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要約

ゼブラフィッシュの人格が電流と弱い磁場を水への対応をどのように影響するかを評価するために設計された行動プロトコルについて述べる。同じ個性を持つ魚は彼らの探索行動に基づく区切られます。さらに、スイミング トンネルの低流速率と磁気の異なる条件の下で彼らの rheotactic 配向挙動を観察します。

要約

自分の環境で彼ら自身を方向づける、動物は、さまざまな人格など、いくつかの内部要因と相互作用する外部の手がかりを統合します。ここでは、ゼブラフィッシュの人格の複数の外部環境の手がかり、具体的には水の流れと磁場の方向応答に及ぼす影響の研究のために設計された行動プロトコルについて述べる。このプロトコルは積極的かどうかを理解することを目的とまたは反応性のゼブラフィッシュは、異なる rheotactic のしきい値を表示 (すなわち、魚が遡上を開始する流れ速度) 周囲の磁場がその方向を変更します。性格が同じゼブラフィッシュを識別するために魚がタンクの半分は明るい半分に狭い開口部と接続されている暗闇の中で紹介しています。積極的な魚だけを探る小説、明るい環境。反応性の魚はタンクの暗い半分を終了しないでください。低流量でスイミング トンネルは、rheotactic のしきい値を決定するために使われます。トンネル内の地球の磁場強度の範囲で磁場を制御する 2 つの設定を述べる: 流れ方向 (1 次元) と磁場の 3 軸制御を可能にする磁界を制御する 1 つ。魚は異なる磁場下でトンネル内の流れの速度の段階的増加を体験しながら撮影しました。配向挙動データはビデオ追跡手順を通じて収集された、rheotactic のしきい値の決定を許可するロジスティック モデルに適用されます。ゼブラフィッシュを浅くから収集した代表的な結果を報告します。具体的には、これらは積極的な魚は磁場の変化に応答しない、その方向に磁場が変化する場合のみ反応、慎重な魚が rheotactic の閾値の変動を示すことを実証します。この方法論は、磁気感受性の研究と多くの水生種、両方の孤独を表示またはスイミング戦略を浅く rheotactic 動作に適用できます。

概要

現在の研究では、魚の水の流れや磁場などの外部方向キューに魚の遊泳方向応答に人格の役割の調査のスコープを持つ研究室の行動プロトコルについて述べる.

様々 な感覚情報を計量動物の配向の決定の結果します。意思決定プロセスの影響を受けて移動する動物の能力によって (例えばを選択し、方向を維持する能力) の内部状態 (例えば、摂食や繁殖必要性)、移動 (例えば、歩行バイオメカニクス) といくつかの追加の能力外部要因 (例えば、時間帯、同種との相互作用)1。

内部状態や配向挙動で動物の人格の役割はしばしば不十分と理解されてまたは2を検討していません。よく調整を実行し、偏光グループ運動動作3社会的水生種の配向に関する研究、新たな課題が生じます。

水の流れは、魚の配向過程で重要な役割を再生します。魚の方向電流と呼ばれる逆さ流れ走性4、肯定的な (すなわち、上流指向) することができます無条件の応答または否定的 (すなわち下流指向) を水との最小化に採餌に至るいくつかの活動に使用エネルギッシュな支出5,6。また、文献の成長するボディは、多くの魚種では、オリエンテーションとナビゲーション7,8,9の地磁気を報告します。

魚の逆さ流れ走性と水泳パフォーマンスの研究は通常フロー チャンバー (水路)、魚にさらされている流れの速度の段階的増加高速、低速から枯渇 (危険速度と呼ばれる)10、まで頻繁に実施します。 11。一方、以前の研究はまだ水12,13の競技場で動物の遊泳行動の観察を通して方向に磁場の役割を調べた。ここでは、水の流れと磁場の両方を操作しながら魚の挙動を研究に研究ができる研究室テクニックについて述べる。このメソッドは周囲の磁場の操作 (すなわち、最小限の水速度の rheotactic のしきい値を決定する結論につながる私たちの以前の研究で浅くゼブラフィッシュ (動脈分布) で最初に利用されました。オリエント上流の魚が遊泳)14。このメソッドは、地球の磁場強度の範囲内の水路磁気フィールドを制御するセットアップと組み合わせての遅い流れと水路区域の使用に基づいています。

利用してゼブラフィッシュの動作を観察するスイミング トンネルは図 1の通りです。(Nonreflecting アクリル シリンダー直径 7 cm と 15 cm の長さから成っている) トンネルが流れレート14の制御のためのセットアップに接続されます。このセットアップでは、トンネル内の流量の範囲は 0 ~ 9 cm/秒で異なります。

スイミング トンネルの磁場を操作するには、2 つの方法論的アプローチを使用: 最初は 1 次元と 2 番目が立体化。アプリケーションにこれらのメソッド操作固有の磁気条件水の定義済みのボリュームを取得する地磁気-したがって、本研究で報告された磁場強度のすべての値は、地磁気を含めます。

1 次元に関する15のアプローチ、(x 軸として定義) 水の流れの方向に沿って、磁場を操作スイミング トンネルを包んだソレノイドを使用しています。これが電源ユニットに接続されている、それは均一静磁場 (図 2 a) を生成します。同様に、3次元的アプローチの場合、電線のコイルを用いたスイミング トンネルを含むボリュームで地磁気を変更します。ただし、3 次元磁場を制御するコイル 3 つの直交ヘルムホルツのペア (図 2 b) のデザインであります。ヘルムホルツの各ペアは 3 つの直交空間方向 (x y、およびz) に沿った 2 つの円形コイルから成るし、閉ループ条件で働く 3 軸磁力計を装備しました。磁力計は、磁界地球の自然フィールドに匹敵して (スイミング トンネルがある) コイル セットの幾何学的な中心の近くにあります。

彼らは磁場16に対応方法を浅瀬を構成する魚の性格に影響仮説をテストする上記の手法を実装する.我々 は、水の流れや磁場にさらされるとき予防と対処の人格17,18を持つ個人が異なる対応仮説をテストします。これをテストするには、我々 を割り当てる」の方法論と予防型または反応性17,19,20,21グループ個人を用いたゼブラフィッシュを並べ替えます。その後、反応性個人のみから成るまたは提案するサンプル データとして磁気水槽タンクに積極的な個人だけから成る群れで泳いでゼブラフィッシュの rheotactic の挙動を評価する.

並べ替えの方法は、新規環境21を探索する予防型と事後対応型の個人の異なった傾向に基づいています。具体的には、我々 は、明るいと暗い側17,19,20,21 (図 3) に分かれてタンクを使用します。動物は、ダークサイドに慣れるが。明るい側へのアクセスは、オープンで積極的な個人に、すばやく反応性の魚は、暗い水槽を放置しないでください、新しい環境を探索するタンクの暗い半分を終了する傾向があります。

プロトコル

次のプロトコルは、機関動物ケアとナポリ大学フェデリコ 2 世、ナポリ、イタリア (2015 年) の利用委員会によって承認されています。

1. 動物のメンテナンス

  1. 少なくとも 200 L のタンクを使用して、雌雄各タンクの少なくとも 50 個体の群れをホストします。
    注:タンクの中の魚の密度は、一匹あたり 2 L 以下をなければなりません。これらの条件の下でゼブラフィッシュ正常浅水影響の動作が表示されます。
  2. 以下の通りメンテナンス条件の設定: 27 ~ 28 ° C の温度電気伝導 < 500 μ S;pH 6.5-7.5。ない3 < 0.25 mg/L;10 h:14 h: 明暗日長。
    注:同一保持条件は混合された人口と分けられた予防と対処の人口のために使わなければなりません。

2 ゼブラフィッシュの性格選択

  1. 準備、メンテナンス タンクで使用したのと同じ水と静かな部屋 (図 3) 性格選択タンクを配置します。
  2. ビデオカメラやタンクの側面の上を配置します。地域にあるモニターでコンピューターにカメラを接続タンクとの視覚的接触がないです。
  3. 選択 9 メンテナンス タンクから魚をランダム、無結節網を使用して人格選択タンクのダークサイドに転送します。
    注:タンクと可能な限り時間の最低額に魚との対話を制限してください。ノイズや高速な動きを避けます。必要な場合は、少量輸送貯蔵タンクからの水が付いているタンク (約 2 L) で動物を譲渡します。動物の大気暴露を避けるためには、250 ml のビーカーを使用し、優しくビーカーを入力する動物を誘導します。キャプチャにかかる時間を最小限に抑えるため、それは動物に物理的な損傷を引き起こす可能性がありますストレスを増加させる要因としては、ネットで数秒以上の魚を保持しないと、複数の魚の収集を回避しようとします。魚は、アドリブ実験タンクに転送前に供給する必要があります。これは、食品を求める行動の異なる傾向が次実験22の中に、個人の行動に与える影響を制限します。同じ時刻に複製の実験を行います。これは、可能な概日リズム23による実験的グループの行動の可変性を最小限に抑えます。
  4. 順化 1 h 後スライド式のドアを開きます。
    注:10 分以内でタンクの明るい側面を探索、穴から終了者は、積極的な21と見なされます。
  5. 10 分後優しくタンクから積極的な個人を削除し、プロアクティブ ・ メンテナンス タンクに転送。
  6. 15 分後、反応21である暗いボックスに残る魚を収集し、反応性メンテナンス タンクに転送します。
    注:10 分21後タンクの明るい側面に移動する魚を破棄します。必要な予防と対処の魚のセクション 5 で説明するテストに必要な数が収集されるまで、一度に 9 魚と性格テストを実行します。予防型と事後対応型の性格の一貫性は、同じアプローチを使用して定期的にチェックできます。

3 1 次元磁場操作27磁気フィールドの設定します。

  1. 動力ユニット (図 2 a) に切り替えます。
  2. Rheotactic プロトコルがされる場所にコイル状のトンネルを配置実行されます (セクション 5) がそれはスイミング装置 (図 2 a) から切断してください。ガウス/Teslameter トンネル内で接続されている磁気プローブを配置し、トンネルの長軸に沿って磁気分野の値を取得する必要な電圧を確認します。
    注:ソレノイドの磁気特性のためフィールドが合理的にトンネル内均一これは、水平方向および垂直方向にプローブをゆっくり移動することによってチェックできます。
  3. プローブを外し、スイミング装置フロー トンネルに接続します。
  4. Rheotactic プロトコル (セクション 5) を開始します。

4. 三次元磁場と磁場のセットアップ操作27

  1. CPU、DAC、およびコイル ドライバー (図 2 b) に切り替えます。
  2. 3 つの軸 (x、y、および z) のそれぞれに磁気分野を設定します。
  3. ヘルムホルツのペアのセットの中心にトンネルを配置します。
  4. Rheotactic プロトコル (セクション 5) を開始します。

5. 流れ区域のゼブラフィッシュの逆さ流れ走性のテスト

  1. 5 人に 1 人の魚を側面及び底面に隠されていると 2 L のタンクを使用してフロー トンネルに転送します。
  2. ポンプをオンにし、1.7 cm/s トンネルで流量を設定します。
    注:このゆっくり動く水は酸素トンネルで水を保ち、動物の回復が容易になります。
  3. 1 h のスイミング トンネルに順応する動物をしましょう。
  4. トンネルで魚の行動のビデオ録画を開始します。
    注:リモート コントロール (例えば、Bluetooth) カメラ (李 4 K アクションなど) を用い, .mpg (30 フレーム/秒) として、ビデオを保存.
  5. (1.3 cm/秒; 本研究で選択した実験的プロトコルに従って流量の段階的増加を開始します。図 4)。
    注:ゼブラフィッシュの 2.8 BL (体の長さ) 0 から範囲の低流量を使用しました、このプロトコル/s。これらの流れの速度は、ゼブラフィッシュ (3% – 15% 重要な遊泳速度 [Ucrit])24の連続的な指向スイミングを誘発する流量の下限です。低流量 (次のブレットのプロトコル25) の使用は、水の流れの存在下でこの種の特定の行動の特性にリンクされています。ゼブラフィッシュは、商工会議所、水の流量の存在下でも頻繁に回転の主要な軸に沿って泳ぐや上流と下流の両方24,26を泳ぐ傾向がある傾向があります。この動作は比較的高速で消える、水の流量を受けます (> 8 BL/s)26、時動物は継続的に泳ぐ上流 (正 rheotactic 応答) に直面しています。縦と横の変位は非常にまれです。
  6. 形態の商工会議所で魚の写真でセックスと全体の長さ [TL]、フォーク長 [FL] (BL) 動物の形態計測を実行します。
    1. 適切な画像を選択します。
    2. ImageJ で画像を開きます。
    3. 動物のセックスの注意 (男性ゼブラフィッシュがほっそりと女性とより丸みを帯びた青と白の彩色を持つ傾向がある、黄色がかった、する傾向がある)。
    4. [ Analyze ] をクリックして > セット参照としてトンネルの全体の横の長さを使用して、センチメートル単位のイメージのスケール、スケールを設定します。
    5. [ Analyze ] をクリックして >測定して記録、動物の長さ。
    6. その体重 (帯域幅) を計算します。
      注:BW は、ラボでビルド以前セックス FL BW 関係やメタデータから計算されます。全体の手順は、動物の操作ストレスを回避できます。

6. ビデオ追跡

  1. トラッカー 4.84 ビデオ解析とモデリング ツール ビデオのファイルを開きます。
    注:必要に応じて、視点と放射歪みを filters を使用してビデオの歪みを修正します。
  2. 上部メニューの座標系をクリックし、センチと秒に時間の単位を長さの単位を設定します。
  3. クリックしてファイル>インポート>ビデオとトラッカー 4.84 で動画 1 つを開きます。
  4. 「座標軸」をクリックし、、トンネルに沿って x 軸と時間をかけて魚の位置を追跡するための参照システムを設定します。下流(水コンセント) で壁を終了の低角に原点を設定します。
  5. トラックをクリックして >新しい>質量の点と 1 つの魚を一度に追跡開始。各流量で過ごした魚各ステップの最後の 5 分を追跡します。
  6. 5 フレーム間隔でビデオを手動で進める (0.5 s) し、各上流と下流のターン (UDt;図5 赤ドット) で、各下流上流のターン (DUt;図 5では青い点) で時間と動物の位置をマークします。
    注:魚の位置のための参照として魚の目の位置を使用します。トラック ポイント質量を使用して動物の位置です。追跡から除外する任意非指向スイミング (すなわち、操縦時間) の期間。
  7. 追跡の各セッションの終わりには、x の値を選択し、ソフトウェア ウィンドウの右下隅のテーブルから値を時間します。データを右クリックし、[データのコピー ] をクリックして >完全な精度。
  8. (Udt と Dut の間のすべての間隔の合計) 時間の合計上流下流時間の合計 (Dut と UDt 間間隔の合計) と値を計算するテンプレート スプレッドシート ファイルを時刻の値およびすべての回転の位置の x 値を保存します。(RI %) の割合で rheotactic インデックスの各フロー ステップ (図 5参照)。
    注:魚は上流に直面して過ごす指向の時間の合計の割合で rheotactic の挙動を定量化 (水泳やほとんど凍結 [すなわち、彼らはトンネルの下でまだ滞在]27)。この割合は、RI % (図 5) として定義されます。
    figure-protocol-5406

結果

サンプル データとして結果予防と対処の浅水影響ゼブラフィッシュ16 図 2A (プロトコルのセクション 3 を参照) に示すようにセットアップを使用して水の流れの方向に沿って磁界制御を提案する.これらの結果は示してどのように記述プロトコルは、異なる個性を持つ魚の magnetic field への応答の違いを強調表示できます。これら...

ディスカッション

本研究では説明されたプロトコルにより水生生物など外部の 2 つの手がかり (水現在および地磁気分野) と動物の 1 つの内部要因の統合から生じる複雑な方向応答を定量化する科学者性格。全体的なコンセプトは、異なる性格の個体を分離し、個別に制御する、または同時に外部環境手がかり、その配向挙動を調査する科学者を可能にする、実験的なデザインを作成します。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

研究は物理学科の基本的な研究の創設とナポリ大学フェデリコ 2 世の生物学の部門によって支えられました。著者は博士クラウディア Angelini (研究所の微分積分学、Consiglio ナツィオナーレ ・ デッレ ・ ホリオカ [CNR]、イタリア) の統計的なサポートをありがちましょう。著者は、収集するデータ、および設計および実験装置の実現に、熟練した援助の部門技術者 F. Cassese、g. Passeggio、r. ロッコと彼らの技術的な助けのマルティナ Scanu とシルビアの Frassinet をありがとうございます。我々 はビデオの撮影中に実験を行っていただきローラ異邦人をありがちましょう。アレッサンドロ ・ Cresci のインタビュー文の撮影のためマイアミ大学からダイアナ ローズ Udel に感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
9500 G meterFWBellN/AGaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution:  0.01 μT 
AD5755-1Analog DevicesEVAL-AD5755SDZQuad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003DELC3760244880031DC Double Regulated power supply
BeagleBone BlackBeagleboard.orgN/ASingle Board Computer
Coil driverHome madeN/AAmplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairsHome madeN/ACoils made with standard AWG-14 wire
HMC588LHoneywell900405 Rev EDigital three-axis magnetometer
MO99-2506FWBell129966Single axis magnetic probe
Swimming apparatusM2M Engineering Custom Scientific EquipmentN/ASwimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278TECON/AThermo-cryostat 

参考文献

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