コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

要約

ここでコウジカビ flavusの生育および抗真菌性蛋白を発現するトウモロコシのアフラトキシン生産を分析するためのプロトコルを提案する. 我々 は、感染とリアルタイムで成熟したカーネルでは菌の拡散を監視 gfp 発現するA. flavusひずみを用いたします。アッセイは、急速な信頼性と再現性です。

要約

食品及び飼料作物のアフラトキシン汚染は、世界中の主要な課題です。アフラトキシン、病菌Aspergillus flavus (A. flavus) は、トウモロコシと人間や動物の健康に深刻な脅威のポーズ以外にもピーナッツのような他の石油の豊富な作物作物の値を大幅に削減する強力な発ガン性物質です。従来の育種、遺伝子組換え発現の抵抗性関連蛋白質と RNA 干渉 (RNAi) など、さまざまなアプローチ-重要なA. flavusのホスト-誘導性遺伝子のサイレンシングを用いた遺伝子ターゲットが増加する評価されて影響を受けやすい作物でアフラトキシン抵抗。過去の研究では、α-アミラーゼこの遺伝子・酵素を示唆、 A. flavus病態とアフラトキシン生産の重要な役割は、 A. flavusの生育とアフラトキシン生産の両方を削減する潜在的な目標を示しています。この点で、現在の研究は、 A. flavusに対するトウモロコシのフジマメ属液体l. の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の (構成 CaMV 35Sプロモーターの制御) の下で異種の式を評価する行われました。AILP A. flavus α-アミラーゼ酵素の競合阻害であり共通の豆のレクチン-arcelin-α-アミラーゼ阻害剤タンパク質ファミリーに属する 36 kDa 蛋白質であります。現在の仕事の前に、in vitro 試験は、 A. flavus α-アミラーゼ活性と真菌の増殖の抑制における AILP の役割を発揮していた。真菌の成長および成熟したカーネルでアフラトキシン生産は、gfp 発現するA. flavusひずみを使用してリアルタイムで監視されました。このカーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア) を非常に簡単に設定し、感染症・定量化することができる広がりの程度遺伝と形質転換線の評価のため信頼性が高く、再現性のあるデータを提供します。GFP のひずみから蛍光が密接に相関する真菌の成長、延長によって、それはアフラトキシンの値に相関関係にあります。 現在の仕事の目標は、アフラトキシンの抵抗を増加するためにトウモロコシのような商業的に重要な作物でこの前知識を実装することでした。我々 の結果は、AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシのカーネルではターンでは、アフラトキシンの 62-88% 減少に翻訳するA. flavus成長 35-72% 減少を示します。

概要

真菌属、アルテルナリアペニシリウム、フザリウム麹菌によるマイコトキシン汚染食品の主要な問題は、飼料作物栽培世界中^1,2,3.これらの植物病原性菌の中で麹菌がトリミングの値と人間や動物の健康に及ぼす悪影響最高です。コウジカビ flavus(A. flavus) は、トウモロコシ、綿、ピーナッツなどのオイル豊富な作物に感染する、強力な発ガン性物質アフラトキシン、多数の有毒な二次代謝産物 (SMs) を生成日和見植物病原体です。トウモロコシの重要な食糧は、世界的な栽培作物をフィードし、 A. flavusによる汚染に非常に敏感であります。アフラトキシン汚染の経済的影響を失うとトウモロコシの減少値が地球規模の気候に限り $ 6 億 8660 万/年の米国²予測の変更をすることができます、アフラトキシンの影響とトウモロコシの大きな経済的損失につながる近い将来²に $ 16 億 8000 万/年として、高い見積もり。人間や家畜にアフラトキシンの経済と健康の悪影響を考えると、トウモロコシの収穫前アフラトキシン コントロールは食品のアフラトキシン汚染を防止し、飼料製品を最も効率的な方法かもしれない。

最後の数十年間で広く使用されているトウモロコシのアフラトキシン抵抗の主要な収穫前コントロール アプローチは、⁴時間のかなりの量を必要とする繁殖を中心にです。最近、生物的防除は、大規模なフィールド アプリケーション^5,6アフラトキシン削減いくつかの成功を収めています。生物的防除、ほか 『 ホストによる遺伝子サイレンシング 』 (HIGS) を RNAi など最先端の分子ツールのアプリケーションと耐性関連蛋白の遺伝子組換え発現は、 A. flavusの生育とアフラトキシンの削減にいくつかの成功を収めています。小規模な実験室とフィールド研究の生産。これらのアプローチは、今後の操作のための新しい潜在的なA. flavus遺伝子ターゲットを識別する作業に加えて現在最適化されています。

初期段階の間に成功した病態とマイコトキシンの生産を維持するために重要な役割を再生するマイコトキシン産生遺伝子制御戦略の潜在的なターゲットとしてプロセスに直接かかわる遺伝子以外にも真菌アミラーゼが示されています。ホスト植物の感染。いくつかの例を含めるPythium pleroticum (ショウガ根茎腐敗病菌)、新称(カリフラワー病の病原)、α-アミラーゼと病原性の発現と活性と正の相関関係が^{を認められました。7,8}。遺伝子ノックアウトまたはノックダウン アプローチを通じての α-アミラーゼ活性の阻害は、真菌の成長および毒素生産悪影響を与えます。A. flavusの α-アミラーゼ欠損株では、澱粉基板または degermed トウモロコシ⁹上に成長した場合、アフラトキシンを生成できませんでした。同様に、フザリウム関係でノックアウト、α-アミラーゼのひずみはトウモロコシ¹⁰の感染中のフモニシン B₁ (マイコトキシン) を生成する失敗しました。最近の研究でギルバートら (2018 年) を示した HIGS を行ったところ A α-アミラーゼ式の RNAi によるノックダウンがトウモロコシ カーネル感染^{11 A. flavusの生育とアフラトキシン生産を大幅に削減}.

Α-アミラーゼの発現のダウンレギュレーションをから得られる、同様の結果を作り出したの α-アミラーゼ活性の特異的阻害剤も。カビ抵抗性の α-アミラーゼ阻害剤の役割の最初のレポートは、分離・ A. flavus¹²に抵抗力があるトウモロコシ系統から 14 kDa のトリプシン-α-アミラーゼ阻害剤の同定から来た。さらにヒヤシンス豆、フジマメ属液体l.¹³の種子から Fakhoury と 36 kDa の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の同定につながった Woloshuk によって植物種の数百のスクリーニング。レクチン-arcelin-α - アミラーゼインヒビターの家族に属しているに似ている AILP レクチンのペプチッド シーケンスは共通豆^14,15を報告しました。精製 AILP は、哺乳類のトリプシンとさらに体外評価A. flavusの成長と胞子の発芽¹³, 有意に阻害を示した方はまったく阻害活性を示しません。報告書ここではっきりショー α-アミラーゼとして使用できる病原体または澱粉 (α - アミラーゼ) を動員と中にエネルギー源としての糖の獲得に依存する害虫を制限する制御アプローチでターゲットの宿主植物と病原菌の相互作用。

Α-アミラーゼは、 A. flavus病原性^9,10、11、として強力な抗 -A. flavusエージェント (α-アミラーゼ阻害/antigrowth)¹³AILP の重要性を考えると重要なことに知られています。フジマメ属AILPを表現する遺伝子組換えトウモロコシ植物を生成した構成 CaMV 35S プロモーター遺伝子。目標は、トウモロコシのこの α - アミラーゼインヒビターの異種発現トウモロコシ カーネル感染時にA. flavus病態とアフラトキシン生産に対して有効である場合、調査することでした。大幅 AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシがカーネル感染時にA. flavusの生育とアフラトキシン生産を減らしたことを示した。

プロトコル

1 プラスミドの構造とトウモロコシの変換

1. PCR 増幅フジマメ属AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'と 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' プライマーを使用して挿入します。PCR 条件を含める 30 98 ° C で初期変性ステップ 10 98 ° C で変性続いて s (ステップ 1)、s (手順 2)、30 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 31 のサイクル、と私は、 pst ファイル、最終伸長は 72 ° c で 5 分間Xbaを使用してベクトルの変更された pCAMBIA 1,300 に PCR の製品をクローン ステップ私制限のサイト。最終工場キャスト先のベクトル方向とベクトルでクローン化したAILP遺伝子のシーケンスを確認するシーケンスします。
2. 以前説明した¹⁶としてアグロバクテリウムひずみ EHA101 最終的なベクトル構造 (図 1) を変換します。
3. アグロバクテリウム植物キャスト先のベクトルを含む未熟なトウモロコシ (Zea mays l. こんにちは II) 胚 (アイオワ州立大学植物変換施設で実行されます) を変換するために変換された使用¹⁶。
4. 温室効果 (26-29 ° C; 高圧ナトリウム ランプを添加した 16/8 h 日長) T₀植物を育てるし、形質転換形質 homozygosity を達成するために T₆世代を取得する繰り返し自家受粉します。

2. 胞子発芽アッセイ

1. 葉のサンプルを収穫し、-80 ° C で保存乳鉢と乳棒を使用して液体窒素と葉のサンプルを挽きます。2 mL マイクロ遠心チューブ用で 0.5 g を量り、プロテアーゼ阻害剤、17 μ L を追加し、氷の上チューブを置きます。
2. 16,000 x gで 10 分間のチューブを遠心します。0.5 mL の遠心管に植物エキスの 225 μ L を転送し、氷の上に配置。
3. 15 mL 遠心管でコウジカビ flavus 70-1% ジャガイモ ブドウ糖液 (w/v) GFP の 5 mL 胞子懸濁液を準備します。渦と、haemocytometer と 10 の⁵胞子/mL に胞子濃度を調整します。
   注意: A. flavusはアフラトキシンを生成する、この菌で作業をすべては、生物学的安全キャビネットで 。
4. 文化が胞子発芽胞子の隆起によって示されるように 50% 開始を達成するまで、28 ° C で PDB 内インキュベートします。
5. 渦と 225 μ L 工場に分注 25 μ L 胞子ソリューションを抽出します。断続的な揺れの 28 ° C で 20 時間サンプルをインキュベートします。
6. 胞子液顕微鏡スライドとメジャー生殖の長さ 25 μ L 分注チューブ デジタル カメラ ソフトウェアを使用しての胞子です。各ラインの 20 レプリケート測定値の最小値を使用します。
   注: この段階では、カウントする準備が整うまでコロニー成長を止めることの 4 ° C ですべての文化を配置します。

3. カーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア)

1. 4 スナップ キャップ (22 mm) 60 × 15 mm のペトリ皿を接着してサウジアラビア キャップを構築します。キャップを使用する前に 48 時間乾燥して接着剤を許可します。サウジアラビア cap ごと次々 (図 2) を構成します。
2. 無菌生物学的安全キャビネット、70% エタノール: H₂O (v/v) 正方形のバイオアッセイ トレイ (24 cm × 24 cm) をスプレーし、空気乾燥してみましょう。滅菌の濾紙をトレイに追加します。9 サウジアラビア キャップを 70% エタノール スプレー、空気乾燥とバイオアッセイのトレイに配置してみましょう。
3. 遺伝子組換えトウモロコシ、各ラインのテストされている 20 破損していないカーネルを選択し、50 mL の遠心管に配置します。70% エタノールを加えて 4 分間座ってみましょう。滅菌中のチューブを軽く振る。3 回滅菌脱イオン H₂o. でエタノールとリンスのカーネルを注ぐ
4. コウジカビ flavus 70-6 日間の古い文化から GFP¹⁷ V8 培 (5 %v8 ジュース、2% 寒天、pH が 5.2) の胞子懸濁液を準備します。
   1. 20 mL 滅菌 0.02% トリトン X 100/脱イオン H₂O (v/v) を追加し、滅菌ループを持つ胞子をスクラップします。接種と 300 mL 滅菌ビーカーに場所をピペットで移しなさい。
   2. 0.02 5-fold 希釈を準備 % トリトン X-100、haemocytometer と胞子カウントを行います。4 x 10⁶胞子/mL の濃度で 100 mL を取得する必要に応じて再度希釈します。
5. 攪拌棒滅菌 300 mL ビーカーにカーネルを配置します。接種をビーカーに加えます。
   注意: 接種にカーネルを追加するスプラッシュへの解決策になります。3 分間撹拌プレートにビーカーを置きます。3 分後に、空のビーカーに接種を注ぐ。
6. バイオアッセイ皿 (1 カーネル/キャップ) カーネルを配置、鉗子を使用して、します。30 mL 各生物検定トレイの底には、純水し、7 日間, 暗闇の中で 31 ° C で追加します。
7. 写真撮影のためのカーネルを準備します。
   1. 顕微鏡分析、写真撮影のために、各行から 4 のカーネル置いておきます。
      注: カーネルは、もはや写真を完了する前に 5 日間以上のための 4 ° C で保存できます。
   2. A. flavus (図 3) 接種の 7 日後に、カーネルの写真を撮る。
   3. 軟部組織と脱イオン水でカーネルのきれいな外観です。カーネルの縦断を実行し、すぐに蛍光顕微鏡下で写真を撮る。
8. 分析用のカーネルを準備します。
   1. 軟部組織と脱イオン水で残りのカーネルのきれいな外観です。
   2. 場所 4 カーネルでは、15 mL スクリュー キャップ ポリカーボネートで、1 担当者を構成するバイアル含む 2 ステンレス鋼球です。すぐに液体窒素、-80 ° c 店でバイアルを凍結処理・解析まで。
   3. -80 ° C のフリーザーからバイアルを外し、3 分間、1,500 rpm でホモジナイザーでカーネルを挽きます。
      注意: カーネルを液体窒素で凍結します。

4 遺伝子組換えトウモロコシの PCR のスクリーニング

1. DNA 抽出用キットを使用して、 A. flavus製造元の指示に従って感染粉砕トウモロコシからゲノム DNA (gDNA) を分離します。簡単に言えば、粉砕のトウモロコシの 10-15 mg 280 μ L バッファー F、20 μ L プロテアーゼ 3 μ L ジチオトレイトール (DTT) を追加します。孵化させなさい、(56 ° C、1,200 rpm, 30 分) thermomixer で振る。1 分の 10,000 × g で遠心分離し、明確な上澄みを釣合い列に転送します。3 分および gDNA を溶出する 1分間 700 × gで遠心するため室温で孵化させなさい。
2. 0.8 μ L の PCR キットを使用して各サンプルの 20 μ L の PCR 反応を設定する抽出された gDNA を取る。製造元のプロトコルで推奨されているサイクル条件に従います。PCR 条件を含める 5 98 ° C で変性が続く 5 分 (ステップ 1) 98 ° C で初期変性ステップ s (手順 2)、5 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 40 のサイクル、と 72 ° c 1 分 (ステップ 5) 最終的な延長のステップ。
3. 前方プライマー 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 を使用して、' 逆プライマー 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3、' フジマメ属AILPの存在を確認する遺伝子組換えトウモロコシの遺伝子。

5. RNA の隔離、cDNA 合成と半定量的 RT-PCR

1. 均質化を取るA. flavus感染-80 ° C、RNA の抽出に以前格納されているトウモロコシ。トータル RNA 分離キット製造元のプロトコルによると、わずかな修正¹⁸を使用して RNA を抽出します。抽出バッファーで均質化されたトウモロコシ カーネル粉末 50 mg を追加した後も (ボルテックス) なしで 1 mL ピペット チップを使用してそれをミックスしておきます氷の上進む前に 5-6 分以降の手順を製造元のプロトコルで説明されているよう。
2. 製造元のプロトコル¹⁸によると cDNA 合成キットを使用して cDNA を準備します。
3. 以前説明した¹⁸として半定量 RT-PCR のため 0.5 μ L の PCR 反応あたり原液 cDNA を使用します。前方および逆プライマー qAILP F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3 の使用 ' と qAILP-R は 5'フジマメ属 AILPの遺伝子発現を検出し、前方および逆引きプライマー qRib F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ と qRib-R にそれぞれ 3' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA -トウモロコシ リボソーム構造遺伝子 (リブ) GRMZM2G024838¹⁹の家は維持遺伝子としての表現のためにそれぞれ 3ʹ 5ʹ TCAGTCCAACTTCCAGAATGG

6. GFP 定量

1. 各 0.2 M 塩基性リン酸ナトリウム (NaH₂PO₄) と 0.2 M 塩基リン酸ナトリウム (Na₂HPO₄·7H₂O) 脱イオン H₂o. の 50 mL を準備します。
2. 100 mL pH 7.0 ソレンソン リン酸バッファーを構成します。PH 7.0, 追加 19.5 mL NaH₂PO₄株、30.5 mL₄NaHPO ·7H₂O 株式と 50 mL の脱イオン H₂o.
3. 25 mg 地面カーネル素材 (新鮮な重量、FW) 重量を量り、1.0 mL 遠心チューブに配置します。遠心管と 30 の渦に 500 μ L リン酸バッファーを追加 s。
4. 16,000 x gで 15 分遠心分離機のサンプル。黒 96 well プレートにピペット 100 μ L 清。蛍光光度計 (励起 485 nm、発光 528 nm) とサンプルを読みます。

7. 総アフラトキシン分析法

1. サンプルの処理とアフラトキシンの抽出
   1. 60 ° C で 2 日間の強制空気オーブンで乾燥カーネル サンプルサンプルの重量を量る、50 mL のガラス栓付け三角フラスコに配置します。
   2. 発煙のフード各フラスコに 25 mL の塩化メチレンを追加します。
      注意: 塩化メチレンは非常に揮発性と有害 (刺激、発ガン性物質) であります。ラテックスもニトリル手袋は、塩化メチレンの使用に対して安全です。改良された有機溶媒耐性ポリビニル アルコール手袋を使用します。
   3. 手首のアクション シェーカーで 30 分間試料を振る。30 分後ゆっくりと 80 mL ビーカーにフルーティングを施されたフィルター ペーパー サークルを通じて抽出液を注ぐ。ヒューム フードのビーカー一晩乾燥をしましょう。
   4. 次の日、噴出中を塩化メチレン (約 5 mL) 乾燥ビーカーのリム、周り旋回、2 dram ガラス瓶に注ぐ。発煙のフードで一晩乾燥させる残すバイアルを開きます。
2. アフラトキシン分析法
   1. 4.0 mL 80% メタノールを追加: H₂O (v/v) バイアルに純水します。
   2. フィルターするアフラトキシン抽出キットを使用は、指定された列のメタノール溶液を浄化します。製造元の指示に従って、蛍光光度計の総アフラトキシン レベルを分析します。

結果

トウモロコシの変換と遺伝子組換え植物の分子のスクリーニング

フジマメ属液体 AILP発現 CaMV 35Sの制御の下で最終的な工場先ベクターを含むアグロバクテリウムEHA101 ひずみを用いたトウモロコシのやあ II 系統の未熟胚が変形しました。プロモーター。5 独立して変換されたトウモロ...

ディスカッション

病原体や害虫による農作物の収量の損失は、地球規模の問題²⁰です。現在、合成殺菌剤と殺虫剤のアプリケーションが制御する植物病原菌や害虫のための有力な手段が、これらの発酵食品や飼料中の残留毒性は人間と動物の健康²¹に深刻な脅威を提起できます。食品と飼料作物としてトウモロコシの経済的重要性を考えるの削減やアフラトキシン汚染の除去...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves	Ansell	012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific