JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Özet

Aflatoksin kontaminasyonu gıda ve yem bitkileri dünya çapında büyük bir sorun olduğunu. Mısır ve diğer petrol zengin bitkileri yanı sıra insan ve hayvan sağlığı için ciddi tehdit poz fıstık gibi kırpma değeri önemli ölçüde azaltmak güçlü kanserojen aflatoksin, mantar Aspergillus flavus (A. flavus) tarafından üretilen vardır. Geleneksel ıslah, direnç ilişkili protein ve RNA müdahale (RNAi) transgenik ifadesi de dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar-ana bilgisayar kaynaklı gene kritik A. flavus susturmak dayalı gen hedefleri, değerlendirilir artırmak için aflatoksin direnç duyarlı bitkileri. Son çalışmalar α-amilaz A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim, bu gen/enzim düşündüren önemli bir rol A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim azaltmak için potansiyel bir hedeftir göstermiştir. Bu bağlamda çalışmada Mısır A. flavuskarşı bir Lablab purpureus L. α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) kapaklı ifade (altında bünye CaMV 35S organizatörü kontrolünü) değerlendirmek için yapılmıştır. AILP hangi A. flavus α-amilaz enziminin bir rekabetçi inhibitörü ve lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü protein ailesine ortak fasulye ait bir 36-kDa proteindir. İn vitro çalışmalar mevcut iş önce AILP rolünde inhibisyon A. flavus α-amilaz aktivitesi ve mantar büyüme gösterdi. Mantar büyüme ve olgun çekirdekleri aflatoksin üretim A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak gerçek zamanlı olarak takip. Bu çekirdek tahlil (KSA) eleme kurmak basit ve güvenilir ve tekrarlanabilir veri enfeksiyon ve sayısal yaymak ölçüde Pangenez ve transgenik hatları değerlendirme için sağlar. Floresans GFP zorlanma mantar için yakından ilişkili büyüme ve uzatma tarafından aflatoksin değerleri için iyi ilişkili.  Bu ön bilgi aflatoksin direncini artırmak için Mısır gibi ticari açıdan önemli bir ürün uygulamak için mevcut iş amacı oldu. Bizim sonuçları hangi, sırayla, aflatoksin düzeyleri %62-%88 azalma tercüme AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme % 35-%72 azalma gösterir.

Giriş

Mikotoksin kirlenme mantar Azomonas, Aspergillus Fusarium, Penicilliumve Alternaria tarafından gıda büyük bir sorundur ve yem bitkileri yetiştirilen dünya çapında1,2,3. Bu pitopatojenik mantarlar arasında Aspergillus kırpma değeri ve insan ve hayvan sağlığı en fazla olumsuz etkiye sahiptir. Aspergillus flavus (A. flavus) Mısır, pamuk ve fıstık gibi petrol zengin bitkileri bozar ve güçlü kanserojen, aflatoksin yanı sıra çok sayıda toksik ikincil metabolit (SMs) üreten bir fırsatçı bitki patojeni var. Mısır önemli bir besindir ve dünya çapında yetiştirilen bitki besleme ve kirlenme A. flavustarafından son derece duyarlı olduğunu. Aflatoksin kirlenme üzerinde ekonomik etkisini kaybeder ve Mısır düşük değeri olarak 686.6 milyon dolar/yıl ABD2 öngörülen değişiklikler ile küresel iklim olabilir, aflatoksin etkisi Mısır ile daha büyük ekonomik kayıplara neden olabilir tahmini olarak 1.68 Milyar dolar/çevre gelecek2yılda yüksek. İnsan ve hayvan aflatoksin olumsuz ekonomik ve sağlık etkileri göz önüne alındığında, Mısır denetiminde öncesi hasat aflatoksin gıda aflatoksin kirlenmesini önlemek ve yem ürünleri için en etkili yolu olabilir.

Saat4önemli miktarda gerektiren öncelikle üreme yoluyla, yoğun son birkaç on yıl içinde kullanılan Mısır aflatoksin direniş için büyük öncesi hasat denetim yaklaşımdır. Son zamanlarda, biyolojik büyük ölçekli alan uygulamaları5,6' aflatoksin azaltma içinde bazı başarı elde etti. Biyolojik yanı sıra, uygulama 'Ana bilgisayar indüklenen Gene susturmak' RNAi aracılığıyla (HIGS) gibi son teknoloji moleküler araçlarından ve direnç ilişkili proteinlerin transgenik ifade A. flavus büyüme ve aflatoksin azaltılması bazı başarı olmuştur üretim ise küçük ölçekli laboratuvar ve alan çalışmaları. Bu yaklaşımların Şu anda gelecekteki manipülasyon için yeni potansiyel A. flavus gen hedefler belirlenmesi ek olarak optimize edilmiş.

Doğrudan transgenik kontrol stratejilerinin potansiyel hedefleri olarak mikotoksin üretimi söz konusu genlerin yanı sıra mantar amylases erken aşamalarında başarılı patogenez ve mikotoksin üretimi korumak kritik bir rol oynamaktadır gösterilmiştir Ana bilgisayar bitki enfeksiyonu. Pythium pleroticum (zencefil köksap rot nedensel Ajan), birkaç örnekler nerede patojenitesi ve α-amilaz ifade ve aktivite arasında pozitif korelasyon gözlendi Fusarium solani (karnabahar solgunluk nedensel Ajan), 7,8. α-amilaz etkinliği gen nakavt veya devirme yaklaşımlar ile inhibisyonu mantar büyüme ve toksin üretimi olumsuz yönde etkiler. Bir α-amilaz nakavt mutant A. flavus ve nişasta substrat veya degermed mısır çekirdekleri9tarihinde yetiştirilen aflatoksin üretmek bulamadı. Benzer şekilde, Fusarium verticillioides içinde bir α-amilaz nakavt zorlanma fumonisin B1 (mikotoksin) Mısır çekirdekleri10enfeksiyon sırasında üretmek başarısız oldu. Daha yeni bir çalışmada, Gilbert ve ark. (2018) bir RNAi tabanlı yıkmak A. flavus α-amilaz ifade HIGS aracılığıyla A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim sırasında Mısır çekirdek enfeksiyon11 azaltılacağını gösterdi .

α-amilaz faaliyet belirli inhibitörleri de aşağı-Yönetmeliğin α-amilaz ifade elde gibi benzer sonuçlar doğurmuştur. 14-kDa tripsin-α-amilaz inhibitörü Mısır satırlarından A. flavus12' ye dayanıklı malzemelerin yalıtım ve mantar direnç bir α-amilaz inhibitörü olan rolüne ilk rapor geldi. Daha fazla Fakhoury ve Woloshuk bir 36-kDa α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) tanımlaması liderliğindeki tarafından bitki türlerinin birkaç yüz sümbül fasulye, Lablab purpureus L.13taneleri tarama. Lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü ailesine ait AILP andıran lektinlerinin peptit dizisi ortak fasulye14,15bildirdi. Saf AILP memeli tripsin ve daha fazla tüp bebek karakterizasyonu A. flavus büyüme ve conidial çimlenme13önemli inhibisyonu gösterdi doğru inhibitör herhangi bir faaliyet göstermez. Sunulan raporları burada açıkça gösterir α-amilaz hedef patojenler veya nişasta seferberlik (α-amilaz faaliyetleri ile) bağlı çözünür şekerler edinimi sırasında bir enerji kaynağı olarak zararlıları sınırlamak için denetim yaklaşımlar olarak hizmet edebilir onların Ana tesisleri ile patojenik etkileşim.

Alfa-amilaz A. flavus patojenitesi9,10,11ve olarak güçlü bir anti-A. flavus Ajan (α-amilaz inhibisyon/antigrowth)13AILP önemini göz önüne alındığında kritik olduğu bilinmektedir, transgenik mısır bitkileri Lablab AILP ifade oluşturulan gen bünye CaMV 35S organizatörü altında. Mısır bu α-amilaz inhibitörü Contegra ifade A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim Mısır çekirdek enfeksiyon sırasında karşı etkili olup olmadığını araştırmak için hedefi oldu. Bizim sonuçlar önemli ölçüde AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim çekirdek enfeksiyon sırasında azaltılmış gösterilmektedir.

Protokol

1. plazmid yapıları ve Mısır dönüştürme

  1. PCR yükseltmek Lablab AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 've 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' primerler kullanılarak ekleme. PCR koşullar bir ilk denatürasyon adım 30 98 ° C'de yer denatürasyon 10 98 ° C'de tarafından takip s (adım 1), s (adım 2), 30 55 ° C'de tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 31 döngüleri , ve son bir uzama adım 5 dk. değiştirilmiş pCAMBIA 1300 PCR üründe vektör Xbakullanarak klon için 72 ° C'de ben ve Pstben kısıtlama siteleri. Sıra son bitki hedef vektör yönünü ve vektör klonlanmış AILP gen dizisini onaylamak için.
  2. Agrobacterium gerilme EHA101 son vektör yapı (Şekil 1) ile daha önce açıklanan 16olarak dönüştürmek.
  3. Olgunlaşmamış Mısır (Zea mays L. Hi-II) embriyo (bitki dönüşüm tesisi, Iowa Eyalet Üniversitesi'nde gerçekleştirilen) dönüştürmek için son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium dönüştürülmüş kullanın 16.
  4. (26-29 ° C; 16/8 h photoperiod yüksek basınç Na-lambalar ile desteklenmiş) sera içinde T0 bitkiler büyümek ve art arda T6 nesil transgenik özelliği için homozygosity elde etmek için elde etmek için self-pollinate.

2. spore çimlenme tahlil

  1. Yaprak örnekleri hasat ve-80 ° C'de depolayın Yaprak örnekleri bir harç ve sıvı nitrojen kullanarak havaneli ile eziyet. 2 mL microcentrifuge tüpler 0.5 g tartmak, proteaz inhibitörü 17 µL eklemek ve tüpler buza koyun.
  2. Tüpler, 16.000 x g10 dk santrifüj kapasitesi. 0.5 mL microcentrifuge tüpler için Bitki ekstresinin 225 µL aktarmak ve buza koyun.
  3. 15 mL santrifüj tüpü Aspergillus flavus 70 – GFP % 1 patates dekstroz suyu (w/v) içinde bir 5 mL spor süspansiyon hazırlamak. Girdap ve spor konsantrasyonu 105 Sporlar/ml bir haemocytometer ile ayarlayın.
    Dikkat: A. flavus aflatoksin üretir, bu mantar ile tüm iş biyolojik emanet dolabı yapılmalıdır.
  4. Kültür Sporlar şişkin tarafından belirtildiği gibi spor çimlenmesi inisiyasyon % 50 elde kadar PDB'de 28 ° C'de kuluçkaya.
  5. Girdap ve aliquot 25 µL spore çözüm 225 µL bitki özü. Örnekleri 28 ° C'de aralıklı sallayarak ile 20 saat kuluçkaya.
  6. Spore çözüm ölçü uzunluğu, mikrop ve mikroskop slayt üzerinde aliquot 25 µL Sporlar dijital kamera yazılımı kullanarak tüpleri. En az 20 Çoğalt ölçümler her satırı için kullanın.
    Not: Bu aşamada 4 ° C'de saymak için hazır kadar koloni büyümesini durdurmak için tüm kültürler yerleştirin.

3. çekirdek tahlil (KSA) Eleme

  1. KSA kapaklar 4 ek kapaklar (22 mm) 60 x 15 mm petri kabına yapıştırma tarafından inşa. Tutkal için 48 H kapaklar kullanmadan önce kurumasını sağlar. Her KSA kap bir rep (Şekil 2) kabul ettiğiniz anlamına gelir.
  2. Bir steril biyolojik güvenlik kabin, bir kare bioassay tepsi (24 cm x 24 cm) % 70 etanol: H2ile O (v/v) sprey ve kuru hava girsin. Steril Kromatografi kağıt tepsisi. % 70 etanol ile 9 KSA caps sprey, bioassay tepsisine yerleştirin ve kuru hava girsin.
  3. Test edilen her transgenik Mısır satırı için 20 hasarsız çekirdekleri seçin ve bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin. % 70 etanol ekleyin ve 4 dakika oturup bekleyin. Yavaşça tüpler sterilizasyon sırasında sallamak. Kapalı üç kez olarak steril deiyonize H2O. etanol ve durulama çekirdekleri dökün
  4. V8 Orta (%5 V8 suyu, %2 agar, pH 5.2) yetiştirilen Aspergillus flavus 70 – GFP17 6 gün eski bir kültürden bir spor süspansiyon hazırlamak.
    1. 20 mL steril %0.02 Triton X-100/deiyonize H2O (v/v) eklemek ve bir kısır döngü ile Sporlar kapalı hurda. Damlalıklı yeri bir 300 mL steril ölçek ve inoculum kapalı.
    2. 0,02 ile 5-fold bir seyreltme hazırlamak % Triton X-100, sonra bir haemocytometer olan bir spor sayısı gerçekleştirin. Tekrar 4 x 106 Sporlar/mL bir konsantrasyon ile 100 mL elde etmek gerekirse oranında seyreltin.
  5. Çekirdekleri steril 300 mL kabı bir heyecan çizgiyle yerleştirin. İnoculum kabı için ekleyin.
    Dikkat: çekirdekler için inoculum eklemek çözüm sıçrama için neden olacaktır. Kabı 3 dakika boyunca bir heyecan tabağa yerleştirin. 3 dakika sonra inoculum bir boş kabı dökün.
  6. Bir forseps kullanarak, çekirdekleri bioassay tabak (1 çekirdek/kapak) yerleştirin. 30 mL deiyonize su her bioassay tepsi altına ve 7 gün boyunca karanlıkta 31 ° C'de kuluçkaya ekleyin.
  7. Çekirdekleri Fotoğrafçılık için hazırlayın.
    1. 4 çekirdekleri mikroskopik analiz ve Fotoğrafçılık her satırdan kenara.
      Not: Çekirdekler için artık fotoğraf tamamlamadan önce 5 gün daha 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    2. Aşı A. flavus (Şekil 3) ile yedi gün sonra çekirdekleri fotoğraf çekmek.
    3. Çekirdekleri bir yumuşak doku ve deiyonize su ile temiz dış. Boyuna çekirdekleri bölümlerini gerçekleştirmek ve hemen floresan mikroskop altında fotoğraf çekmek.
  8. Çekirdekleri analiz için hazırlayın.
    1. Bir yumuşak doku ve deiyonize su ile kalan çekirdeklerin temiz dış.
    2. Yer 4 badem, 1 rep, 15 mL vidalı kapak Polikarbonat oluşturan içeren 2 Paslanmaz topları şişe. Hemen şişeleri sıvı azot ve mağaza-80 ° C'de daha fazla işleme ve analiz kadar dondurmak.
    3. Şişeleri-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve çekirdekleri bir homogenizer 1500 rpm içinde 3 dakika boyunca eziyet.
      Not: sıvı azot ile dondurulmuş çekirdekleri tutun.

4. PCR tarama transgenik mısır çekirdekleri

  1. DNA izolasyon kit genomik DNA (gDNA) izole etmek için üreticinin yönergelerine göre A. flavus ile enfekte toz mısır çekirdekleri kullanın. Kısaca, 280 µL arabellek F, 20 µL proteaz ve 3 µL dithiothreitol (DTT) toz mısır çekirdekleri için 10-15 mg ekleyin. Kuluçkaya ve bir thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 dk) sallamak. 10.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve açık süpernatant dengelenmiş sütuna aktarmak. 3 dk. ve santrifüj 700 x g gDNA elute için 1 dakika için de oda sıcaklığında kuluçkaya.
  2. 0.8 µL PCR kiti kullanarak her örnek için bir 20 µL PCR reaksiyon ayarlamak için çıkarılan gDNA al. Thermocycling koşulları olarak üreticinin iletişim kuralında tavsiye izleyin. PCR koşullar denatürasyon 5 için 98 ° C'de ardından bir ilk denatürasyon adım 5 min (adım 1) için 98 ° C'de yer s (adım 2), 55 ° c 5 tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 40 döngüleri ve bir son uzama adım 72 ° c için 1 dk (5. adım).
  3. İleri astar 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3'ü kullanın ' ve ters astar 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' Lablab AILP varlığını doğrulamak için gen transgenik mısır çekirdekleri içinde.

5. RNA izolasyon, cDNA sentezi ve yarı kantitatif RT-PCR

  1. Homojenize almak A. flavus mısır çekirdekleri daha önce RNA çıkarılması için-80 ° C'de depolanan enfekte. Bir toplam RNA izolasyon kit üreticinin protokolüne göre ama hafif değişiklik18ile kullanarak RNA ayıklayın. Homojenize mısır çekirdeği tozu 50 mg ayıklama arabellekte ekledikten sonra onsuz de (vortexing) 1 mL damlalıklı ucu kullanarak karıştırın ve buz üzerinde 5-6 dakika devam etmeden önce sonraki adımlar için üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi bırakın.
  2. CDNA üreticinin iletişim kuralı 18göre cDNA sentez seti kullanarak hazırlayın.
  3. 0.5 µL PCR reaksiyon başına su katılmamış cDNA yarı kantitatif RT-PCR için daha önce açıklanan18kullanın. İleriye ve geriye doğru astar qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3'ü kullanın ' ve qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA sırasıyla Lablab AILP gen ekspresyonu, algılamak ve ileri ve ters astar qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ ve qRib-R - 3' 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ sırasıyla Mısır ribozomal yapısal gen (göğüs), GRMZM2G02483819 ev tutma gen olarak ifade.

6. GFP Nefelometri

  1. 50 mL her 0.2 M Yem mono sodyum fosfat (NaH2PO4) ve 0.2 M dibasic sodyum fosfat (Na2HPO4·7H2O) deiyonize H2O. hazırlamak
  2. PH 7,0 Sorenson fosfat tampon 100 mL kadar olun. 19.5 mL NaH2PO4 hisse senedi, 30.5 mL NaHPO4·7H2O hisse senedi ve 50 mL deiyonize H2O. pH 7,0 için ekleyin
  3. 25 mg yere çekirdek malzeme (taze ağırlık, FW) tartmak ve bir 1.0 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Santrifüj tüpü ve 30 için girdap 500 µL fosfat tampon eklemek s.
  4. Örnekleri 16.000 x gde 15 dakika santrifüj kapasitesi. Damlalıklı 100 µL süpernatant siyah 96 iyi plaka içine. Örnekleri bir yer (uyarma 485 nm, emisyon 528 nm) okuyun.

7. Toplam Aflatoksin Analizi

  1. Örnek işleme ve aflatoksin çıkarma
    1. 60 ° C'de 2 gün cebri hava fırında kuru çekirdek örnekleri Örnekleri tartmak ve 50 mL Cam tıpa ile Erlenmeyer şişeye koyun.
    2. Bir duman başlık, her şişeyi için 25 mL Metilen klorür ekleyin.
      Dikkat: Metilen klorür son derece kırılgandır ve tehlikeli (tahriş edici, kanserojen) olarak kabul edilir. Ne lateks ne de nitril eldiven Metilen klorür ile çalışmak için güvenlidir. Geliştirilmiş organik solvent dayanıklı PolyVinylAlcohol eldiven kullanın.
    3. 30 dk için örnekleri üzerinde bilek eylem sallayıcı. 30 dakika sonra yavaş yavaş özü bir yivli filtre kağıdı daire bir 80 mL kabı dökün. Bir duman hood kadehler kuru geceleme izin.
    4. Ertesi gün, Metilen klorür (yaklaşık 5 mL) iç bücür jant kuru kadehler, etrafında girdap ve 2 Dramı cam şişe dökün. Gecede bir duman mahallede kurumaya bırakın şişe açın.
  2. Aflatoksin Analizi
    1. 4.0 mL % 80 metanol ekleyin: Deiyonize H2O (v/v) tüpleri için.
    2. Kullanım filtre uygulamak için bir aflatoksin ekstraksiyon kiti metanol çözüm sağlanan sütun ile arındırmak. Toplam Aflatoksin düzeyleri ile bir yer, üreticinin yönergelerine göre analiz.

Sonuçlar

Mısır dönüştürme ve Transgenik bitkilerin moleküler tarama

Mısır Hi-II satırlarının olgunlaşmamış embriyo Lablab purpureus AILP gen CaMV 35S kontrol altında ifade son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium tumefaciens EHA101 zorlanma kullanılarak dönüştürülen organizatörü. Beş bağımsız olarak dönüştürülmüş Mısır satır T6 nesil sonraki ?...

Tartışmalar

Verim kayıp patojenler ve zararlıları nedeniyle tarımsal ürün içinde küresel bir sorun20olduğunu. Şu anda, uygulama sentetik mantar ilaçları ve böcek ilaçları kontrol bitki patojenleri ve zararlıları için baskın anlamına gelir, ama bu biochemicals gıda ve yem içinde kalan toksisitesi insan ve hayvan sağlık21için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Gıda ve yem kırpma olarak Mısır ekonomik önemi göz önüne alındığında, azalma veya aflatoksin k...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

David Meints, Arkansas Üniversitesi geliştirilmesi ve transgenik Mısır sırasında erken nesiller analiz onun yardım için teşekkür ederiz. Bu eser USDA-ARS CRIS proje 6054-42000-025-00D mali destek aldı. Ticari adlar veya ticari ürünler bu makalede söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA-ARS eşit istihdam fırsatı (EEO) ilkesi fırsat eşitliği için tüm kişilerin görev ve Ajans'ın personel politikaları, uygulamalar ve işlemler her yönüyle ayrımcılığı yasaklar.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarCaisson
Amazing Marine GoopEclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time SystemBio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf 5424 MicrocentrifugeFisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mLAce Glass6999-10
Ethanol
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cmFisher Scientific09-790-14E
Force Air OvenVWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant GlovesAnsell012-15-554
Innova 44 Incubator ShakerBrunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mLDKW Life Sciences14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for PlantsNexttec47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 cameraNikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS cameraNikon
Nunc Square BioAssay DishesThermoFisher Scientific240835
Phire Plant Direct PCR KitThermoFisher ScientificF130WH
Polycarbonate Vials, 15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mmDKW Life Sciences242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrateSigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasicSigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA KitSigma-AldrichSTRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''OPS DiagnosticsGBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 FluorometerBiotek
T100 Thermal CyclerBio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 juiceCampbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3Fisher Scientific09-820P
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific

Referanslar

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 144amilaz inhibit raflatoksinAspergillus flavusM s rtahlilLablab purpureusM s rtransgenik eleme ekirdek

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır