の長さを入力してください。論理単位入力プリセット保存されました。

14. 胚盤胞の再拡張後暖かい中に作成されたイメージから断面積の測定

1. 計測スケールをセットし画像シーケンスをインポート後は、これらの測定測定断面積 μ m^{2 台を持って唯一の違いでステップ 8 で説明したように同じ方法の胚盤胞の断面積を測定します。}.

15 再拡張後暖かい中に作成された画像から記録された胚盤胞の断面積データ ファイルの編集

1. .Txt ファイルから記録された胚盤胞の断面積のデータをスプレッドシート エディターに転送します。
2. エリア変数の横に時間の変数を作成し、最初の時刻値を追加します。
   注: この例では、最初の時間の値に設定されます 0 分コマ撮り録画の発症であります。各次連続時間値は、5 分を以前の時刻の値に追加することによって計算されます。5 分、2 つの連続したコマ撮り録音間で使用される時間間隔。

16. 線図の作成

1. ガラスや再拡張後温暖化の平衡の段階で時間で胚盤胞の断面積変化の時間プロットを作成する統計解析ソフトウェアでスプレッドシート データ ファイルをインポートします。

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結果

デモでは、1 つだけ previtrification と 1 つの後地球温暖化段階での胚盤胞の形態制御を示した。胚盤胞のボリュームで平衡相の終わりと違い培養培地は、実際には、胚の収縮の強さを示した氷結晶化に対する胚保全の強度の回復の初め。

それは、図 1とビデオ 1から気づくことができるとそ...

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ディスカッション

凍結保存することができます同様の機器と他のメーカーからソフトウェア ツールを使用して実施するも前後の中に胚盤胞の形態制御の観察のためのプロトコル。タイムラプス システム発生学の調整は、胚の開発の継続的な監視を許可します。この作業の目的は、胚盤胞のガラス化と温暖化の後の準備中に胚盤胞の行動の定量化を導入することだった。これは、タイム スケールの形態変化の?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope Eclipse TE2000-U	Nikon, Japan	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Digital camera DC1	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Digital camera DC2	Research Instruments, Origio, Denmark	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Denmark	/	microscope recording software
Incubator with 6% CO2, 5% O2	Binder, Germany	/
Primo Vision microscope	Vitrolife, Sweden	16600
Primo Vision Capture software	Vitrolife, Sweden	16608	time-lapse recording software
Adobe Photoshop CS6 Extended software	Adobe Systems Incorporated, USA	/	video analysis software
VirtualDub	Avery Lee	/	video editing software
Microsoft Office Excell	Microsoft, USA	/	spreadsheet editor
PrimoVision culture dish	Vitrolife, Sweden	16604
G2-plus medium	Vitrolife, Sweden	10132	cultivation medium for blastocyst stage embryos
Human Serum Albumins	Vitrolife, Sweden	10064
Paraffin oil	Vitrolife, Sweden	10029
Equilibration solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90131
Vitrification solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90132
Thawing solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90134
Dilution solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90135
Washing solution medium	Irvine Scientific, Ireland	90136
HSV Vitrification straws	CryoBio System, France	025246, 025249, 025250, 025248
Liquid nitrogen	/
Cryo vessel Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Germany	229286
Cryo tank	Cryotherm, Germany
Forceps	/	/
Scisors	/	/
Pippete for blastocyst manipulation	Gynetics, Belgium	ID275/10	diameter 275 µm
Pipette for oocyte denudation	Vitromed, Germany	V-DEN-135	diameter 135 µm
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Digital interval timer Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA	/	statistical analysis software
Self adjusting wire stripper	Knipex, Germany	1262180