Bewerten den Einfluss der Persönlichkeit auf Empfindlichkeit gegenüber Magnetfeldern im Zebrafisch

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein behavioral Protokoll entwickelt, um zu beurteilen wie der Zebrafisch Persönlichkeiten ihre Reaktion auf Wasser Ströme und schwache Magnetfelder beeinflussen. Fische mit den gleichen Persönlichkeiten werden basierend auf ihren explorativen Verhalten getrennt. Dann wird ihre rheotactic Orientierungsverhalten in einem Swimming-Tunnel mit einer low-Flow-Rate und unterschiedlichen magnetischen Bedingungen beobachtet.

Zusammenfassung

Um sich in ihrer Umwelt zu orientieren, Tiere eine Vielzahl von externen Cues, die Interaktion mit mehreren internen Faktoren wie Persönlichkeit zu integrieren. Hier beschreiben wir eine Verhaltens Protokoll für die Untersuchung des Einflusses der Zebrafisch Persönlichkeit auf ihre Ausrichtung als Reaktion auf mehrere externe ökologische Hinweise, insbesondere Wasserströme und Magnetfelder. Dieses Protokoll soll zu verstehen, ob aktiv oder reaktiv Zebrafisch anzeigen verschiedene rheotactic Schwellenwerte (d. h. die Fließgeschwindigkeit, bei dem die Fische beginnen stromaufwärts) als das umgebende Magnetfeld ändert seine Richtung. Um Zebrafisch mit der gleichen Persönlichkeit zu identifizieren, sind Fische im Dunkeln eingesetzt die Hälfte eines Panzers mit einer schmalen Öffnung zu einem hellen Hälfte verbunden. Nur aktive Fische erkunden, Roman, helle Umgebung. Reaktive Fisch beenden nicht die dunkle Hälfte des Tanks. Ein Schwimmen-Tunnel mit geringen Durchflussmengen dient zur Bestimmung der rheotactic Schwellenwerts. Wir beschreiben zwei Setups um das magnetische Feld im Tunnel, im Bereich der Erde magnetische Feldstärke zu steuern: eine, die steuert das Magnetfeld entlang der Fließrichtung (eindimensional) und eine drei-axial Kontrolle des magnetischen Feldes ermöglicht. Fische werden gefilmt, und erleben Sie eine schrittweise Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit im Tunnel unter verschiedenen Magnetfelder. Daten über das Orientierungsverhalten sind durch eine Video-Tracking-Verfahren gesammelt und für ein logistisches Modell erlauben die Bestimmung der rheotactic Schwelle. Wir berichten über repräsentative Ergebnisse aus shoaling Zebrafisch gesammelt. Insbesondere zeigen diese, dass nur reaktiv, vorsichtige Fische Variationen der rheotactic Schwelle, zeigen wenn das magnetische Feld in seine Richtung variiert, während proaktive Fisch nicht zu Magnetfeld-Veränderungen zu reagieren. Diese Methode kann auf die Untersuchung der magnetischen Empfindlichkeit und rheotactic Verhalten von vielen aquatischen Arten, sowohl einzeln anzeigen oder shoaling schwimmen Strategien angewendet werden.

Einleitung

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Labor-basiertes Verhaltens Protokoll hat den Umfang der Untersuchung der Rolle von Fisch Persönlichkeit zur Reaktion Orientierung der shoaling Fische, externe Orientierung Hinweise, wie Wasserströme und Magnetfelder.

Die orientierenden Entscheidungen der Tiere ergeben sich aus mit einem Gewicht von verschiedenen sensorischen Informationen. Der Entscheidungsprozess ist beeinflusst durch die Möglichkeit des Tieres zu navigieren (z. B. die Fähigkeit, wählen und halten eine Richtung), seinen internen Status (z. B. Fütterung oder reproduktiven Bedürfnisse), seine Fähigkeit zu bewegen (z. B. Fortbewegung Biomechanik), und einige zusätzliche externe Faktoren (z. B. Uhrzeit, Interaktion mit Artgenossen)¹.

Die Rolle des internen Zustand oder tierischen Persönlichkeit in das Orientierungsverhalten oft unverstanden oder²nicht erforscht. In der Studie von der Orientierung des sozialen aquatische Arten, die oft ausführen koordiniert und polarisiert Gruppe Bewegung Verhalten³ergeben sich zusätzliche Herausforderungen.

Wasserströmungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Ausrichtung der Fische. Fisch Wasser Ströme durch eine Unconditioned Antwort genannt Rheotaxis⁴, deren Wert positiv sein können (d.h., stromaufwärts orientiert) oder negativ (d. h. flussabwärts orientiert) orientieren und wird verwendet für verschiedene Aktivitäten, angefangen bei Nahrungssuche auf die Minimierung der energetische Ausgaben^5,6. Darüber hinaus berichtet eine wachsende Zahl von Literatur, dass viele Fischarten für Orientierung und Navigation^7,8,9das geomagnetische Feld verwenden.

Die Untersuchung über die Rheotaxis und schwimmen die Fische erfolgt in der Regel in Fluss Kammern (Wildwasserbahn), wo Fische die schrittweise Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit von niedrigen bis hohen Geschwindigkeiten oft bis zu Erschöpfung (so genannte kritische Drehzahl)^{10ausgesetzt sind, 11}. Auf der anderen Seite, untersuchten frühere Studien die Rolle des magnetischen Feldes in der Orientierung durch die Beobachtung des Verhaltens Schwimmen der Tiere in den Arenen mit stillem Wasser^12,13. Hier beschreiben wir eine Labortechnik, die Forscher zur Untersuchung des Verhaltens von Fischen während der Manipulation die Wasserströmungen und das magnetische Feld können. Diese Methode wurde zum ersten Mal auf shoaling Zebrafisch (Danio Rerio) genutzt, in unserer vorherigen Studie, was zu dem Schluss, dem die Manipulation des umgebenden Magnetfeldes bestimmt, die rheotactic Schwelle (d. h. minimal Geschwindigkeit durch das Wasser an die shoaling Fische stromaufwärts Orient)¹⁴. Diese Methode basiert auf der Verwendung einer Wildwasserbahn Kammer mit langsamen Bewegungen kombiniert mit einer Einrichtung zur Kontrolle der des Magnetfeldes in der Klamm, im Bereich der Erde magnetische Feldstärke.

Der Swimming-Tunnel genutzt, um das Verhalten der Zebrafisch zu beobachten ist in Abbildung 1dargestellt. Der Tunnel (gemacht von einem Nonreflecting Acryl Zylinder mit einem Durchmesser von 7 cm und 15 cm lang) ist eine Einrichtung für die Kontrolle der Flow Rate¹⁴verbunden. Mit diesem Setup variiert das Spektrum der Durchflussmengen im Tunnel zwischen 0 und 9 cm/s.

Wenn das Magnetfeld im Schwimmen Tunnel bearbeiten möchten, verwenden wir zwei methodische Ansätze: die erste ist eindimensional und die zweite ist dreidimensional. Für jede Anwendung dieser Methoden zu manipulieren das geomagnetische Feld, um bestimmten magnetischen Bedingungen in einem definierten Volumen des Wassers zu erhalten – also alle Werte der magnetischen Feldstärke in dieser Studie berichtet das geomagnetische Feld enthalten.

Bezüglich der eindimensionalen Ansatz¹⁵, das magnetische Feld wird manipuliert, entlang der Fließrichtung Wasser (definiert als die x-Achse) über ein Magnetventil eingewickelt um den Swimming-Tunnel. Dies an ein Netzteil angeschlossen ist, und es erzeugt gleichmäßige statische Magnetfelder (Abbildung 2A). In ähnlicher Weise bei der dreidimensionalen Ansatz ist das geomagnetische Feld in das Volume mit dem Swimming-Tunnel mit Spulen von elektrischen Leitungen geändert. Allerdings haben die Spulen um das magnetische Feld in drei Dimensionen zu kontrollieren, das Design der drei orthogonalen Helmholtz-Paare (Abb. 2 b). Jedes Helmholtz-paar besteht aus zwei kreisförmigen Windungen entlang den drei orthogonalen Raumrichtungen (X, yund Z) und ausgestattet mit einem drei-axial Magnetometer unter geschlossenen Bedingungen arbeiten. Das Magnetometer arbeitet mit Feld Intensitäten vergleichbar mit natürlichen Feld der Erde, und es liegt in der Nähe der geometrischen Mitte des eingestellten Spulen (wo sich der Schwimmen Tunnel befindet).

Wir implementieren die Hypothese, dass die Persönlichkeitsmerkmale der Komposition ein Schwarm Fische beeinflussen die Art und Weise, die Sie auf Magnetfelder^{16 reagieren,}die oben beschriebenen Techniken. Wir testen die Hypothese, dass Personen mit proaktiven und reaktiven Persönlichkeit^17,18 unterschiedlich reagieren, wenn Wasser fließt und Magnetfeldern ausgesetzt. Um dies zu testen, sortieren wir zuerst Zebrafisch mit einer etablierten Methode zuweisen und Gruppe Einzelpersonen, die proaktive und reaktive^17,19,20,21. Dann bewerten wir das rheotactic Verhalten der Zebrafisch schwimmen in Schwärmen bestehend aus nur reaktiv Einzelpersonen oder bestehend aus nur proaktive Individuen in den magnetischen Flume-Tank, die wir als Sample-Daten darstellen.

Die Sortiermethode basiert auf die verschiedenen Tendenz der proaktiven und reaktiven Individuen, neue Umgebungen²¹zu erkunden. Insbesondere nutzen wir einen Panzer in eine helle und eine dunkle Seite^17,19,20,21 (Abbildung 3) unterteilt. Tiere sind auf die dunkle Seite gewöhnt. Beim Zugriff auf die helle Seite offen, proaktive ist tendenziell Menschen schnell beenden die dunkle Hälfte des Tanks, um die neue Umgebung zu erkunden, während die reaktive Fische nicht die dunklen Tank lassen.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde von der institutionellen Animal Care und Verwendung von der Universität von Neapel Federico II, Neapel, Italien (2015) genehmigt.

1. Tier Wartung

1. Verwenden Sie Panzer von mindestens 200 L zu einem Schwarm von mindestens 50 Personen beider Geschlechter in jedem Tank host.
   Hinweis: Die Dichte der Fische in den Tank muss ein Tier pro 2 L oder niedriger sein. Unter diesen Bedingungen zeigt Zebrafisch shoaling Normalverhalten.
2. Die Haltungsbedingungen wie folgt festgelegt: Temperatur bei 27-28 ° C; Leitfähigkeit bei < 500 μS; pH 6,5-7,5; Nr.₃ in < 0,25 mg/L; und ein Licht: dunkel Photoperiode um 10 H:14 h.
   Hinweis: Identischen Haltungsbedingungen müssen sowohl der gemischte und getrennte proaktiven und reaktiven Bevölkerung zur Verfügung.

(2) Persönlichkeit Auswahl im Zebrafisch

1. Bereiten Sie und platzieren Sie die Persönlichkeit Auswahl Tank in einem ruhigen Raum (Abbildung 3) mit dem gleichen Wasser wie in der Instandhaltung-Tanks.
2. Legen Sie eine Videokamera oben oder an der Seite des Tanks. Schließen Sie die Kamera an einen Computer mit einem Monitor befindet sich in einem Gebiet wo es kein Sichtkontakt mit dem Tank.
3. Wählen Sie neun Fische nach dem Zufallsprinzip aus dem Tank Wartung und übertragen Sie sie auf die dunkle Seite der Persönlichkeit Auswahl Tank, mit einem knotenlosen Net.
   Hinweis: Versuchen Sie, die Interaktionen mit den Panzern und Fische zu den geringst möglichen Zeit zu begrenzen. Vermeiden Sie Lärm und schnelle Bewegungen. Falls erforderlich, übertragen Sie die Tiere in einem kleinen Volumen Transport Tank (ca. 2 L) mit Wasser aus dem Vorratstank. Um Luft Exposition von Tieren zu vermeiden, verwenden Sie ein 250-ml-Becherglas und induzieren Sie sanft das Tier in den Becher geben. Versuchen Sie, die Aufnahmezeit minimieren, vermeiden mehrere Fische zu sammeln, wie es den Tieren physischen Schaden zufügen könnte und halten Sie Fisch nicht mehr als ein paar Sekunden im Netz, da diese Faktoren Stress erhöhen können. Fische müssen vor der Übertragung an den experimentellen Tank ad libitum gefüttert werden. Dies schränkt die Möglichkeit, dass verschiedene Tendenzen der Nahrung suchende Verhalten das Verhalten der Personen während der folgenden Experiment²²beeinträchtigen würde. Wiederholte Experimente zur gleichen Zeit des Tages. Dies minimiert die Variabilität im Verhalten von den experimentellen Gruppen verursacht durch mögliche Tagesrhythmus²³.
4. Öffnen Sie nach 1 h der Akklimatisation die Schiebetür.
   Hinweis: Personen, die aus dem Loch, Ausfahrt Erkundung der hellen Seite des Tanks innerhalb von 10 min, gelten als proaktive²¹.
5. Nach 10 Minuten sanft nehmen Sie die proaktive Individuen aus dem Becken und übertragen Sie sie auf die proaktive Wartung Tank.
6. Nach 15 min sammeln Sie die Fische, die im dunklen Feld bleiben die reaktive²¹gelten, und übertragen Sie sie auf die korrigierende Wartung Tank.
   Hinweis: Entsorgen Sie Fische, die auf der hellen Seite des Tanks nach 10 min²¹verschieben. Durchführen der Persönlichkeitstest mit neun Fische nacheinander, bis die gewünschte Anzahl von proaktiven und reaktiven Fisch notwendig für die in Abschnitt 5 beschriebenen Tests gesammelt werden. Konsistenz der proaktiven und reaktiven Persönlichkeit kann regelmäßig mit dem gleichen Ansatz überprüft werden.

3. Einrichten des magnetischen Feldes mit der eindimensionale Magnetfeld Manipulation²⁷

1. Schalten Sie das Netzgerät (Abbildung 2A).
2. Legen Sie die aufgerollten Tunnel an der Stelle, wo das rheotactic Protokoll werden, durchgeführt (Abschnitt 5) aber halten es vom Schwimmbad Bodenreiniger (Abbildung 2A getrennt). Legen Sie eine Magnetsonde, verbunden mit einem Gauss/Teslameter innerhalb des Tunnels und überprüfen Sie, welche Spannung notwendig, den Wert der gewählten Magnetfeld entlang der Hauptachse des Tunnels zu erhalten ist.
   Hinweis: Aufgrund der magnetischen Eigenschaften von ein Magnetventil ist das Feld relativ einheitlich innerhalb des Tunnels; Dies kann überprüft werden, indem Sie die Sonde langsam bewegen, sowohl horizontal als auch vertikal.
3. Trennen Sie die Sonde und verbinden Sie die Fluss-Tunnel auf den Swimming-Apparat.
4. Beginnen Sie mit dem rheotactic-Protokoll (Abschnitt 5).

4. set Up des magnetischen Feldes mit dem dreidimensionalen Magnetfeld Manipulation²⁷

1. Schalten Sie die CPU, DAC und Spule Treiber (Abb. 2 b).
2. Festlegen der gewählten Magnetfeldes auf jeder der drei Achsen (X, y und Z).
3. Platzieren Sie den Tunnel in der Mitte der gesetzten Helmholtz-Paare.
4. Beginnen Sie mit dem rheotactic-Protokoll (Abschnitt 5).

5. Test der Zebrafisch Rheotaxis in der Flow-Kammer

1. Übertragen Sie ein bis fünf Fische bis zum Fluss-Tunnel mit einem 2 L Tank mit den Seiten und unten verdeckt.
2. Schalten Sie die Pumpe und die Fließgeschwindigkeit in den Tunnel auf 1,7 cm/s.
   Hinweis: Dieses langsame Wasser hält das Wasser im Tunnel Sauerstoff und es erleichtert Tier Erholung.
3. Lassen Sie die Tiere zum Schwimmen Tunnel für 1 h zu akklimatisieren.
4. Starten Sie die video-Aufzeichnung des Verhaltens des Fisches im Tunnel.
   Hinweis: Wir nutzten eine Kamera (z. B. Yi 4K Aktion) mit Fernbedienung (z.B. Bluetooth) und das Video als MPG (30 Bilder/s) gespeichert.
5. Starten Sie die schrittweise Erhöhung der Durchflussmenge gemäß dem gewählten experimentelle Protokoll (1,3 cm/s in dieser Studie; ( Abbildung 4).
   Hinweis: Für dieses Protokoll verwendet wir niedrige Durchflussmengen, die für Zebrafisch, im Bereich von 0 bis 2,8 BL (Körperlängen) / s. Diese Strömungsgeschwindigkeiten sind im unteren Bereich der Flussraten, die kontinuierliche orientierten Schwimmen im Zebrafisch (3 – 15 % der kritischen schwimmen Geschwindigkeit [U_Krit])²⁴zu induzieren. Die Verwendung von low-Flow-Rate (folgenden Brett Protokoll²⁵) ist mit der spezifischen Verhaltensmerkmale dieser Spezies in Anwesenheit von Wasserströmungen verbunden. Zebrafisch tendenziell schwimmen entlang der Hauptachse der Kammer, häufig auch in Gegenwart von Wasser Fluss, drehen und neigen zu vor- und nachgelagerten^24,26schwimmen. Dieses Verhalten wirkt sich durch die Wasser-Fluss-Rate, verschwinden bei relativ hohen Geschwindigkeiten (> 8 BL/s)²⁶, wenn die Tiere ständig Schwimmen mit Blick auf die vorgelagerten (volle positive rheotactic Antwort). Vertikalen und transversale Verschiebungen sind sehr selten.
6. Bilder von Fischen in einer Kammer morphometrische Morphometrie der Tiere (Geschlecht und die Gesamtlänge [TL], Gabellänge [FL] oder BL) führen.
   1. Wählen Sie das entsprechende Bild.
   2. Öffnen Sie das Bild in ImageJ.
   3. Beachten Sie das Geschlecht des Tieres (männliche Zebrafisch sind schlank und eher gelblich, während Weibchen mehr gerundet sind und blaue und weiße Farbstoffe haben tendenziell).
   4. Klicken Sie auf analysieren > Maßstab gesetzt und Set die Skalierung des Bildes in Zentimeter, die gesamte horizontale Länge des Tunnels als Referenz verwenden.
   5. Klicken Sie auf analysieren > Messung und Aufzeichnung der linearen Länge des Tieres.
   6. Seines Körpergewichts (BW) zu berechnen.
      Hinweis: BW errechnet sich aus Geschlecht-FL-BW Beziehungen zuvor im Labor gebaut oder Metadaten. Das gesamte Verfahren vermeidet Manipulation Stress für die Tiere.

6. Video Tracking

1. Öffnen Sie die Videodatei mit Tracker 4,84 Videoanalyse und Modeling Tool.
   Hinweis: Korrigieren Sie ggf. alle video Verzerrung mit Perspektive und radiale Verzerrung Filter.
2. Klicken Sie im oberen Menü auf Koordinatensystem und die Längeneinheiten auf Zentimeter und die Zeiteinheiten auf Sekunden.
3. Klicken Sie auf Datei > Importieren > Video und Öffnen eines Videos in Tracker 4,84.
4. Klicken Sie auf "Koordinatenachsen" und das Bezugssystem, die Position der Fische im Laufe der Zeit mit der x-Achse entlang des Tunnels zu verfolgen. Legen Sie den Ursprung an der niedrigen Ecke der nachgelagerten Wand (am Wasser Steckdose) endet.
5. Klicken Sie auf Track > New > Punkt der Masse und verfolgen einen Fisch zu einem Zeitpunkt starten. Verfolgen Sie die letzte 5 min der einzelnen Schritte, die die Fische bei jeder Durchflussrate ausgegeben.
6. Vorab das Video manuell in Abständen von fünf-Frame (0,5 s) und markieren Sie die Zeit und die Position des Tieres bei jedem stromaufwärts stromabwärts (UDt, rote Punkte in Abbildung 5) und bei jeder downstream upstream (DUt; blaue Punkte in Abbildung 5).
   Hinweis: Verwenden Sie die Fisch Augenposition als Referenz für den Fisch-Position. Verfolgen Sie das Tier Position mit einer Punkt-Masse. Die Verfolgung ausschließen eines Zeitraums von nicht-orientierten schwimmen (d. h. manövrieren Zeit).
7. Am Ende jeder Sitzung verfolgen wählen Sie die X-Werte und Werte aus der Tabelle auf der rechten unteren Ecke des Fensters Software. Mit der rechten Maustaste auf die Daten und klicken Sie auf Daten kopieren > volle Präzision.
8. Speichern Sie die Zeitwerte und X-Werte von allen Drehpositionen auf eine Vorlage Tabellenkalkulationsdatei vorgelagerten Gesamtzeit (Summe aller Intervalle zwischen UDts und Prüflingen) sowie die nachgeschalteten Gesamtzeit (Summe der Intervalle zwischen den Prüflingen und UDt) und die Werte berechnen der rheotactic Index in Prozent (RI %) für jede Strömung Schritt (siehe Abbildung 5).
   Hinweis: Das rheotactic Verhalten wird durch den Anteil der orientierte Gesamtzeit, die die Fische verbringen mit Blick stromaufwärts quantifiziert (Schwimmen oder selten Einfrieren [d. h., sie bleiben immer noch am Ende des Tunnels]²⁷). Dieser Anteil ist definiert als die RI % (Abbildung 5).
   

Ergebnisse

Als Beispieldaten präsentieren wir Ergebnisse, die das Magnetfeld entlang der Fließrichtung Wasser auf proaktive und reaktive shoaling Zebrafisch¹⁶ mit dem Setup, dargestellt in Abbildung 2A (siehe Abschnitt 3 des Protokolls) zu kontrollieren. Diese Ergebnisse zeigen, wie das beschriebene Protokoll Unterschiede in den Reaktionen auf das magnetische Feld in Fischen mit unterschiedlichen Persönlichkeiten hervorheben kann. Das Gesamtko...

Diskussion

In dieser Studie beschriebene Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, komplexe Orientierung Antworten von aquatischen Arten, die aus der Integration zwischen zwei externen Cues (Wasser aktuelle und geomagnetische Feld) und einem internen Faktor des Tieres, wie z. B. zu quantifizieren Persönlichkeit. Das Gesamtkonzept ist ein experimentelles Design erstellen, das können Wissenschaftler zu trennen Personen unterschiedlicher Persönlichkeit und deren Orientierungsverhalten während Steuerung separat oder gleichzeitig d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution:  0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3760244880031	DC Double Regulated power supply
BeagleBone Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405 Rev E	Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat