ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

要約

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。

要約

ヒト多能性幹細胞由来神経前駆細胞(NPC)と2次元培養で分化したニューロンは、疾患メカニズムを探索し、化合物を調知するための高含有スクリーニング(HCS)を行う強力なモデルシステムを表す。ライブラリまたは遺伝子変異現象を同定する。しかし、ヒト細胞ではNPCから機能への移行により、成熟したニューロンは数週間を要する。シナプスは通常、単層培養における3週間の分化後に形成を開始し、いくつかのニューロン特異的タンパク質、例えば後にパンニューロンマーカーNeuNを発現させる、または層5/6大脳皮質ニューロンマーカーCTIP2が発現し始める約4-5週間の分化後。この長い差別化時間は、少量のマルチウェルHCSプラットフォームに使用される最適な培養条件と互換性がありません。多くの課題の中には、細胞クラスタリングを最小限に抑えた均一に分布した細胞の必要性や、長期的な生存率と機能的シナプス成熟を促進する培養手順が必要です。1つのアプローチは、大容量フォーマットでニューロンを区別し、HCS互換マルチウェルで後の時点でそれらを再プレートすることです。このリプラットングアプローチを使用する際のいくつかの主な課題は、樹状および軸線ネットワークのストレスの多い中断のために、再現性と細胞の生存率に関する。ここでは、大容量フォーマットで4~8週間分化した後にヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来のニューロンを酵素的に再中断し、384ウェルマイクロチターに転送するための詳細で信頼性の高い手順を示します。プレート、および優れた細胞生存でさらに1〜3週間それらを培養する。このヒトニューロンの再起は、再めっきから2週間以内にシナプスアセンブリと成熟の研究を可能にするだけでなく、神経質再生と成長コーン特性の研究を可能にします。我々は、384ウェルプラットフォームを用いたニューリトジェネシスおよびシナプトジェネシスに対するスケーラブルなアッセイの例を提供する。

概要

ヒト多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンは、基礎研究、創薬、再生医療の分野でますます重要になってきています。その培養とメンテナンスを最適化し、特定のニューロンサブタイプに対する分化の効率を向上させるワークフローと手順は、急速に進化している^1,2.創薬や標的検証における高含有量の解析に対応するモデルシステムとしてのヒト幹細胞由来ニューロンの有用性と費用対効果を向上させるためには、成熟した機能を生成するために必要な培養時間を短縮することが有用である。最大の堅牢性、再現性、表現型の関連性を維持しながら、ニューロン。3次元オルガノイド培養は神経発達研究3のブレークスルーを推進していますが、2次元単層培養は組織厚が最小限に抑えられるため、自動イメージングベースのアプリケーションと特に互換性があります。

しかし、ヒト神経・神経発達疾患のモデルへの画像化によるスクリーニング方法の適応は大きな課題である。生体内で人間の神経系が成熟する長引く時間枠は、遺伝子発現の自然なプログラムに対応し、神経の成熟を達成するために培養の延長時間を必要とする。

長い神経分化プログラムの実用的な結果の1つは、hiPSC由来単層培養の維持が十分なシナプス成熟を達成するために何週間も持続されなければならないということです。この間、未分化のままの神経前駆子は分裂し続ける。これらはすぐに培養を過剰に成長させ、実行可能なポストマイト性ニューロンを維持するために必要な栄養素含有量を奪うことができます。神経前駆細胞(NPC)を活発に分割すると、増殖基板のニューロンと競合することもできる。これは、このような培養物を、画像ベースのアッセイに不適当な接着性の問題の対象にすることができる。さらに、多くの研究者は、培養量が小さいほど、分化ニューロンの健良な集団を維持する難易度が高く、神経分化の後期段階を観察するのに十分な長さであることがわかります。言い換えれば、高含有スクリーニング(HCS)アプローチを用いてシナプス成熟のアッセイは、ヒト由来ニューロンにとって非常に困難であり得る。

これらの問題のいくつかを回避するために、以前に分化されたhiPSC由来ニューロンを再中断および再め換えする手順が用いられた。第一に、それは完全にコミットされたニューロンの集団における神経伝達の成長(または、より正確には、神経伝達の再生)の研究を可能にする。第二に、以前に分化されたニューロンを大容量フォーマット(10cmプレート以上など)から小容量フォーマット(HCS互換96または384ウェルマイクロチタープレートなど)に再め合わせることで、総培養時間を大幅に短縮できます。小さなボリューム条件。これは、インビトロでのその後の数週間にわたってシナプスアセンブリと成熟の研究を容易にします。

しかし、すでに長いニューライトと複雑な接続ネットワークを確立している成熟したニューロンの再め換えは、いくつかの課題を提示し、そのうちの1つは、時には高く、可変的な細胞死率である。ここでは、優れた細胞生存率および再現性をもたらす再めっき手順について説明する。一般的に、ニューロンは、トリキュレーションの前に基板から細胞を切り離すために、短いインキュベーション期間(通常〜3〜10分)のプロテオ分解酵素に曝露されます。この短いプロテオシス時間は、非神経細胞および未分化前駆体4、5、6を含む多くのタイプの分裂細胞を再中断および通過するために慣例的に使用される。しかし、長く相互接続された神経突起を持つ分化ニューロンのためには、細胞を基板から切り離すだけでなく、損傷を最小限に抑えながら個々の細胞を分離するために樹状および軸網を破壊することが不可欠です。実際、ニューロンの厚いメッシュワークは、通常、個々の細胞としてではなく、単一のシートとして基板から切り離される傾向があります。神経突起の厚いネットワークを緩めるために注意を払わなければ、ニューロンはトリチュレーション中に不可逆的に損傷を受けるだけでなく、それらの多くは、塊を除去するために使用されるフィルタを通過できず、細胞収率が悪くなります。以下では、これらの困難に対抗するために広く使用されているプロテアーゼインキュベーション手順に対する簡単な改変について説明する。

以下に説明するプロトコルでは、ニューロンは、プロテオ溶解酵素(例えば、アキュターゼ)などの軽度のプロテアーゼを用いて40〜45分間インキュベートされる。酵素を添加した後の最初の5〜10分の間に、ニューロンネットワークはシートとして基板から離陸する。プロテアーゼを用いたインキュベーションは、穏やかなトリタースとフィルタリングを進める前に、さらに30〜40分間進行します。この余分なインキュベーション時間は、材料の消化が細胞間ネットワークを緩和し、それによって後続のトリチュレーションが個々の細胞の懸濁液を生成することを保証するのに役立ちます。この手順は、細胞死を最小限に抑えながら再めっき時の細胞分布の均一性を最大化する。このリプラット法は、様々な分化プロトコル7、8、および様々なヒトCCから生成されたhiPSC由来のニューロン培養に応用することに成功しました。この手順は、名目上、幹細胞由来ニューロンのほとんどまたはすべての行での使用に適しています。我々は、拡張プロテアーゼインキュベーション時間が小さなフォーマットプレート(例えば、直径35ミリメートル)から培養物を再め換えに絶対に不可欠ではないことを観察しました。しかし、ここで示すように、大口径プレート(直径10cm以上)から再メッキする場合、おそらくそのようなプレート内のニューライトは非常に長いプロセスを拡張し、密に相互接続されたアレイを形成することができるため、大きな利点を提供します。

ここでは、この方法をデモンストレーションし、早期のニュー泌形成およびシナプス成熟のためのアッセイにおけるその応用を簡単に説明します。シナプスサイトでのコローカリゼーション。例では、このプロトコルが細胞の生存率と再現性を維持する上で提供する利点を強調しています。まず、研究者がヒトの新生の初期のステップを研究することを可能にする。実験設定は、げっ歯類皮質または海馬ニューロンの一次培養物に似ており、細胞は後期胎児または出生後の脳から抽出され、穏やかなプロテアーゼ治療後のトリチュレーションによって解離され、ニューライトを開始するか、手順9、10で切断されたニューライトを再生する。このようなげっ歯類の一次ニューロンと同様に、hiPSC由来のニューロンは、再形成後数時間以内にニューライトを形成または再生し始め、より少ない高い時空間イメージングに最適な環境で成長コーンおよびニューライト形態のイメージングを可能にする。周囲の未分化細胞。ニューロンが最初に前駆体集団から分化し始めたときに見られる可変遅延と異なる成長速度と比較して、神経突起の成長がより同期していることを観察しました。さらに、再めっきは、皮質層5/6転写因子CTIP2(チキンオブアルブミン上流プロモーター転写)などの神経発達の後半に現れるニューロンサブタイプマーカーを発現するニューロンのアッセイを可能にする。因子相互作用タンパク質2)、またはパンニューロンマーカーNeuN^11.リメッキアプローチの特に有用な特徴は、HCSと互換性のある時間枠内でシナプトジェネシスが進行することです。

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プロトコル

1. 再平言前の差別化期間

1. 10cm皿上のニューロンを区別し、選択7、8のプロトコルを使用して、ニューロンがプロセスとの厚いネットワークを形成し、MAP2やTuJ1などの初期のニューロンマーカーだけでなく、NeuNなどの後期マーカーを発現します。
2. ニューロン分化プロセス中に4日ごとに選択の半分の媒体を変更します。
   注:より広範なまたは頻繁な媒体の変化は、本質的な栄養因子を希釈し、成熟を好ましくない可能性があります。
   1. iPSC由来WT126ニューロンについては、 次の分化後培養培地を使用する:5 mL 100x N2サプリメント、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、1 μg/mLラミニン、200 μMアスコルビン酸、1 μMジブティリル-cAMPおよび10mL SM1 500 mL Duls栄養混合物F-12(DMEM/F12)。徐々に、 ハーフメディアの変更を使用して、 神経基底媒体 (材料の表)と同じサプリメントに置き換えます。
   2. iPSC由来CVB WTニューロンの場合は、次の分化後培養培地:500mL神経基底A培地(材料表)と500mL DMEM/F12培地(2μg/mLラミニン、10mLグルタミンサプリメント(材料表)0.75 mg/mL重炭酸ナトリウム、5mL最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸、0.2 mMアスコルビン酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50x B27、および10mL 100x N2サプリメント。

2. マルチウェルのコーティング

1. 塗り直しの前日、ポリL-オルニチン(PLO)でコートする。無菌水にPLOを溶解し、ストック溶液(10mg/mL)を作ります。この在庫は-20 °Cで保管してください。プラスチックをコーティングする場合は、水中にPLO 1:100を希釈し、ガラスをコーティングする場合は50 μg/mL、プラスチックをコーティングする場合は1:1,000比(10μg/mL)の濃度を得ます。
2. コーティングをターゲットプレートに直接塗布します。プレートサイズに適したコーティングの体積を使用します(すなわち、24ウェルプレートの場合は、ウェルあたり500μLのPLO溶液を適用します)。
3. プレートが室温で一晩暗闇の中に座るようにします。
4. 塗り替えの日にコーティングされた版を取り出し、無菌のバイオセーフティキャビネットに移す。
5. PLO溶液を吸引し、滅菌水で2回すすいでください。
6. リン酸緩衝生理食べ物(PBS)中の希釈ラミニン(1.15mg/mL)を1:400希釈。
   注:4 °Cでラミニンを解凍し、すぐにラミニンと不均一なコーティングの凝集を避けるためにPBSに追加します。
7. 滅菌水を吸引し、以前にPLOでコーティングされた井戸にラミニンコーティングの500 μLを適用します。
8. 最低でも4~6時間の37°Cインキュベーターにプレートを置き、ガラス表面に対して最大16時間の長いインキュベーションを使用します。一貫したインキュベーション時間を使用します。

3. 分化ニューロンの再めっき

1. 一度穏やかにPBSで分化ニューロンのリンスプレート。PBSをプレートの壁に静かに分散させ、細胞に直接分散させず、それらを破壊しないようにします。
2. PBSをそっと吸引し、細胞に直接触れないように注意するが、研究者に向かって傾けながら皿の端から吸引する。
3. 10cmプレート当たり、プロテオ溶解酵素(材料表)の少なくとも1mLを塗布し、細胞をインキュベーターに戻します。組織培養室が低湿度による高い蒸発速度を示す場合は、わずかに高いボリュームを追加します。
4. プレートから切り離し、ニューロンネットワーク内の他のニューロンから切り離すために、40〜45分間プロテオ分解酵素を用いて細胞をインキュベートする。
   注:このステップのタイミングは重要です。プロテアーゼを早期に消光すると、再めっき後の細胞死が増加する可能性があります。プロテオ溶解酵素メーカーは、37 °Cよりもはるかに低い温度を、通過細胞株(例えば、4°Cで一晩)のためのより長いインキュベーション期間で使用することをお勧めします。しかし、4°Cでのニューロンの取り扱いは、しばしば冷たい暴露後の生存率が悪いことが多いため、避けるべきである。製造業者はまた、37°Cの酵素との60分のインキュベーションは、その酵素的な不活性化につながると述べています。しかし、著者の経験では、37°CでのhiPSC由来の神経培養の40-45分のインキュベーションは、再形成時の効率的な解離と優れたニューロン生存率のために十分である。
5. インキュベーション期間中に位相コントラスト顕微鏡上のニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に切り離され、プレートの下でプレートを短時間振ると小さなシートで分解し始めるまでプロテアーゼ治療を続けることを可能にします。顕微鏡。
6. 消化を止めるために10cmプレートでプロテアーゼの1mLあたり5mLの新鮮なDMEM培地を用いてプロテアーゼ活性をクエンチする。血清ピペットを使用して、ネットワークを破壊するためにプレートに対して細胞を5〜8回穏やかにトリチュレートします。分化ニューロンは壊れやすいので、トリチュレーション時にあまりにも多くの圧力を加えないように注意してください。端が鋭すぎて狭すぎるため、P1000チップを使用しないでください。
7. 100 μm の直径メッシュを持つセル ストレーナーを介してセルと溶液を適用し、ドロップによって新鮮な 50 mL 円錐チューブドロップします。
8. 細胞が濾過した後、新鮮なDMEM媒体の追加の5 mLでストレーナーをすすいでいます。
9. ベンチトップ遠心分離機のスピンセルを1,000 x gで5分間使用します。
10. 円錐形のチューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどのメディアを吸引し、細胞が水分を保持するように約250 μLを残します。
11. 新鮮なDMEM培養剤の2mLで細胞を穏やかに再中断する。ペレットをチューブの側面に対してピペットにしないでください。代わりに、円錐形の2〜3回を穏やかに反転し、それらを取り除くために5 mLの血清ピペの端を通して細胞を通過します。
12. 再懸濁ニューロンの10 μLをヘモサイトメーターの端に適用します。
13. この懸濁ステップ中に細胞の生存率を評価するために、細胞の液滴に8-10 μLのトリパンブルーを追加します。この混合物の10 μLをヘモサイトメーターまたは他の自動セルカウンタに適用します。位相明るい細胞を生存可能と評価し、トリパン青色染料を除外する。
14. 生存細胞/mLの量を決定し、所望の細胞密度に応じて円錐管の内容物を希釈する準備をする。
15. 384ウェルプレートのウェルあたりプレート〜10,000細胞;24ウェルプレート用にウェル当たり約150,000-200,000細胞をプレート。
16. 適切な希釈を達成し、特定の細胞株の要件に応じて、B27やBDNFなどの追加の適切なサプリメントを追加するために、再懸濁細胞の円錐管に新鮮なDMEMを追加します。
17. 円錐形のチューブをそっと傾けて2~3回混ぜます。
18. 24ウェルプレートから、または16チャンネルのピペを使用して384ウェルマルチウェルプレートからラミニンコーティングを吸引し、PBSで1回すすいでください。
19. 24ウェルプレートにP1000、または384ウェルプレート用の16チャンネルピペットを使用してPBSを吸引します。
20. 束を避けるために、図8の動きで各井戸にセル溶液を適用します。めっきの均一性は、自動液体処理装置を使用して最適化することもできます。
    注:再平小後2〜4日を開始する媒体へのラミニンの添加はまた、細胞の均質な分布を維持するのに役立ちます。
21. 各井戸に対して手順 3.19 と 3.20 を繰り返します。
22. プレートを37°Cと5%CO2に設定したインキュベーターに戻します。
23. 2日後、セクション1.2に記載の分化後培養培地を用いて4日ごとに半分の培地の変化を開始する。所望の成熟時間の後、37°Cで3.7%ホルムアルデヒドを使用して培養物を修正し、実験要件に従って細胞を染色する。

4. 細胞生存率アッセイポストリメッキ

1. ストック溶液を簡単に渦動させた後、早期細胞死レポーター(VivaFix:50μL培養培地あたり50μLストック溶液/ウェル当たり0.5μL)を追加します。
2. ガラス底マルチウェルで培養した生細胞および死細胞を20分後、洗浄工程なしで、色素蛍が細胞内で1回だけ蛍がみえるので、または4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)および/または他の抗体で固定および共染色する画像を撮る共焦点顕微鏡を使用して。

5. 免疫染色

1. PBSで3.7%ホルムアルデヒドと120 mMスクロースを37°Cで20分間固定します。
2. 0.2%のトリトンX-100を室温で5分間洗い流し、2%ウシ血清アルブミン(BSA)で30分間ブロックします。
3. ウサギ抗MAP2抗体1:1,000、マウス抗β3チューブリン(TuJ1)抗体1:2,000、鶏抗NeuN抗体(1:100)およびラット抗CTIP2抗体(1:500)、またはマウス(1:500)で室温で1時間のリンプトを行わずにBSAを吸引し、マウスを使用する(1:500)。1:200)、ウサギの抗シナプス1(1:200)およびシナプス染色用ニワトリ抗MAP2抗体。
4. PBSですすし、Alexa Fluor結合二次抗体とDAPIを37°Cで45分間インキュベートします。
5. 最後に、イメージングの前にPBSで2回洗浄します。

6. カルシウムイメージング

1. AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE(サルク生物学研究所、GT3コア施設)で培養細胞に感染し、10日後の再散写後3~4週間で自発的なカルシウム過渡性を評価する画像を用いて、

7. 画像の取得と解析

注:取得システムの詳細については、カラブレス^ら12を参照してください。

1. 手動または自動の画像集録にはイメージングモジュール、および CellProfiler¹³などの画像解析ソフトウェア モジュールを使用して、形態測定を行います。
2. 同じ視野内のニューロン(DAPI + MAP2またはTuJ1陽性細胞)の数で割った視野ごとの総長を測定することにより、TuJ1陽性ニューライトおよびMAP2陽性デンドライトの平均長さを計算します。

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結果

数週間分化されているhiPSC由来ニューロンの再めっきは、いくつかの利点を提供しています.しかし、長く相互接続されたデンドライトと軸ゴン(図1A)を持つ分化ニューロンを切り離して再めあうと、不可逆的に損傷を受けたニューロンの割合が高い可能性があります。

プロトコルセクションで説明したように、我々は基板からニューロ?...

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ディスカッション

我々は、高含有量スクリーニングプラットフォームと互換性のある方法で、生存率、分化の成功、および細胞内イメージングを最適化するヒトニューロン培養の再停止と再平行化のための簡単な手順を実証しました。創薬に関連する他のアッセイ。図 6は、このようなアプリケーションの全体的なワークフローと例を示しています。

ここでは、皮質...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	Add 1 µM
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml final concentration
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Add 20 mL to 1 L N2B27 media
DMEM/F12 with Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL final concentration
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Add 100 µL to 50 mL N2B27
MEM Nonessential Amino Acids	Thermofisher Scientific	11140035	Add 5 mL to 1 L N2B27 media
N2 (100x) Supplement	Life Technologies	17502048	Add 5 mL to 500 mL media
Neurobasal A Media	Thermofisher Scientific	10888022	Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media
Neurobasal Media	Thermofisher Scientific	21103049	for WT126 cells; neural basal media
SM1 Supplement	StemCell Technologies	5711	Add 1:50 to media
Sodium bicarbonate	Thermofisher Scientific	25080-094	Add 10 mL to 1 L N2B27 media
Plate Preparation
10 cm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08772-E	Plastic TC-treated dishes
6-well Tissue Culture Dishes	Thomas Scientific	1194Y80	NEST plates
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Add 1:400 on plastic
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Add 1:1,000 on plastic
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	To dilute Poly-L-Ornithine
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer	Corning	431752	Sterile, individually wrapped
384-well plate, uncoated	PerkinElmer	6007550	Coat with PLO and Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	Dulbecco's phosphate-buffered saline
Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates	PerkinElmer	6057500	Rinse before coating with laminin
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme
Fixation Materials
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-1	Dissolved in PBS
Sucrose	Fisher Scientific	S5-12	0.8 g per 10 mL of fixative
Immunostaining Materials
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse	Invitrogen	A-11001	secondary antibody
Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-11041	secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-21449	secondary antibody
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat	Invitrogen	A-11077	secondary antibody
DAPI	Biotium	40043	visualizes DNA
Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	early stage neuronal marker
Rat antibody against CTIP2	Abcam	ab18465	layer 5/6 cortical neurons
Chicken antibody against MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	early stage neuronal marker
Chicken antibody against NeuN	Millipore	ABN91	late stage neuronal marker
Rabbit antibody against MAP2	Shelley Halpain	N/A	early stage neuronal marker
Mouse antibody against PSD-95	Sigma	P-246	post-synaptic marker
Rabbit antibody against Synapsin 1	Millipore	AB1543	pre-synaptic marker
Bovine serum albumin (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% in PBS for blocking
Titon X-100	Sigma	9002931	Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization
Viability Markers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	cell death marker
Calcium Imaging
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	calcium reporter in a viral delivery system
hiPSC-derived NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	unpublished