Endpoint importanti e marcatori proliferativi per valutare piccole lesioni intestinali e adattamento utilizzando un modello murino di mucosite indotta dalla chemioterapia

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire importanti endpoint e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucotisi indotta dalla chemioterapia. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare e usando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l'altezza del villus come endpoint.

Abstract

L'adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l'intestino viene perso a causa di un trauma. Le risposte adattive, come la proliferazione delle cellule della cripta e l'aumento dell'assorbimento dei nutrienti, sono fondamentali nel recupero, ma poco comprese. Comprendere il meccanismo molecolare alla base delle risposte adattive è fondamentale per facilitare l'identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l'adattamento. Diversi approcci e modelli sono stati descritti in tutta la letteratura, ma è necessario un modo descrittivo dettagliato per eseguire essenzialmente le procedure per ottenere dati riproducibili. Qui, descriviamo un metodo per stimare endpoint importanti e marcatori proliferativi di piccole lesioni intestinali e iperproliferazione compensativa utilizzando un modello di mucosite indotta dalla chemioterapia nei topi. Dimostriamo il rilevamento di cellule che proliferano usando un marcatore specifico del ciclo cellulare, così come utilizzando un piccolo peso intestinale, la profondità della cripta e l'altezza del villus come endpoint. Alcuni dei passaggi critici all'interno del metodo descritto sono la rimozione e la pesatura dell'intestino tenue e il sistema software piuttosto complesso suggerito per la misurazione di questa tecnica. Questi metodi hanno i vantaggi che non richiedono molto tempo e che sono convenienti e facili da realizzare e misurare.

Introduzione

L'adattamento intestinale è il meccanismo compensativo naturale che si verifica quando l'intestino viene perso a causa di malattia o chirurgia^1,2. Dopo il trauma, l'intestino subisce una risposta adattiva morfometrica e funzionale, caratterizzata da proliferazione delle cellule della cripta e aumento dell'assorbimento dei nutrienti³. Questo passaggio è fondamentale per il ripristino, ma poco compreso. Gli studi sperimentali della risposta adattiva intestinale si sono concentrati sui cambiamenti che si verificano dopo la resezione intestinale in topi, ratti e maiali, ma la comprensione del meccanismo molecolare alla base della risposta adattiva in altri tipi di lesioni (ad esempio, chimica o batterica) è fondamentale per facilitare l'identificazione di sostanze nutritive o farmaci per migliorare l'adattamento. Sperimentalmente, diversi approcci sono stati utilizzati per descrivere il complesso indice molecolare e cellulare di piccole patologie intestinali, tra cui il punteggio istopatologico e la misurazione dell'esito della lesione. Nonostante ciò, ciò che è assente dalla letteratura è una descrizione dettagliata di come eseguire le procedure necessarie per ottenere dati riproducibili. Quando si identificano i fattori coinvolti nell'adattamento, come gli ormoni intestinali, un modello animale facile, a basso costo e riproducibile è garantito e qui suggeriamo l'uso di un modello di mucosite intestinale indotta da chemioterapia (CIM).

Uno degli endpoint più semplici e molto informativi sia della lesione che dell'adattamento è misurare la massa dell'intestino tenue (SI). Sappiamo che un segno distintivo della mucosite è l'apoptosi degli enterociti, l'atrofia del villus dipendente dal tempo e la mitosi ridotta. Pertanto, l'esame della morfologia intestinale è altamente rilevante nei modelli preclinici^4,5. Nell'uomo, un declino dell'agrullllllina al plasma, un marcatore di enterociti funzionanti, correla con punteggi di tossicità e marcatori infiammatori⁶ oltre alla capacità di assorbimento⁷, suggerendo che questo aminoacido è un eccellente biomarcatore di Mucosite. L'inciglia può essere misurata sia nei topi che nei ratti, e ha mostrato eccellenti correlazioni con la lunghezza del villus⁸, la sopravvivenza della cripta⁹e la mucosite indotta da radiazioni¹⁰.

Uno dei principali vantaggi della misurazione dell'agrumile al plasma è la capacità di raccogliere misurazioni ripetute da un animale. Tuttavia, il prelievo di sangue multiplo nei topi è limitato a un volume totale di sangue di 6 l/g/settimana e richiede l'anestesia generale. Questo purtroppo limita anche l'uso delle misurazioni dell'agruminellina nei topi. Inoltre, la misurazione dell'acitrulllo richiede cromatografia liquida ad alte prestazioni^11,12, che è costosa e richiede molto tempo. Recentemente, abbiamo dimostrato che i livelli di agruminellline nei topi sono significativamente correlati al peso DI SI (p < 0,001) (dati inediti), rendendo l'agrumilluna una misurazione diretta che riflette la massa enterocitica. Una limitazione alla misurazione del peso SI è la necessità di sacrificare i topi e quindi non sono possibili misurazioni ripetute all'interno dello stesso mouse. Tuttavia, il metodo offre la possibilità di eseguire una serie di altre analisi tissutali dirette alla questione della ricerca, e questi fatti possono plausibilmente compensare l'uso aggiuntivo degli animali. Suggeriamo quindi di utilizzare il peso SI come un biomarcatore facile, a basso costo e veloce di lesioni e adattamento nei topi. Per garantire la riproducibilità e la variazione analitica accettabile, l'intestino deve essere accuratamente rimosso dall'animale, lavato con salina, svuotato e asciugato prima della pesata. In questo articolo viene illustrato esattamente come viene eseguita questa procedura.

Un altro segno distintivo della mucosite è la perdita delle cellule proliferanti nelle cripte e un'iperproliferazione compensativa durante il periodo rigenerativo³. Il marcatore cellulare Ki67 è stato spesso utilizzato per determinare le cellule proliferali veloci per mezzo di immunostachimica¹³. Anche se Ki67 è un semplice marcatore di proliferazione, ha una tendenza all'imprecisione poiché Ki67 è presente durante tutte le fasi attive del ciclo cellulare (G1, S, G2 e M)¹⁴. L'etichettatura specifica è essenziale per rilevare le cellule replicanti, motivo per cui suggeriamo l'incorporazione in situ di 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU), un analogo sintetico della tiofina, in quanto è in gran parte limitato alla replica delle cellule nella fase S¹⁵. BrdU viene iniettato negli animali 150 minuti prima del sacrificio e le cellule possono essere successivamente rilevate con immunohistochimica utilizzando anticorpi specifici BrdU. In questo articolo di metodo, mostriamo esattamente come misurare l'area delle cellule immunopositive BrdU all'interno di una cripta utilizzando un software di immagine libera.

I cambiamenti morfologici e funzionali sono spesso studiati in modelli di mucosite indotta da 5-FU, dove l'adattamento intestinale viene valutato dall'altezza del villus e dalla profondità della cripta. Durante questo studio, abbiamo scoperto che durante la fase acuta della mucosite, che è uguale alla fase di lesione, la proliferazione misurata dall'incorporazione di BrdU non è correlata alla profondità della cripta. In contrasto con questo, la profondità della cripta è significativamente correlata con la proliferazione osservata nella fase di riparazione della mucosite, da 3 a 5 giorni dopo l'induzione. Ciò suggerisce che la fase acuta della mucosa non è misurabile solo per profondità della cripta. Suggeriamo che quando si utilizza la proliferazione come endpoint nella fase acuta dei topi mucositi, l'incorporazione di BrdU dovrebbe essere usata preferibilmente, ma quando si quantifica l'iperproliferazione nella fase successiva durante la fase rigenerativa, la profondità della cripta è un ragionevole alternativa all'incorporazione di BrdU. L'obiettivo di questo studio è stato quello di descrivere questo modello in modo che possa essere utilizzato da tutti i ricercatori, sia nel campo dell'oncologia, ma soprattutto i ricercatori non hanno familiarità con i modelli di lesioni intestinali.

Il modello descritto può essere utilizzato per fenotipo modelli transgenici in base alla risposta adattiva utilizzando peso corporeo, peso SI e profondità della cripta come endpoint. Ad esempio, mostriamo qui come abbiamo usato il modello di 5-fluorouracil (5-FU) indotto mucosite in un modello di knock out cellulare con insufficiente secrezione L-cell¹⁶. Peptide-1 glucagon-like (GLP-1) e peptide-2 glucagon-like (GLP-2) sono ormoni intestinali co-secreted dalle cellule L enteroendocrine in risposta all'assunzione di cibo^17,18. GLP-2 è riconosciuto come un fattore importante per la guarigione intestinale, la regolazione dell'apoptosi mucosale e il miglioramento della funzione di barriera della funzione di barriera del SI^19,20,21,22. Sulla base della letteratura, abbiamo ipotizzato che gli ormoni endogeni siano essenziali per l'iperproliferazione compensativa che si verifica nella risposta adattiva dopo l'infortunio.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati condotti in conformità con gli orientamenti della legislazione danese che disciplinano la sperimentazione animale (1987). Gli studi sono stati condotti con il permesso del Danish Animal Experiments Inspectorate (2013-15-2934-00833) e del comitato etico locale.

NOTA: Sono stati ottenuti topi femminili C57BL/6J (20-25 g) e alloggiati otto per gabbia in standard 12 h light, 12 h dark cycle con libero accesso all'acqua e al chow standard. Gli animali sono stati lasciati ad acclimatarsi per una settimana prima dell'inizio degli esperimenti.

1. Induzione della mucosite con 5 fluorouracil

1. Ottenere 5-fluorouracil (5-FU) in una soluzione 50 mg/mL.
2. Pesare e registrare il peso corporeo dei topi. Dal peso corporeo, calcolare la quantità di 5-FU per l'iniezione (ad esempio, 400 mg/kg).
3. Preparare una siringa da 1 mL collegata a un ago da 27 G x 30 mm e riempire la siringa con la quantità calcolata di 5-FU per l'iniezione.
4. Filtrare il mouse con il metodo scruff. Per fare questo, afferrare la base della coda con una mano e posizionarla su una superficie di presa di piedi, come un coperchio della barra di filo. Mentre si posiziona la coda con una mano, tenere la forsa del collo con l'altra mano.
5. Posizionare saldamente il corpo del mouse su una mano estendendo l'indice e il pollice indietro il più possibile. Posizionare la coda tra le dita di questa stessa mano per fissare il mouse.
6. Pur mantenendo il mouse in una presa ferma ma delicata, esporre il lato ventrale del mouse e inserire l'ago nella cavità intraperitoneale sul quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome. Aspirare per garantire una corretta collocazione e iniettare il 400 mg/kg 5-FU.

2. Collezione di tessuti

1. Anestesizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina/xylazina (100/10 mg/kg) diluita in soluzione salina (0,9% NaCl). Monitorare la profondità dell'anestesia osservando il riflesso di ritiro del pizzico.
   NOTA: L'anestesia è un'anestesia non di recupero.
2. Registrare il peso del mouse anestesizzato.
3. Posizionare il topo in una posizione supina ed eseguire una laparotomia per esporre la cavità addominale, seguita da un'incisione della cavità toracica per introdurre lo pneumotorace.
4. Usando le forbici, sacrifica l'animale tagliando aprire il diaframma.
5. Rimuovere l'intestino tenue. Tagliare superiore al piloro, ritrarre con attenzione l'intestino tenue lontano dalla carcassa fino a raggiungere il cecum e fare un taglio appena prima del cecum.
6. Usando le pinze, bloccare delicatamente il lume prossimale. Utilizzando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G attaccato, lavare l'intestino tenue con la salina per rimuovere le feci.
7. Rimuovere delicatamente la salina dal lume intestinale con strumenti chirurgici.
8. Posizionare l'intestino tenue su carta pulita per rimuovere con attenzione l'eccesso di salina.
9. Registrare il peso del tessuto lavato.
10. Calcolare il piccolo peso intestinale arrossato come percentuale del peso corporeo.

3. Istologia dell'intestino tenue

1. Preparazione dei tessuti
   1. In un cofano fumatore, utilizzare le forbici per tagliare 3 cm sezioni del tessuto intestinale arrossato da ogni topo dal duodenum, jejunum e ileum e fissare le sezioni in 10% formalina per 24 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Il volume fissativo deve essere di 5-10 volte del volume del tessuto.
   2. Trasferire il tessuto fisso in una tagliere.
   3. Utilizzando un bisturi, tagliare il tessuto a circa 1 cm e trasferirlo in una cassetta di incorporamento.
      NOTA: La cassetta deve essere etichettata con l'identificazione del campione (ID) a matita.
   4. Sommerse la cassetta nel 70% di etanolo e conservatela a 4 gradi centigradi fino a un'ulteriore elaborazione.
2. Incorporamento di tessuti in paraffina
   1. Disidratare il tessuto mettendo in soluzioni alcoliche ascendenti. Posizionare la cassetta nel 70% di etanolo per 1 h, seguita da 80% etanolo per 1 h, 95% etanolo per 1 h e 100% etanolo per 1,5 h. Trasferire la cassetta dal 100% di etanolo a xilene per 1,5 h.
   2. Immergi la cassetta con cera di paraffina riscaldata tra i 58 e i 60 gradi centigradi. Utilizzare pinze per posizionare il tessuto in un orientamento trasversale e lasciare i blocchi raffreddare più di 24 h fino a quando solido.
3. Taglio dei tessuti con un microtoma
   1. Posizionare il blocco, tessuto a faccia in giù sul ghiaccio per 5 min.
   2. Tagliare le sezioni trasversali del blocco di tessuto tra i 3 e 5 m, facendo sezioni trasversali del duodenum, del jejunum e dell'ileo.
   3. Collocare il nastro di paraffina in un bagno d'acqua situato tra i 40 e i 45 gradi centigradi. Utilizzare le pinze per separare le sezioni.
   4. Utilizzare vetrini al microscopio per raccogliere le sezioni dall'acqua.
   5. Asciugare all'aria i vetrini per 30 min prima di colorare.
      NOTA: Per la conservazione per un periodo di tempo più lungo, conservare i vetrini in frigorifero.
4. Macchie ematossilina-eosin del tessuto
   1. Posizionare i vetrini del microscopio in una culla istologica. Depararizzare i vetrini in un armadio riscaldante fissato a 60 gradi centigradi per 60 min.
      NOTA: I vetrini direttamente dal frigorifero devono essere lasciati per raggiungere la temperatura ambiente prima di metterli in un armadio di riscaldamento.
   2. Nel cofano dei fumi, reidratare il tessuto in 3 cambi di un agente di compensazione (Tabella dei materiali), fare 20 tuffi nel primo vaso agente di compensazione e poi lasciarli riposare per 7-8 min in ciascuno dei due barattoli di clearing agent aggiuntivi. Trasferire le diapositive a soluzioni alcoliche decrescenti, iniziare con 3 cambi del 99% di etanolo, seguiti da 2 cambi del 96% di etanolo e del 70% di etanolo. Fai un minimo di 20 tuffi in ogni barattolo. Trasferire in acqua corrente e lasciare riposare i vetrini per 5 min.
   3. Immergere le diapositive nell'ematossitale di Meyer filtrato per 1 min.
   4. Lavare i campioni in acqua corrente del rubinetto per 5 min.
   5. Immergete le sezioni nella macchia di eosina per un minimo di 1/2, quindi risciacquatevi nell'acqua del rubinetto.
   6. Disidratare il tessuto mettendo in soluzioni alcoliche ascendenti. Inizia con il 70% di etanolo, seguito da 96% etanolo, 96% etanolo e 4 volte 99% di etanolo. Fare un minimo di 20 tuffi in ogni barattolo, e lasciare che la culla stare in 99% etanolo fino a quando non sono montati.
   7. Montare i copricopro applicando una piccola quantità del supporto di montaggio alla superficie dei vetrini. Posizionare il coperchio sopra il supporto di montaggio senza creare bolle sotto la coverslip. Lasciare asciugare per 24 ore.
   8. Esaminare il tessuto utilizzando un microscopio luminoso collegato a una fotocamera per ottenere foto istologiche. Utilizzare un obiettivo 10x per scattare istantanee fino a raggiungere una copertura completa della diapositiva di tessuto.

4. Misurazione della profondità della cripta e/o dell'altezza della villus

1. Scaricare e installare il software di analisi (ad es., zen Lite, Tabella dei materiali).
2. Aprire l'immagine nel software e connettersi alla fotocamera. Scatta istantanee in modalità fotocamera con obiettivo 20x.
3. In modalità di elaborazione, aprire lo snapshot.
4. Per misurare la profondità della cripta: nella vista 2D,selezionare lo strumento linea dalla scheda grafica. Scegliere una cripta ben orientata e iniziare la linea nella parte inferiore di un villus e finire nella parte inferiore della cripta. Ripetere questa azione per 20 cripte ben orientate (Figura supplementare 1).
5. Per misurare l'altezza del villus: nella vista 2D, selezionare lo strumento linea dalla scheda grafica. Scegliere un villus ben orientato e iniziare la linea alla fine della proiezione luminale e terminare all'inizio della cripta. Ripetere questa azione per 20 villi ben orientati (Figura supplementare 1).
6. Passare dalla vista 2D alla vista Misura per visualizzare le misure.
7. Esportare le misurazioni e calcolare la media della profondità della cripta e dell'altezza del villus.

5. Quantificazione BrdU (proliferazione) mediante immunohistochimica

1. Iniezione della soluzione BrdU
   1. Pesare e registrare il peso corporeo dei topi.
   2. In un cofa fumato, preparare una quantità rappresentativa di 0,5% w/v bromodeoxyuridina (BrdU) soluzione in fosfato buffered salina (PBS).
   3. Nel cofano del fume, iniettare 50 mg/kg di BrdU mediante iniezione intraperitoneale.
      NOTA: Per garantire che ogni topo sia eutanasia esattamente a 150 min di iniezione post BrdU, iniettare ogni singolo topo in successione con un intervallo di 10-20 min in mezzo per eseguire correttamente la raccolta dei tessuti.
   4. Registrare il tempo di iniezione.
   5. Attendere 150 min, quindi anetizzare i topi e raccogliere il tessuto come descritto nei passaggi 2.1.2.7. Eseguire l'immunohistochimica BrdU come descritto nella sezione 5.2.
2. immunohistochimica BrdU
   1. Preparare il tessuto come descritto nei passaggi 3.1.1.3.3.4.
   2. Per il recupero dell'antigene, posizionare una culla di scorrimento con le sezioni in un barattolo di istologia di vetro e riempirla con il tampone EDTA (pH 9) in un forno a microonde per 1 min a 750 W seguito da 9 min a 350 W. Ciclo di ripetizione.
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si asciughi, il che potrebbe richiedere l'aggiunta di più tamponamenti ai barattoli tra il riscaldamento.
   3. Lavare le sezioni 2 x 3 volte nel buffer salina tris e nel buffer a polysorbate 20 (TBS-T) per 3 min ciascuna.
   4. Applicare 5 gocce di blocco di perossido (Tabella dei materiali) per 10,15 min a temperatura ambiente per bloccare l'attività endogena perossidasi. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
   5. Applicare 5 gocce di buffer di blocchi di roditori (Tabella dei materiali) per 30 min a temperatura ambiente, per bloccare il legame non specifico. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
   6. Incubare le sezioni con un anticorpo monoclonale anti-BrdU diluito 1:500 per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 2/3 volte nel buffer TBS-T per 3 min ciascuna.
   7. Visualizza l'immunopositività usando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) applicando 5 gocce di perossidasi di rafano a ogni vetrino e incubaperdi per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire le sezioni in un cofano di fumi, aggiungere 150 -L di DAB e incubare per 5 min.
      NOTA: Indossare sempre i guanti durante la manipolazione del DAB e smaltire i rifiuti in modo appropriato.
   8. Risciacquare le sezioni in acqua deionizzata.
   9. Disidratare il tessuto e montare un coperchio come descritto nei passaggi 3.4.6 e 3.4.7.
3. Visualizzazione delle immunoreazioni
   1. Visualizza il campione di tessuto con un microscopio luminoso collegato a una telecamera.
   2. Utilizzare il software di analisi per ottenere immagini al microscopio utilizzando un obiettivo 20x di tutte le sezioni e salvare i file nel file . formato JPG.
   3. Scattare un'istantanea di un micrometro di fase utilizzando un obiettivo 20x, che verrà utilizzato come strumento di calibrazione nel software ImageJ.
4. Misurazione dell'area delle cellule immunoreattive BrdU
   1. Installare il software ImageJ (Tabella dei materiali).
   2. Assegnazione della scala a un'immagine in ImageJ: aprire l'immagine del micrometro dello stage utilizzando il file ImageJ Comando di menu Apri. Selezionare lo strumento di selezione lineare.
   3. Selezionare lo strumento diritto e disegnare una linea retta sull'immagine del micrometro per definire una distanza nota.
   4. Selezionate Imposta scala (Set Scale) dal menu Analizza (Analyse).
   5. Immettere un valore nella casella Distanza nota e definire l'unità di lunghezza nella casella Unità di lunghezza. Selezionare Globale in modo che questa calibrazione si applichi a tutte le immagini aperte in questa sessione ImageJ.
   6. Aprire un'immagine di interesse utilizzando il file ImageJ Aprire il comando di menu per misurare l'area delle cellule immunoreattive BrdU per cripta.
   7. Impostare la grafica a colori su 8 bit nel menu Immagine/Tipo.
   8. Aumentare il contrasto dell'immagine in Processo/Migliora contrasto e impostare i pixel saturi su 0,4%.
   9. Applicare una soglia all'immagine per segmentare l'immunopositività. Selezionare Immagine/Regola sotto il menu, quindi soglia e selezionare il colore Rosso (area scura visualizzata in rosso). Scegli una soglia di circa il 10-20% spostando la barra di soglia.
      NOTA: scegliere una soglia che includa tutte le celle positive BrdU con il minor numero possibile di sfondo. La percentuale scelta dovrebbe essere applicata a tutte le sezioni.
   10. Scegli una cripta ben orientata, cioè una cripta completa dal tessuto intatto, e seleziona lo strumento di selezione a mano libera per contrassegnare l'area intorno ad essa.
   11. Per misurare l'area di soglia, selezionare la scheda Analizza, seguita da Analizza particelle. Nella finestra Analizza particella, impostate Dimensione su 20-infinito, fate clic sulla casella unità pixel, impostate Circolarizza su 0,00-1,00e impostate Mostra su Contorni. Fare clic sulle caselle Visualizza risultati, Riepilogae Includi fori.
       NOTA: i valori delle celle brdU positive vengono generati automaticamente in una finestra dei risultati, mostrando le singole misurazioni per ogni cella brdU positiva. Inoltre, viene generata automaticamente una finestra di riepilogo, che mostra il numero di conteggi, l'area totale, le dimensioni medie e la percentuale di area con celle brdU positive.
   12. Ripetere i passaggi 5.4.10 e 5.4.11 per misurare una nuova cripta. I risultati di tutte le cripte misurate verranno visualizzati nella finestra Riepilogo.

Risultati

Nel primo esperimento, abbiamo indotto la mucosite nei topi al giorno 0 e sacrificato un gruppo di topi ogni giorno per 5 giorni consecutivi. Quando si misura il peso SI, abbiamo scoperto che questo parametro è diminuito dal giorno 2 fino al giorno 4 suggerendo una perdita nella massa enterocite. Abbiamo anche scoperto che al giorno 5, il peso SI non era significativamente diverso dal giorno 0 (topi non trattati) (Figura 1). La proliferazione misurata dall'i...

Discussione

Qui, dimostriamo un metodo ampiamente accessibile per studiare le lesioni e la rigenerazione delle SI in un modello murino. Esiste un'ampia varietà di modelli animali preclinici di lesioni intestinali, ma è fondamentale capire che ogni modello è unico e che gli endpoint devono essere appropriati per rispondere alla domanda di ricerca. Questo modello è eccellente per studiare la risposta adattiva alle lesioni, ma gli endpoint devono essere modificati quando si utilizza il modello come modello preclinico della mucosite...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluorouracil	Hospira Nordic AB, Sweden	137853
Ketaminol®Vet	Merck, New Jersey, USA	511485
Rompun®Vet Xylazine	Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany.	148999
10% nautral formalin buffer	Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom	BAF-5000-08A
HistoClear	National Diagnostics, United Kingdom	HS-200
Pertex	HistoLab®, Sweden	840
BrdU	Sigma-Aldrich, Germany.	B5002
Tris/EDTA pH 9 buffer	Thermofisher scientific, Denmark	TA-125-PM4X
Peroxide Block	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Rodent Block buffer	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
Monoclonal mouse anti-BrdU antibody	Thermofisher Scientific, Denmark.	MA1-81890
Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto	Thermofisher Scientific, Denmark.	TA-125-ADQ
Horseradish peroxidase	Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TL-060-QHDM
DAB Quanto Substrate	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
DAB Quanto Chromogen	DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark	TA-125-QHDX
Zen Lite Software (Blue edition)	Carl Zeiss A/S		https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html
ImageJ Software	LOCI, University of Wisconsin		https://imagej.nih.gov/ij/