化学療法誘発性粘膜炎のマウスモデルを用いて小腸損傷と適応を評価するための重要なエンドポイントと増殖マーカー

要約

ここでは、化学療法誘発性粘膜炎のモデルを用いて、小腸損傷および代償過剰増殖の重要なエンドポイントおよび増殖マーカーを確立するためのプロトコルを提示する。細胞周期特異的マーカーを用いて増殖細胞の検出を実証し、小腸重量、暗号深さ、およびウイルス高さをエンドポイントとして用いた。

要約

腸の適応は、外傷のために腸が失われたときに発生する自然な補償メカニズムです。クリプト細胞増殖や栄養吸収の増加などの適応応答は、回復に重要ですが、まだ十分に理解されていません。適応応答の背後にある分子メカニズムを理解することは、適応を高めるために栄養素や薬物の同定を容易にするために重要です。文献全体でさまざまなアプローチとモデルが説明されていますが、再現可能なデータを得るためには、本質的に手順を実行するための詳細な説明方法が必要です。ここでは、マウスにおける化学療法誘発性粘膜炎のモデルを用いて、小腸損傷および代償過剰増殖の重要なエンドポイントおよび増殖マーカーを推定する方法について説明する。細胞周期特異的マーカーを用いた増殖細胞の検出と、小腸重量、暗号深さ、およびウイルス高をエンドポイントとして用いる実証を行う。記載された方法内の重要なステップのいくつかは、小腸の除去と計量であり、この技術の測定のために提案されたかなり複雑なソフトウェアシステムである。これらの方法には、時間がかからず、費用対効果が高く、実行と測定が容易であるという利点があります。

概要

腸の適応は、病気や手術によって腸が失われたときに発生する自然な補償メカニズム^です1,².外傷の後、腸は形態的および機能的適応反応を受け、暗号細胞増殖および増加した栄養^吸収3を特徴とする。この手順は、回復に重要ですが、十分に理解されていません。腸適応反応の実験的研究は、マウス、ラット、ブタの小腸切除後に起こる変化に焦点を当てているが、他の種類の傷害における適応反応の背後にある分子機構を理解する(例えば、化学的)または細菌)は、適応を高めるために栄養素や薬物の同定を容易にするために重要である。実験的に、組織病理学的スコアリングや傷害の結果の測定を含む、小腸病理学の複雑な分子および細胞指数を記述するために、異なるアプローチが使用されてきた。それにもかかわらず、文献に欠けているものは、再現可能なデータを得るために必要な手順を実行する方法の詳細な説明です。腸ホルモンなどの適応に関与する因子を特定する際には、簡単で低コストで再現可能な動物モデルが保証されており、ここでは化学療法誘発性腸粘膜炎(CIM)のモデルを使用することをお勧めします。

傷害および適応の両方の最も簡単で非常に有益なエンドポイントの1つは、小腸(SI)の質量を測定することです。粘膜炎の特徴は腸球のアポトーシス、時間依存性絨膜萎縮および減少した有人性症である。したがって、腸の形態を調べることは、前臨床モデル4、5において非常に関連性が高い。ヒトにおいて、機能する腸球のマーカーである血漿シトルリンの減少は、吸収能力7に加えて毒性スコアおよび炎症マーカー6と相関し、このアミノ酸が優れたバイオマーカーであることを示唆している。粘膜炎。シトルリンは、マウスとラットの両方で測定することができ、かつ、ニルス長さ8、暗号生存9、および放射線誘発粘膜^炎10との優れた相関を示している。

血漿シトルリンを測定する主な利点は、1匹の動物から繰り返し測定を収集する能力です。しかし、マウスの複数の血液サンプリングは、6 μL/g/週の総血液量に制限され、全身麻酔を必要とする。これは残念ながら、マウスにおけるシトルリン測定の使用も制限する。さらに、シトルリンの測定には高性能液体クロマトグラフィー11、12が必要であり、コストと時間がかかる。最近,マウスのシトルリンレベルがSI重量(p< 0.001)(未発表データ)と有意に相関していることを示し,シトルリンは腸球塊を反映する直接測定を行った.SI重量の測定に制限は、マウスが犠牲にされる必要があるため、同じマウス内で繰り返し測定することは不可能です。それでもこの方法は、研究の質問に向けられた他の様々な組織分析を行う可能性を提供し、これらの事実は、おそらく動物の追加の使用を補うことができる。したがって、我々は、マウスにおける傷害および適応の容易で低コストで、速いバイオマーカーとしてSI重量を使用することをお勧めします。再現性と許容可能な分析変動を確保するために、腸は慎重に動物から除去し、生理生理生理で洗い流し、空にし、計量する前に乾燥する必要があります。この記事では、この手順の実行方法を正確に示します。

粘膜炎のもう一つの特徴は、再生期間中のクリプト内の増殖細胞の喪失と再生期間中の代償的過剰増^殖3である。細胞マーカーKi67は、免疫組織^化学13によって速増殖性細胞を決定するために頻繁に使用されている。Ki67は増殖の単純なマーカーであるが、細胞周期(G1、S、G2、およびM)14のすべての活性相中にKi67が存在するように不正確な傾向がある。特定の標識は複製細胞を検出するために不可欠であり、これは我々が5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)、チミジンの合成類似体のその代わりに組み込むことを提案する理由であり、それは主にS^相15における細胞の複製に制限される。BrdUは犠牲の150分前に動物に注入され、その後BrdU特異的抗体を用いて免疫組織化学で細胞を検出することができる。この方法の記事では、自由な画像ソフトウェアを用いて暗号内のBrdU免疫陽性細胞の面積を測定する方法を正確に示す。

形態学的および機能的変化は、しばしば5-FU誘発粘膜炎モデルで研究され、腸の適応は、絨活度および暗号深さによって評価される。この研究の間に、傷害期に等しい粘膜炎の急性期の間に、BrdUの取り込みによって測定された増殖は暗号深さと相関しないことがわかった。これとは対照的に、暗号深さは、誘導後3~5日後の粘膜炎の修復段階で見られる増殖と有意に相関する。これは、粘膜炎の急性期は、暗号深さだけでは測定できないことを示唆している。粘膜炎マウスの急性期のエンドポイントとして増殖を使用する場合、BrdUの取り込みは好ましくは使用されるべきであるが、再生段階の後の段階で過増殖を定量する場合、暗号深さは合理的であるBrdUの設立に代わる。本研究の目的は、腫瘍学の分野で、特に腸の損傷モデルに精通していない研究者の両方で、すべての研究者が使用できる方法でこのモデルを記述することでした。

記載されたモデルは、体重、SI重量、暗号深度をエンドポイントとして使用する適応応答に従ってトランスジェニックモデルを表現するために使用できます。一例として、L細胞分泌が不十分な細胞ノックアウトモデルで5-フルオロウラシル(5-FU)誘導粘膜炎のモデルをどのように用いたのか^を示す。グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)及びグルカゴン様ペプチド-2(GLP-2)は、食物摂取に応答して腸内分泌L細胞から共分される腸ホルモンである17,18である。GLP-2は、腸治癒の重要な因子として認識され、粘膜アポトーシスの調節およびSI 19、20、21、22のバリア機能の改善。文献に基づいて、我々は内因性ホルモンが傷害後の適応反応で起こる代償的過剰増殖に不可欠であると仮定した。

プロトコル

記載されたすべての方法は、動物実験を支配するデンマークの法律(1987)のガイドラインに従って行われました。研究は、デンマーク動物実験検査(2013-15-2934-00833)と地元の倫理委員会の許可を受けて行われました。

注:メスC57BL/6Jマウス(〜20−25g)を得て、標準的な12h光、水および標準チョウへの自由なアクセスと12時間の暗い周期のケージごとの8を収容した。実験が始まる前に、動物は1週間順応するために残された。

1. 5-フルオロウラシルを用した粘膜炎の誘導

1. 50mg/mL溶液中に5-フルオロウラシル(5-FU)を得る。
2. マウスの体重を計量し、記録する。体重から、注射のための5-FUの量を計算します(例えば、400 mg/kg)。
3. 27 G x 30 mm の針に接続された 1 mL シリンジを準備し、注射器を 5 FU の計算量で充填して注射器を注入します。
4. スクラフト法でマウスを拘束します。これを行うには、片手で尾のベースをつかみ、ワイヤーバーの蓋などのつま先をつかむ表面に置きます。片手で尻尾を配置しながら、もう片方の手で首の擦り傷を保持します。
5. 人差し指と親指をできるだけ後ろに伸ばして、マウスの本体を片手にしっかりと置きます。マウスを固定するために、この同じ手の指の間に尾を置きます。
6. しっかりとした穏やかなグリップでマウスを維持しながら、マウスの腹部側を露出させ、腹部の右下または左象限の腹腔内腔に針を挿入する。適切な配置を確保し、400 mg/kg 5-FUを注入するために吸引します。

2. ティッシュコレクション

1. 生理生殖液(0.9%NaCl)で希釈したケタミン/キシラジン(100/10mg/kg)の精前注射でマウスを麻酔する。ピンチ離脱反射を観察することにより、麻酔の深さを監視します。
   注:麻酔は非回復麻酔です。
2. 麻酔マウスの重量を記録します。
3. マウスを圧上の位置に置き、腹腔を露出させる開腹術を行い、続いて胸腔の切開を行い、気胸を導入する。
4. はさみを使って、横隔膜を切り開いて動物を犠牲にする。
5. 小腸を取り除く。ピロラスより優れた切り取り、盲腸に達するまで小腸を慎重に引き込み、盲腸の直前に切り取ります。
6. 鉗子を使用して、近位の内膜を静かに締め付ける。25Gの針を取り付けた1 mL注射器を使用して、小腸を生理食生で洗い流し、便を取り除きます。
7. 手術器具で腸内膜から生理生理生理をそっと取り除く。
8. 余分な生理生理を慎重に除去するために、きれいなしみ取り紙の上に小腸を置きます。
9. フラッシュされた組織の重量を記録します。
10. 水洗された小腸の体重を体重のパーセンテージとして計算します。

3. 小腸内腸の精巣学

1. 組織製剤
   1. ヒュームフードでは、十二指腸、jejunumおよび回腸から各マウスから洗い流された腸組織の3cmのセクションを切断し、室温で24時間ホルマリンの10%ホルマリンで切片を固定するためにはさみを使用します。
      注:固定体積は、組織体積の5~10倍である必要があります。
   2. 固定ティッシュをまな板に移します。
   3. メスを使用して、約1センチメートルに組織をトリミングし、埋め込みカセットに転送します。
      注:カセットには、鉛筆でサンプル識別(ID)でラベルを付けます。
   4. カセットを70%エタノールに沈め、さらに処理するまで4°Cに保存します。
2. パラフィンに埋め込む組織
   1. 上昇アルコール溶液に配置することにより、組織を脱水します。カセットを1時間70%エタノールに入れ、続いて1時間80%エタノール、1時間95%エタノール、1.5hのエタノール1.5hのエタノールを1.5時間エタノールに移します。
   2. 58−60°C間で加熱されたパラフィンワックスでカセットを浸します。鉗子を使用して組織を横方向に配置し、固体になるまで24時間以上冷却するためにブロックを残します。
3. マイクロトームを用いた組織の切断
   1. ブロックを置き、組織を氷の上に5分間下向きに置き、マイクロトームを使用して、10−30 μmの厚さでパラフィンブロックをトリミングし、組織表面を露出させます。
   2. 組織ブロックの断面を3~5μmの間に切断し、十二指腸、精巣および回腸からの横断断面を作る。
   3. パラフィンリボンを40~45°Cの水風呂に入れます。鉗子を使用してセクションを区切ります。
   4. 顕微鏡スライドを使用して、水からセクションをピックアップします。
   5. スライドを30分間乾燥させてから染色してください。
      注:長期間保存する場合は、スライドを冷蔵庫に保管してください。
4. 組織のヘマトキシリン-エオシン染色
   1. 顕微鏡スライドを精科の揺りかごに入れましょう。60°Cに設定された加熱キャビネット内のスライドを60分間脱パラフィン化します。
      注:冷蔵庫から直接スライドは、加熱キャビネットに入れる前に室温に達するために残しておく必要があります。
   2. ヒュームフードでは、クリアリング剤(材料の表)の3つの変更で組織を水分補給し、最初のクリアリング剤瓶に20ディップを作り、2つの追加のクリアリング剤瓶のそれぞれに7-8分間立たせてください。スライドを降順のアルコール溶液に移し、99%エタノールの3つの変化から始め、続いて96%エタノールと70%エタノールの2つの変化を行う。各瓶に最低20ディップを作ります。流水に移し、スライドを5分間立たせてください。
   3. フィルター処理されたマイヤーのヘマトキシリンにスライドを1分間浸します。
   4. 水道水で5分間洗います。
   5. 1-2分間エオシン汚れに切片を浸し、水道水ですすいでください。
   6. 上昇アルコール溶液に配置することにより、組織を脱水します。70%エタノールから始め、次いで96%エタノール、96%エタノール、4倍99%エタノールが続きます。各瓶に最低20ディップを入れ、クレードルを99%エタノールに取り付けるまで放置します。
   7. マウントは、スライドの表面に少量の取り付け媒体を適用することによってスリップします。カバースリップの下に気泡を作成せずに、取り付け媒体の上にカバースリップを置きます。24時間乾燥させてください。
   8. カメラに接続された光顕微鏡を使用して組織を調べ、組織学的な写真を得ます。ティッシュスライドの完全なカバレッジに達するまで、10倍の目的でスナップショットを作成します。

4. 暗号深さおよび/または絨可能性の高さの測定

1. 分析ソフトウェア(禅ライト、材料の表)をダウンロードしてインストールします。
2. ソフトウェアで画像を開き、カメラに接続します。20倍の目的でカメラモードでスナップショットを取ります。
3. 処理モードで、スナップショットを開きます。
4. 暗号の深さを測定するには:2Dビューで、グラフィックス タブからライン ツールを選択します。20 の指向の暗号に対してこのアクションを繰り返します (補足図1)。
5. ビルの高さを測定するには:2Dビューで、グラフィックスタブからラインツールを選択し、向きを整えたビルを選択し、明面投影の終わりにラインを開始し、暗号の開始時に終了します。20 の指向のビリ (補足図1) に対してこのアクションを繰り返します。
6. 2D ビューからメジャービューに切り替えて、測定値を表示します。
7. 測定値をエクスポートし、暗号深さと高さの平均を計算します。

5. 免疫組織化学によるBrdU定量(増殖)

1. BrdU溶液の注入
   1. マウスの体重を計量し、記録する。
   2. ヒュームフードで、リン酸緩衝生理食液(PBS)中に0.5%w/vブロモデオキシリジン(BrdU)溶液の代表量を調記する。
   3. ヒュームフードに、皮腔内注射によりBrdUの50mg/kgを注入する。
      注:各マウスがBrdU注射後正確に150分ポストで安楽死するようにするには、組織採取を適切に行うために、各マウスを10−20分間隔で連続して注入する。
   4. 注射の時間を記録します。
   5. 150分待ってからマウスを麻酔し、ステップ2.1−2.7に記載されている組織を収集する。セクション5.2に記載されているように、BrdU免疫組織化学を実行します。
2. BrdU免疫組織化学
   1. 手順 3.1.1−3.3.4に記載されているように組織を調調べる。
   2. 抗原検索の場合は、ガラスの専門瓶に切片を入れたスライドクレードルを置き、電子レンジでEDTAバッファー(pH9)を750Wで1分間、続いて350Wで9分間使用します。
      注:ティッシュが乾燥していないことを確認し、加熱の間に瓶にバッファを追加する必要があります。
   3. トリスバッファー生理生理生理生理とポリソルベート20(TBS-T)バッファーでセクション2−3をそれぞれ3分間洗浄します。
   4. 内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で10~15分間、過酸化ブロック(材料表)を5滴塗布します。TBS-Tバッファーでセクション2−3をそれぞれ3分間洗浄します。
   5. げっ歯類ブロックバッファー(材料の表)を室温で30分間5滴塗布し、非特異的結合をブロックする。TBS-Tバッファーでセクション2−3をそれぞれ3分間洗浄します。
   6. モノクローナルマウス抗BrdU抗体で切片を1:500〜1時間希釈して室温でインキュベートする。TBS-Tバッファーでセクション2−3をそれぞれ3分間洗浄します。
   7. 各スライドに5滴のワサビペルオキシダーゼを塗布し、室温で15分間インキュベートすることにより、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を用いて免疫陽性を可視化する。セクションをヒュームフードに移し、DABの150 μLを追加し、5分間インキュベートします。
      注:DABを取り扱う場合は必ず手袋を着用し、廃棄物を適切に処分してください。
   8. 脱イオン水の断面をすすいでください。
   9. 手順 3.4.6 および 3.4.7 に記載されているように、組織を脱水し、カバースリップを取り付けます。
3. 免疫反応の可視化
   1. カメラに接続された光顕微鏡で組織サンプルを視覚化します。
   2. 分析ソフトウェアを使用して、すべてのセクションの 20 倍の目的を使用して顕微鏡画像を取得し、 にファイルを保存します。JPG 形式。
   3. ImageJ ソフトウェアのキャリブレーション ツールとして使用される 20 倍の目的を使用して、ステージ マイクロメーターのスナップショットを作成します。
4. BrdU免疫反応細胞の面積の測定
   1. ImageJ ソフトウェア (材料の表) をインストールします。
   2. ImageJ のイメージにスケールを割り当てる: ImageJ ファイルを使用してステージマイクロメータイメージを開く|メニューコマンドを開きます。直線選択ツールを選択します。
   3. 直線ツールを選択し、マイクロメータ画像に直線を描画して既知の距離を定義します。
   4. [解析]メニューで[スケールを設定] を選択します。
   5. [既知の距離] ボックスに値を入力し、[長さの単位]ボックスに長さの単位を定義します。このキャリブレーションが、この ImageJ セッションで開かれているすべてのイメージに適用られるように、[グローバル] を選択します。
   6. ImageJ ファイルを使用して目的のイメージを開く |メニューコマンドを開いて、クリプトあたりのBrdU免疫反応細胞の面積を測定する。
   7. [イメージ/タイプ]メニューの下でカラー グラフィックスを 8 ビットに設定します。
   8. [プロセス/エンハンスコントラスト]で画像のコントラストを上げ、飽和ピクセルを 0.4% に設定します。
   9. 画像にしきい値を適用して、免疫陽性をセグメント化します。[画像/[調整]メニューの下で[画像/調整]を選択し、しきい値を選択し、赤色(赤で表示される暗い領域)を選択します。しきい値バーを移動して、約 10~20% のしきい値を選択します。
      注: 背景ができるだけ少ないすべての BrdU 陽性セルを含むしきい値を選択します。選択したパーセンテージは、すべてのセクションに適用されます。
   10. よく指向された暗号、すなわち、無傷の組織からの完全な暗号を選択し、その周りの領域をマークする自由な手の選択ツールを選択します。
   11. しきい値領域を測定するには、[分析]タブを選択し、その後に[パーティクルの分析]を選択します。[パーティクルの分析]ウィンドウで[サイズ]を20-無限に設定し、ボックスピクセル単位をクリックし、[円]を 0.00−1.00に設定し、[アウトラインに表示]を設定します。[結果の表示]、[集計]、および[穴の含め]をクリックします。
       注: BrdU 陽性セルの値は結果ウィンドウで自動的に生成され、各 BrdU 陽性セルの個々の測定値が表示されます。さらに、要約ウィンドウが自動的に生成され、カウント数、総面積、平均サイズ、BrdU陽性セルを持つ面積のパーセンテージが表示されます。
   12. 手順 5.4.10 と 5.4.11 を繰り返して、新しい暗号を測定します。測定されたすべての暗号の結果が[サマリー]ウィンドウに表示されます。

結果

最初の実験では、0日目にマウスに粘膜炎を誘導し、毎日5日間連続してマウス群を犠牲にした。SI重量を測定すると、このパラメータが2日目から4日目まで減少し、腸球塊の損失を示唆していることがわかりました。また、5日目にSI重量が0日目(未処理マウス)と有意に異ならないことがわかった(図1)。BrdUの組み込みによって測定された増殖は、1?...

ディスカッション

ここでは、マウスモデルにおけるSI損傷および再生を研究するための広くアクセス可能な方法を示す。腸損傷の多種多様な前臨床動物モデルが存在しますが、各モデルがユニークであり、エンドポイントが研究の質問に答えるのに適切でなければならないことを理解することが重要です。このモデルは、傷害に対する適応応答を研究するのに優れていますが、粘膜炎の前臨床モデルとしてモ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/