Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Zusammenfassung

Aflatoxinkontamination in Nahrungs-und Futtermitteln ist eine große Herausforderung weltweit. Aflatoxine, produziert durch den Pilz Aspergillus Flavus (A. Flavus) sind potente Karzinogene, die Ernte Wert in Mais und andere Öl reiche Ernten wie Erdnuss neben posieren ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit erheblich reduzieren. Unterschiedliche Ansätze, einschließlich der klassischen Züchtung, transgene Ausdruck von Widerstand verbunden sind Proteine und RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Host-induzierte Gen-silencing von kritischen A. Flavus gen Ziele werden ausgewertet, um zu erhöhen Aflatoxin Widerstand in anfälligen Pflanzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Aflatoxin Produktion A. Flavus , schlägt dieses Gen/Enzym α-Amylase ist ein potenzielles Ziel, A. Flavus Wachstum und Aflatoxin-Produktion zu reduzieren. In diesem Zusammenhang wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um heterologen Expression (unter Kontrolle der konstitutiven CaMV 35 s -Promoter) eines Lablab Purpureus L. α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) im Mais gegen A. Flavusbewerten. AILP ist ein 36-kDa-Protein, das ist ein kompetitiver Inhibitor des Enzyms A. Flavus α-Amylase und gehört zur Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor Protein gemeinsam Bohne. In-vitro-Studien vor der aktuellen Arbeit hatte die Rolle des AILP bei der Hemmung von A. Flavus α-Amylase-Aktivität und Pilzwachstum gezeigt. Pilzwachstum und Aflatoxin-Produktion in Reife Kerne wurden mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung in Echtzeit überwacht. Dieser Kernel screening Assay (KSA) ist sehr einfach einzurichten und bietet zuverlässige und reproduzierbare Daten auf Infektion und das Ausmaß der Ausbreitung, die quantifiziert werden konnte zur Beurteilung von Genetik und transgenen Linien. Die Fluoreszenz von den Strapazen der GFP ist eng korreliert, pilzartige Wachstum und durch Verlängerung, es ist gut für Aflatoxin-Werte korrelierten.  Das Ziel der aktuellen Arbeit war, dieses Vorwissen in ein kommerziell wichtigen Getreide wie Mais, Aflatoxin Widerstand erhöhen zu implementieren. Unsere Ergebnisse zeigen eine Ermäßigung von 35 % – 72 % A. Flavus Anstieg AILP exprimierenden transgener Maiskörner, die wiederum in einer 62 bis 88 % Verringerung Aflatoxin übersetzt.

Einleitung

Mykotoxinbelastungen durch die Pilz-Gattungen, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumund Alternaria ist ein großes Problem der Lebensmittel und Futtermittel angebauten weltweit^1,2,3. Unter diesen phytopathogenen Pilzen hat Aspergillus die höchsten negative Auswirkungen auf die Ernte Wert und die Gesundheit von Mensch und Tier. Aspergillus flavus (A. Flavus) ist eine opportunistische Pflanze-Erreger, die infiziert Öl reichen Ernten wie Mais, Baumwollsaat und Erdnuss und produziert die potente Karzinogene, Aflatoxine, sowie zahlreiche giftige sekundäre Pflanzenstoffe (SMs). Mais ist ein wichtiges Nahrungsmittel und Futtermittel weltweit angebaut und ist sehr anfällig für Verunreinigungen durch A. Flavus. Die wirtschaftliche Auswirkungen einer Aflatoxinkontamination auf verliert und Minderwert bei Mais kann so viel wie $ 686,6 Millionen/Jahr in den USA² mit prognostizierten Veränderungen des globalen Klimas, die Auswirkungen von Aflatoxinen kann dazu führen, dass größere wirtschaftliche Verluste in Mais mit Schätzungen so hoch wie $ 1,68 Milliarden/Jahr in die nahe Zukunft². Angesichts der wirtschaftlichen und gesundheitlichen Beeinträchtigungen von Aflatoxinen in Mensch und Tier, möglicherweise vor der Ernte Aflatoxin Kontrolle im Mais der effizienteste Weg zur Verhinderung von Aflatoxinkontamination in Lebensmitteln und Futtermitteln.

Die großen vor der Ernte Kontrollansatz für Aflatoxin Widerstand in Mais, der in den letzten Jahrzehnten eingesetzt hat ist in erster Linie durch Züchtung, die eine erhebliche Menge an Zeit⁴erfordert. Vor kurzem hatte Biocontrol einige Erfolge bei der Reduzierung der Aflatoxin in groß angelegte Feld Anwendungen^5,6. Neben Biocontrol hatte Anwendung modernster molekularer Tools wie z. B. "Host induzierte Gen-Silencing" (HIGS) durch RNAi und transgene Ausdruck des Widerstands-assoziierte Proteine einige Erfolge bei der Reduzierung von A. Flavus Wachstum und aflatoxin Produktion in kleinem Maßstab Labor- und Studien. Diese Ansätze werden derzeit neben der Identifizierung von neuen potenziellen A. Flavus gen Zielen für zukünftige Manipulation optimiert.

Neben Gene, die Mykotoxinproduktion als potentielle Ziele von transgenen Kontrollstrategien direkt beteiligt sind, haben Pilze Amylasen gezeigt worden, um eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pathogenese und Mykotoxin-Erfolgsproduktion in frühen Phasen der Host-Pflanze-Infektion. Ein paar Beispiele Pythium Pleroticum (kausaler Agent Ingwer Rhizom Fäulnis), Fusarium Solani (kausaler Agent der Blumenkohl willst), wo positive Korrelationen zwischen Pathogenität und α-Amylase Expression und Aktivität ^{beobachtet 7,8}. Hemmung der α-Amylase-Aktivität durch gen-Knockout oder Knockdown Ansätze wirkt sich negativ auf Pilz Wachstum und Toxin-Produktion. Ein α-Amylase-Ko-Mutante von A. Flavus konnte Aflatoxine wenn auf Stärke Substrat oder entkeimten Maiskörner⁹gewachsen zu produzieren. In Fusarium Verticillioides , keine α-Amylase Ko-Belastung während der Infektion von Maiskörnern¹⁰Fumonisin B₁ (Mykotoxine) produzieren. In einer neueren Studie Gilbert Et Al. (2018) gezeigt, dass ein RNAi-basierten Knock down- A. Flavus α-Amylase Ausdrucksformen durch HIGS A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion^{11 deutlich reduziert} .

Spezifische Inhibitoren der α-Amylase-Aktivität haben auch ähnliche Ergebnisse produziert, wie Down-Regulierung der α-Amylase Ausdruck entnommen. Der erste Bericht über die Rolle der ein α-Amylase-Inhibitor in Pilzresistenz kamen aus der Isolierung und Charakterisierung von einer 14-kDa-Trypsin-α-Amylase-Inhibitor von Maislinien resistent gegen A. Flavus¹². Weitere screening von mehreren hundert Pflanzenarten Fakhoury und Woloshuk führten zur Identifizierung eines 36-kDa α-Amylase-Inhibitor-ähnlichen Proteins (AILP) aus den Samen der Hyazinthe Bohnen, Lablab Purpureus L.¹³. Der Peptidsequenz AILP glich Lektine aus der Familie der Lektine – Arcelin – α-Amylase-Inhibitor berichtet gemeinsam Bohne^14,15. Gereinigten AILP wird keine hemmende Aktivität gegenüber Säugetieren Trypsin und weitere in-vitro Charakterisierung zeigte deutliche Hemmung der A. Flavus Wachstum und conidial Keimung¹³aufweisen. Die Berichte hier eindeutig zeigt α-Amylase kann dienen als Target in der Steuerung Ansätze beschränken, Krankheitserreger oder Schädlinge, die abhängig von Stärke Mobilisierung (durch α-Amylase-Aktivität) und Erwerb der lösliche Zucker als Energiequelle während ihrer Pathogene Interaktion mit Wirtspflanzen.

Alpha-Amylase ist bekannt, dass kritische A. Flavus Pathogenität^9,10,11, und angesichts der Bedeutung der AILP als ein potenter Anti-A. Flavus Agent (α-Amylase Hemmung/Antigrowth)¹³, Wir generierten transgene Maispflanzen mit dem Ausdruck Lablab AILP gen unter der konstitutiven CaMV-35 s-Promoter. Ziel war es zu untersuchen, ob heterologen Expression von dieser α-Amylase-Inhibitor in Mais gegen A. Flavus Pathogenese und Aflatoxin Produktion während Maiskorn Infektion wirksam ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass transgene Maiskörner mit dem Ausdruck AILP deutlich A. Flavus Wachstum und Aflatoxin Produktion während der Kernel-Infektion reduziert.

Protokoll

(1) Plasmid Konstrukte und Mais transformation

1. PCR verstärkt Lablab AILP mithilfe der Primer 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'und 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3"einfügen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 30 s (Schritt 1), gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 10 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 30 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 31 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 5 min. Klon das PCR-Produkt in einer modifizierten pCAMBIA 1.300 Vektor mit Xbaich und Pstich Restriktionsschnittstellen. Reihenfolge der letzten Pflanze Ziel Vektor, die Ausrichtung und die Sequenz des Gens geklonte AILP im Vektor zu bestätigen.
2. Agrobakterium Stamm EHA101 mit dem letzten Vektor-Konstrukt (Abbildung 1) als früher beschriebenen ¹⁶zu verwandeln.
3. Nutzung umgewandelt Agrobacterium , enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor, unreifen Mais (Zea Mays L. Hi-II) Embryonen (die Pflanze Transformation Anlage der Iowa State University durchgeführt) zu verwandeln ¹⁶.
4. T₀ Pflanzen im Gewächshaus (26-29 ° C; 16/8 h Photoperiode ergänzt mit Hochdruck Na-Lampen) und wiederholt werden um T-₆ -Generation um Homozygotie für transgene Merkmal zu erreichen zu erhalten.

2. Spore Keimung assay

1. Blattproben zu ernten und Lagern bei-80 ° C. Blattproben mit einem Mörser und Stößel mit flüssigem Stickstoff zu mahlen. In 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 g wiegen Sie ab, fügen Sie 17 µL Protease-Inhibitor hinzu und legen Sie Rohre auf Eis.
2. Zentrifugieren Sie Rohre für 10 min bei 16.000 X g. 225 µL Pflanzenextrakt zu 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis.
3. Bereiten Sie in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen eine 5 mL-Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP in 1 %-Kartoffel-Dextrose-Bouillon (w/V). Wirbel und Spore Konzentration 10⁵ Sporen/ml mit einem Zählkammern anpassen.
   Achtung: A. Flavus produziert Aflatoxine, alle Arbeiten mit dieser Pilz in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.
4. Brüten Sie in PDB bei 28 ° C bis Kultur 50 % Initiation der Spore Keimung erreicht durch Vorwölbung der Sporen.
5. Wirbel und aliquoten 25 µL Spore-Lösung für die 225 µL Pflanze zu extrahieren. 20 Stunden bei 28 ° C mit intermittierenden schütteln inkubieren Sie Proben.
6. Aliquoten 25 µL Spore-Lösung auf einem Objektträger und Messen Sie die Länge der Keim Röhren Sporen mit der Digitalkamera-Software. Verwenden Sie ein Minimum von 20 wiederholte Messungen für jede Zeile.
   Hinweis: In dieser Phase legen Sie alle Kulturen bei 4 ° C Kolonie Wachstumsstop bis bereit zu zählen.

3. Kernel Screening Assay (KSA)

1. KSA-Kappen durch Kleben 4 Snap Caps (22 mm) in einer Petrischale 60 x 15 mm zu konstruieren. Lassen Sie Kleber für 48 Stunden trocknen, bevor Sie Kappen verwenden. Jede KSA-Kappe bildet ein Rep (Abbildung 2).
2. Sprühen Sie in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank eine quadratischen Bioassay-Fach (24 x 24 cm) mit 70 % Ethanol: H₂O (V/V) und lassen Sie an der Luft trocknen. Das Fach sterile Chromatographiepapier hinzufügen. Sprühen Sie 9 KSA-Kappen mit 70 % Ethanol, lassen Sie Luft trocknen, und legen Sie in die Bioassay-Fach.
3. Für jeden getesteten transgenen Maislinie 20 unbeschädigt Kerne auswählen und platzieren in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 70 % Ethanol und 4 Minuten ruhen lassen. Schütteln Sie Röhren während der Sterilisation. Gießen Sie das Ethanol und spülen Kerne dreimal in sterilen entionisiertem H₂O.
4. Bereiten Sie eine Spore-Aussetzung der Aspergillus Flavus 70 – GFP¹⁷ aus einer 6 Tage alten Kultur auf V8-Medium (5 % V8 Saft, 2 % Agar, pH 5,2) angebaut.
   1. Fügen Sie 20 mL steriles 0,02 % Triton X-100/entionisiertem H₂O (V/V) und Schrott aus Sporen mit einer sterilen Schleife. Aus dem Inokulum und in eine sterile 300 mL-Becherglas pipettieren.
   2. Vorbereiten eine 5-fold Verdünnung mit 0,02 % Triton x-100, führen Sie dann eine Spore-Zählung mit einem Zählkammern. Verdünnen Sie wieder, wenn notwendig, 100 mL mit einer Konzentration von 4 x 10⁶ Sporen/mL zu erhalten.
5. Kerne in einer sterilen 300 mL-Becherglas mit Stir Bar zu platzieren. Das Becherglas Inokulum hinzufügen.
   Achtung: Inokulum Kerne hinzufügen bewirkt Lösung zu spritzen. Becherglas auf einer Platte unter Rühren 3 Minuten lang. Nach 3 Minuten Inokulum in eine leere Becherglas abgießen.
6. Mit einer Pinzette, legen Sie Kerne in die Bioassay-Teller (1 Kernel/GAP). Fügen Sie 30 mL entionisiertem Wasser am unteren Rand jeder Bioassay-Tablett und 7 Tage bei 31 ° C im Dunkeln inkubieren.
7. Bereiten Sie Kerne für die Fotografie.
   1. 4 Kerne aus jeder Zeile für mikroskopische Analyse und Fotografie beiseite.
      Hinweis: Kerne können bei 4 ° C nicht länger als 5 Tage vor dem Abschluss Fotografie gespeichert werden.
   2. Fotografieren Sie Kerne nach sieben Tagen nach der Impfung mit A. Flavus (Abbildung 3).
   3. Saubere äußere der Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser. Führen Sie Längsprofile der Kerne und sofort Fotografieren unter dem Fluoreszenz-Mikroskop.
8. Kerne für die Analyse vorbereiten.
   1. Saubere Fassade der verbleibenden Kerne mit einem weichen Tuch und deionisiertes Wasser.
   2. Platz 4 Kerne, bilden 1 Rep, in einem 15 mL Schraubverschluss Polycarbonat Fläschchen mit 2 Kugeln aus rostfreiem Stahl. Sofort frieren Sie Fläschchen in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung und Analyse ein.
   3. -80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Fläschchen und Mahlen Sie der Kerne in einem Homogenisator bei 1.500 u/min für 3 Minuten.
      Hinweis: Bewahren Sie Kerne mit flüssigem Stickstoff eingefroren.

(4) PCR-Screening von transgener Maiskörner

1. Verwenden Sie DNA-Isolierung-Kit genomischen DNA (gDNA) isolieren aus pulverisierte Maiskörner infiziert mit A. Flavus gemäß den Anweisungen des Herstellers. 10-15 mg pulverisierte Maiskörner kurz, 280 µL Puffer F, 20 µL Protease und 3 µL Dithiothreitol (DTT) hinzufügen. Brüten und schütteln in einem Thermomixer (56 ° C, 1.200 u/min, 30 min). 10.000 x g für 1 min Zentrifugieren und den klare Überstand auf äquilibriert Spalte übertragen. Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min und Zentrifuge bei 700 X g für 1 min zum gDNA eluieren.
2. 0,8 µL der extrahierten gDNA zum Einrichten einer 20 µL-PCR-Reaktion für jede Probe mit einem PCR-Kit zu nehmen. Folgen Sie Thermocyclings Bedingungen, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Die PCR-Bedingungen umfassen einen anfängliche Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 5 min (Schritt 1) gefolgt von Denaturierung bei 98 ° C für 5 s (Schritt 2), Glühen bei 55 ° C für 5 s (Schritt 3), Dehnung bei 72 ° C für 20 s (Schritt 4), 40 Zyklen von Schritt 2 zu Schritt 4 , und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 1 min (Schritt 5).
3. Verwenden Sie vorwärts Primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' und reverse-Primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3 "bestätigen das Vorhandensein von Lablab AILP gen in transgener Maiskörner.

(5) RNA-Isolierung, cDNA Synthese und semi-quantitativen RT-PCR

1. Nehmen Sie homogenisiert A. Flavus infiziert Maiskörner zuvor gespeichert bei-80 ° C für die RNA-Extraktion. Mit einem total RNA Isolierungskit laut Protokoll des Herstellers aber mit geringfügigen Änderung¹⁸RNA extrahieren. Mischen Sie nach Zugabe von 50 mg Pulver homogenisiert Maiskorn in dem Extraktionspuffer es gut (ohne Heizungsjobstep) mit einer 1 mL Pipettieren Spitze und lassen Sie es auf Eis für 5-6 Minuten, bevor Sie fortfahren Folgeschritte wie im Protokoll des Herstellers beschrieben.
2. Bereiten Sie mithilfe eines cDNA Synthese Kits nach des Herstellers Protokoll ¹⁸cDNA.
3. Verwenden Sie 0,5 µL unverdünnte cDNA pro PCR-Reaktion für semi-quantitativen RT-PCR als früher beschriebenen¹⁸. Verwenden Sie vorwärts und rückwärts Primer qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' und qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' bzw. zu erkennen Lablab AILP Genexpression und forward und reverse Primer qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ und qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ bzw. für den Ausdruck von Mais ribosomale Strukturgen (Rib), GRMZM2G024838¹⁹ als Zimmermädchen gen.

(6) GLP Quantifizierung

1. Bereiten Sie 50 mL 0,2 M monobasic Natriumphosphat (NaH₂PO₄) und 0,2 M Diabas-Natriumphosphat (Na₂HPO₄·7H₂O) in entionisiertem H₂O.
2. 100 mL Phosphatpuffer pH 7,0 Sorenson bilden. Für pH 7,0 hinzufügen von 19,5 mL NaH₂PO₄ Lager, 30,5 mL NaHPO₄·7H₂O Lager und 50 mL entionisiertem H₂O.
3. 25 mg Kernel Mahlgut (Frischgewicht, FW) wiegen Sie ab und in einen 1,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinzu kommen die Zentrifugenröhrchen und Wirbel für 30 500 µL Phosphatpuffer s.
4. Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten bei 16.000 X g. Pipettieren 100 µL Überstand in ein schwarz 96-well-Platte. Lesen Sie die Proben mit einem Fluorometer (Erregung 485 nm, Emission 528 nm).

7. total Aflatoxin-Analyse

1. Verarbeitung und Aflatoxin Probengewinnung
   1. Trocken-Kernel Proben in einem Umluft-Ofen für 2 Tage bei 60 ° C. Wiegen Sie Proben und legen Sie in ein 50-mL-Erlenmeyerkolben mit einem Glasstopfen.
   2. Verleihen Sie in einer Dampfhaube 25 mL Methylenchlorid jedem Kolben.
      Achtung: Methylenchlorid ist sehr volatil und gilt als gefährlicher (reizend, karzinogen). Latex weder Nitril-Handschuhe sind sicher für die Arbeit mit Methylenchlorid. Verwenden Sie verbesserte organische Lösungsmittel beständig PolyVinylAlcohol Handschuhe.
   3. Schütteln Sie Proben für 30 min auf ein Handgelenk Aktion Shaker. Gießen Sie nach 30 min langsam den Extrakt durch eine geriffelte Filterpapier Kreis in einer 80-mL-Becherglas. Lassen Sie die Becher über Nacht trocknen unter einem Abzug.
   4. Am nächsten Tag Spritzen Methylenchlorid (ca. 5 mL) um die innere Felge von der trockenen Becher, wirbeln herum und gießen Sie in 2 Dram Glasfläschchen. Lassen Sie Fläschchen öffnen, um in einer Abzugshaube über Nacht trocknen.
2. Aflatoxin-Analyse
   1. 4,0 mL 80 % Methanol hinzufügen: entionisiertem H₂O (V/V), Fläschchen.
   2. Verwendung eines Aflatoxin Extraktion Kit Filtern reinigen Methanol-Lösung mit der angegebenen Spalte. Analysieren Sie total Aflatoxin Ebenen mit einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Mais-Transformation und molekulare Screening von transgenen Pflanzen

Unreife Embryonen Hi-II-Maislinien verwandelten sich mit Agrobacterium Tumefaciens EHA101 Stamm, enthält die letzte Pflanze Ziel Vektor mit dem Ausdruck der Lablab Purpureus AILP gen unter der Kontrolle des CaMV- 35 s Promotor. Fünf unabhängig transformierte Maislinien wurden an die T6-Generation für nach...

Diskussion

Ertragsverluste bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen durch Erreger und Schädlinge ist ein globales Problem-²⁰. Derzeit, Anwendung von synthetischen Fungiziden und Pestiziden ist das vorherrschende Mittel für steuernde Anlage Krankheitserreger und Schädlinge, aber passives Toxizität von diesen Biochemikalien in Lebens- und Futtermitteln kann ernsthafte Bedrohung für die menschliche und tierische Gesundheit²¹darstellen. Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Mais...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System	Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge	Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL	Ace Glass	6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
Force Air Oven	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves	Ansell	012-15-554
Innova 44 Incubator Shaker	Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants	Nexttec	47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera	Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera	Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes	ThermoFisher Scientific	240835
Phire Plant Direct PCR Kit	ThermoFisher Scientific	F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm	DKW Life Sciences	242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic	Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit	Sigma-Aldrich	STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer	Biotek
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 juice	Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3	Fisher Scientific	09-820P
Wrist-Action Shaker	Burrell Scientific