Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resumo

Os neurônios diferenciados na cultura bidimensional das células progenitoras neurais pluripotentes humanas (NPCs) representam um poderoso sistema modelo para explorar os mecanismos de doença e realizar a triagem de alto conteúdo (HCS) para interrogar o composto bibliotecas ou identificar fenótipos de mutação genética. Entretanto, com as pilhas humanas a transição do NPC ao neurônio funcional, maduro exige diversas semanas. As sinapses normalmente começam a se formar após 3 semanas de diferenciação na cultura monocamada, e várias proteínas neuronais específicas, por exemplo, o marcador Pan-neuronal mais tarde expressando Neun, ou a camada 5/6 neurônio cortical cerebral marcador CTIP2, começam a expressar cerca de 4-5 semanas após a diferenciação. Este tempo longo da diferenciação pode ser incompatível com as condições ideais da cultura usadas para o volume pequeno, plataformas multi-well do HCS. Entre os muitos desafios estão a necessidade de células bem aderidas e uniformemente distribuídas com o mínimo de aglomeração celular e procedimentos de cultura que promovem a viabilidade a longo prazo e a maturação funcional da sinapse. Uma abordagem é diferenciar os neurônios em um formato de grande volume, em seguida, mas-los em um ponto de tempo posterior em HCS-compatível com vários poços. Alguns dos principais desafios ao usar essa abordagem de resposta referem-se à reprodutibilidade e viabilidade celular, devido ao rompimento estressante da rede dendrítica e axonal. Aqui nós demonstramos um procedimento detalhado e de confiança para a célula de haste pluripotente induzida enzimaticamente ressuscitem os neurônios (hipsc)-derivado humanos após sua diferenciação por 4-8 semanas em um formato Large-volume, transferindo os ao de microtitulação 384-well placas, e cultivando-os para umas 1-3 semanas mais adicionais com sobrevivência excelente da pilha. Esta resposta de neurônios humanos não só permite o estudo do conjunto de sinapse e maturação dentro de duas semanas de repique, mas também permite estudos de regeneração neurite e características do cone de crescimento. Nós fornecemos exemplos de ensaios escalonáveis para neuritogênese e sinaptogênese usando uma plataforma 384-well.

Introdução

Células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)-os neurônios derivados são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de fármacos e medicina regenerativa. Fluxos de trabalho e procedimentos para otimizar sua cultura e manutenção, e melhorar a eficiência da diferenciação em subtipos neuronais específicos, estão evoluindo rapidamente^1,2. Para melhorar a utilidade e a relação custo-eficácia dos neurônios derivados de células-tronco humanas como sistemas modelo que permitem análises de alto conteúdo na descoberta de fármacos e na validação de alvos, é útil diminuir o tempo de cultivo necessário para gerar neurônios, mantendo a máxima robustez, reprodutibilidade e relevância do fenótipo. Embora as culturas organoid 3-dimensionais estejam conduzindo avanços na pesquisa do neurodesenvolvimento³, as culturas do monocamada 2-dimensional são especial compatíveis com as aplicações Imaging-based automatizadas devido a sua espessura mínima do tecido.

No entanto, a adaptação de métodos de triagem baseados em imagem para modelos de doença neurológica e neurodesenvolvimental humana enfrenta um grande desafio. O período prolongado sobre o qual o sistema nervoso humano amadurece in vivo necessita de tempo estendido na cultura para acomodar programas naturais de expressão gênica e alcançar a maturação neuronal.

Uma conseqüência prática do programa longo da diferenciação neuronal é que a manutenção de culturas monocamada hipsc-derivadas deve ser sustentada por muitas semanas para conseguir a maturidade adequada do sinapse. Durante esse tempo, os progenitores neurais que permanecem indiferenciados continuam a se dividir. Estes podem rapidamente overgrow a cultura e usurpar o índice nutriente exigido para manter neurônios células viáveis. A divisão vigorosamente de células progenitoras neurais (NPCs) também pode competir com neurônios para o substrato de crescimento. Isso pode tornar essas culturas sujeitas a problemas de má adesão, uma condição inadequada para ensaios baseados em imagem. Além disso, muitos investigadores acham que quanto menor o volume de cultura, maior a dificuldade em manter populações saudáveis de neurônios diferenciados tempo suficiente para observar os estágios tardios da diferenciação neuronal. Em outras palavras, os ensaios de maturação de sinapse usando abordagens de rastreamento de alto conteúdo (HCS) podem ser muito desafiadores para os neurônios derivados do ser humano.

Para contornar alguns desses problemas, foi utilizado um procedimento de ressuscito e replante de neurônios derivados de hiPSC previamente diferenciados. Em primeiro lugar, permite o estudo do crescimento do neurite (ou, mais precisamente, regeneração de neurite) em uma população de neurônios totalmente comprometidos. Em segundo lugar, a resposta de neurônios previamente diferenciados de um formato de grande volume (como placas de 10 cm ou maior), até formatos de volume pequeno (como placas de de microtitulação 96-ou 384-well compatíveis com HCS) permite uma redução significativa no tempo total de cultivo em a condição de pequeno volume. Isto facilita o estudo do conjunto e da maturação da sinapse sobre semanas subseqüentes in vitro.

No entanto, a resposta de neurônios maduros que já estabeleceram neuritos longos e uma complexa rede de conectividade apresenta vários desafios, um dos quais é a taxa às vezes alta e variável de morte celular. Aqui, nós descrevemos um procedimento de repique que resulte na sobrevivência e na reprodutibilidade excelentes da pilha. Comumente, os neurônios são expostos a enzimas proteolíticas para períodos curtos de incubação (tipicamente ~ 3-10 min), a fim de separar as células do substrato antes da trituração. Este breve tempo de proteólise é habitualmente utilizado para ressuscitar e de muitos tipos de células divisórias, incluindo células não-neuronais e progenitores indiferenciados^4,5,6. No entanto, para neurônios diferenciados que carregam neuritos longos e interligados, é essencial não apenas separar as células do substrato, mas também interromper a rede dendrítica e axonal, a fim de isolar as células individuais, minimizando os danos. Na verdade, uma malha grossa de neurônios geralmente tende a se separar do substrato como uma única folha, em vez de células individuais. Se o cuidado não é tomado para afrouxar a rede grossa de neurites, os neurônios não somente tornam-se irreversivelmente danificados durante o trituration, mas muitos deles não conseguem passar através do filtro usado para remover os grupos, tendo por resultado o rendimento pobre da pilha. Abaixo descrevemos uma simples modificação em um procedimento de incubação de protease amplamente utilizado para contrariar essas dificuldades.

No protocolo descrito abaixo, os neurônios são incubados por 40-45 min com uma protease leve, como a enzima proteolítica (por exemplo, Accutase). Durante o primeiro 5-10 min após a adição da enzima, a rede neuronal levanta-se do substrato como uma folha. A incubação com a protease prossegue por um adicional de 30-40 min antes de prosseguir com trituração e filtração suaves. Este tempo extra da incubação ajuda a assegurar-se de que a digestão do material Relaxe a rede intercelular, assegurando desse modo que o trituration subseqüente produza uma suspensão de pilhas individuais. Este procedimento maximiza a uniformidade da distribuição da pilha em cima de repique ao minimizar a morte da pilha. Nós aplicamos com sucesso este método de repique às culturas neuronal hipsc-derivadas geradas por vários protocolos^7,8 da diferenciação e das várias linhas de hipscs. O procedimento é nominalmente adequado para uso com a maioria ou todas as linhas de neurônios derivados de células-tronco. Observou-se que um tempo prolongado de incubação da protease não é absolutamente essencial para a resposta de culturas de placas de pequeno formato (por exemplo, 35 mm de diâmetro); Entretanto, como nós mostramos aqui, fornece um benefício significativo ao repique das placas do grande diâmetro (por exemplo, diâmetro de 10 cm ou maior), provavelmente porque os neuritos em tais placas podem estender processos muito longos e formar uma disposição densa interconectada.

Aqui nós demonstramos este método e ilustram momentaneamente sua aplicação nos ensaios para o neuritogênese adiantado e para a maturação do sinapse, que envolve o agrupamento de proteínas pre-e pós-sináptica ao longo dos dendritos e dos axônios, seguidos por seu mais atrasado colocalização em sítios sinápticos. Os exemplos destacam as vantagens que este protocolo oferece na preservação da viabilidade celular e reprodutibilidade. Primeiramente, permite que os investigadores estudem etapas adiantadas no neuritogenesis humano. O cenário experimental é semelhante às culturas primárias comumente usadas de neurônios corticais ou hipocampais de roedores, onde as células são extraídas do cérebro pós-natal fetal ou precoce, dissociada pela trituração após tratamento suave da protease, e permitiu Iniciar neuritos ou regenerar neuritos que foram cortados no procedimento^9,10. Semelhante a tais neurônios primários de roedores, neurónios derivados de hiPSC começam a formar ou regenerar seus neuritos dentro de horas após a resposta, permitindo a imagem de cones de crescimento e morfologia neurite em um ambiente ideal para imagens de alta espaciotemporal com menos células não diferenciadas circundantes. Nós observamos que o conseqüência do neurite é mais sincronizado comparado aos atrasos variáveis e às taxas diferentes do conseqüência consideradas quando os neurônios começam primeiramente a diferenciar-se de uma população do progenitor. Além disso, a resposta permite ensaios de neurônios expressando marcadores de subtipo neuronal que tipicamente aparecem mais tarde no desenvolvimento neural, como a camada cortical 5/6 fator de transcrição CTIP2 (frango ovalbumina transcrição promotor upstream fator-interagindo proteína 2), ou o marcador Pan-neuronal NeuN¹¹. Uma característica especialmente útil da abordagem de resposta é que o sinaptogênese prossegue dentro de um período de tempo compatível com HCS.

Protocolo

1. período de diferenciação antes de responder

1. Diferencie os neurônios em pratos de 10 cm, usando um protocolo de escolha^{7,8até que} os neurônios formaram uma rede espessa com seus processos e expressam não apenas marcadores neuronais precoces, como map2 ou TuJ1, mas também marcadores tardios, como Neun.
2. Mude metade do meio de escolha a cada 4 dias durante o processo de diferenciação neuronal.
   Nota: mudanças médias mais extensas ou freqüentes diluem fatores tróficos essenciais e podem desfavorecer a maturação.
   1. Para os neurônios WT126 derivados do iPSC, use os seguintes meios de cultivo pós-diferenciação: 5 mL de suplemento de N2 100x, 10 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF, 1 μg/mL de laminina, 200 μM de ácido ascórbico, 1 μM de dibutyryl-cAMP e 10 mL SM1 para 500 mL de meio/ mistura nutritiva F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, usando meia-mídia muda, substituir com o meio neural basal (tabela de materiais) e os mesmos suplementos.
   2. Para os neurônios CVB WT derivados do iPSC, use o seguinte meio de cultivo pós-diferenciação: 500 mL de meio neural basal A (tabela de materiais) e 500 ml de meio DMEM/F12 com laminina a 2 μg/ml, suplemento de glutamina a 10 ml (tabela de materiais), 0,75 mg/ml de bicarbonato de sódio, 5 ml mínimo essencial médio (MEM) não essenciais aminoácidos, 0,2 mm ácido ascórbico, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27, e 10 ml 100x N2 suplemento.

2. revestimento Multipoços

1. O dia antes de replating, revestimento com poli-L-ornithine (PLO). Dissolver PLO em água estéril para fazer uma solução de estoque (10 mg/mL). Armazene este estoque em-20 ° c. Diluir PLO 1:100 em água para produzir uma concentração de 50 μg/mL quando o revestimento de vidro e 1:1000 relação (10 μg/mL) quando o revestimento de plástico.
2. Aplique o revestimento diretamente nas placas alvo. Use o volume do revestimento apropriado ao tamanho da placa (isto é, para uma placa de 24 poços aplique 500 μL da solução de PLO por o poço).
3. Permita que as placas se sentem no escuro durante a noite na temperatura ambiente.
4. Recupere placas revestidas no dia de repique e de transferência a um armário estéril da Biossegurança.
5. Aspirar a solução PLO e enxaguar duas vezes com água estéril.
6. Diluir a laminina (1,15 mg/mL) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a 1:400 diluição.
   Nota: Descongelar laminina a 4 ° c e adicionar rapidamente a PBS para evitar a agregação de laminina e revestimento irregular.
7. Aspirar água estéril e aplicar 500 μL de revestimento de laminina a poços previamente revestidos com PLO.
8. Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° c por um mínimo de 4-6 h. Use incubações mais longas, até 16 h, para superfícies de vidro. Use tempos de incubação consistentes.

3. replando neurônios diferenciados

1. Enxágüe a placa de neurônios diferenciados com PBS uma vez delicadamente. Disperse PBS suavemente para baixo da parede da placa, e não diretamente sobre as células, para evitar interrompê-los.
2. Gentilmente aspirar PBS, sendo cuidadoso para evitar tocar as células diretamente, mas para aspirar a partir da borda do prato, enquanto derrubá-lo para o pesquisador.
3. Aplique no mínimo 1 mL da enzima proteolítica (tabela de materiais) por placa de 10 cm e células de retorno à incubadora. Adicione volumes ligeiramente mais elevados se a sala da cultura do tecido exibe uma taxa de evaporação elevada devido à baixa umidade.
4. Incubar células com enzima proteolítica para 40-45 min, a fim de destacá-los da placa e desanexá-los de outros neurônios dentro da rede neuronal.
   Nota: O tempo nesta etapa é crítico. Extinguir a protease muito cedo pode levar ao aumento da morte celular após a resposta. O fabricante da enzima proteolítica recomenda que as temperaturas muito inferiores a 37 ° c sejam utilizadas com períodos de incubação mais longos para as linhas celulares de de (por exemplo, durante a noite a 4 ° c). No entanto, os neurônios de manuseio a 4 ° c devem ser evitados, pois muitas vezes mostram a baixa sobrevida após a exposição ao frio. O fabricante igualmente indica que uma incubação de 60 minutos com a enzima em 37 ° c conduz a sua inactivação enzimática. Entretanto, na experiência dos autores, uma incubação de 40-45 minutos de culturas neuronal hiPSC-derivadas em 37 ° c é suficiente para a dissociação eficiente e a sobrevivência neuronal excelente em cima de responder.
5. Verifique os neurônios em um microscópio de contraste de fase durante o tempo de incubação e permitir que o tratamento de protease para continuar até que a rede neural se desconecta completamente da placa e começa a se separar em folhas menores ao agitar brevemente a placa o Microscópio.
6. Saciar a atividade da protease usando 5 mL de mídia DMEM fresca por 1 mL de protease na placa de 10 cm para parar a digestão. Triturar suavemente as células contra a placa 5-8 vezes para interromper a rede, utilizando pipetas serológicas. Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao triturar, pois os neurônios diferenciados são frágeis. Não use uma ponta P1000, como o fim é muito afiada e estreita, e, portanto, pode pura ou danificar os neurônios.
7. Aplique a solução com as pilhas através de um filtro da pilha com engranzamento do diâmetro de 100 μm em uma gota cónica fresca do tubo 50 mL pela gota.
8. Enxague o filtro com um adicional de 5 mL de mídia DMEM fresca, após as células terem sido filtradas.
9. Gire pilhas no centrifugador do de bancada em 1.000 x g por 5 minutos.
10. Retorne o tubo cônico ao gabinete de biossegurança e aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando em torno de 250 μL para garantir que as células retenham a humidade.
11. Reressuscite as células suavemente em 2 mL de mídia DMEM fresca. Não pipeta o pellet contra o lado do tubo. Em vez disso, inverta suavemente cónicos 2-3 vezes e passar as células através do final de um 5 mL de Pipet serológico para desalojar-los.
12. Aplique 10 μL de neurônios ressuscipended na borda de um Hemocytometer.
13. Adicionar 8-10 μL de azul de Tripan a gotículo de células para avaliar a viabilidade celular durante esta etapa de ressuscipensão. Aplique 10 μL desta mistura ao hemocitômetro ou aos outros contadores automáticos da pilha. Avaliar como viável as células que são fase brilhante e excluir o corante azul Tripan.
14. Determine a quantidade de células/mL viáveis, e prepare-se para diluir o conteúdo do tubo cônico de acordo com a densidade da célula desejada.
15. Placa ~ 10.000 células por poço para uma placa de 384 poços; placa ~ 150000-200000 células por poço para uma placa de 24 poços.
16. Adicione o DMEM fresco ao tubo cônico das células reressuscitadas para obter a diluição apropriada e adicione suplementos apropriados adicionais, como B27 e/ou BDNF, dependendo dos requisitos da linha celular específica.
17. Incline suavemente o tubo cônico para misturar 2-3 vezes.
18. Aspire o revestimento do laminina da placa 24-well, ou da placa do de do 384-well usando um Pipet de 16 canais e enxague uma vez com PBS.
19. Aspirar PBS usando um P1000 para a placa de 24 poços, ou a pipeta de 16 canais para placas 384-well.
20. Aplique a solução da pilha a cada poço em um movimento da figura oito para evitar aglomerar. A uniformidade do chapeamento também pode ser otimizada usando dispositivos de manuseio de líquidos automatizados.
    Nota: A adição de laminina para a mídia a partir de 2-4 dias pós-replating também ajuda a manter uma distribuição homogênea das células.
21. Repita as etapas 3,19 e 3,20 para cada poço.
22. Retorne a placa à incubadora ajustada em 37 ° c e em 5% CO₂.
23. Depois de 2 dias, comece a mudar metade do meio a cada 4 dias usando a mídia de cultivo pós-diferenciação descrita na seção 1,2. Após o tempo de maturação desejado, fixar culturas usando 3,7% formaldeído a 37 ° c e células de mancha de acordo com as exigências experimentais.

4. ensaios de viabilidade celular post-replating

1. Adicione o repórter de morte celular precoce (VivaFix: 0,5 μL da solução de estoque de 50 μL por 500 μL de mídia de cultura por poço) depois de rapidamente vortexing a solução de estoque.
2. Imagem as células ao vivo e mortas cultivadas em multipoços de vidro-fundo, após 20 min, sem qualquer etapa de lavagem, uma vez que o corante fluoresce a apenas um dentro das células, ou correção e co-mancha com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/ou outros anticorpos antes de imagem usando um microscópio confocal.

5. imunocoloração

1. Corrija culturas com 3,7% de formaldeído em PBS mais 120 mM de sacarose por 20 min a 37 ° c.
2. Enxague e Permeabilize com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, bloqueie por 30 min com 2% de albumina sérica bovina (BSA).
3. Aspire a BSA sem enxaguar e incubar por 1 h em temperatura ambiente com coelho MAP2 anticorpo 1:1000, mouse anti-β3 tubulina (TuJ1) Anticorpo 1:2000, frango anti-NeuN anticorpo (1:100) e Rat anti-CTIP2 anticorpo (1:500), ou com mouse anti-PSD95 ( 1:200), coelho anti-synapsin 1 (1:200) e frango anti-MAP2 anticorpo para coloração sináptica.
4. Enxague com PBS, e incubar com os anticorpos secundários conjugados de Alexa fluor mais DAPI para 45 min em 37 ° c.
5. Finalmente, lave duas vezes com PBS antes da imagem latente.

6. imagem latente do cálcio

1. Infectar células cultivadas com AAV8-SYN-jGCAMP7f-WPRE (o Instituto Salk de estudos biológicos, GT3 Core Facility) em 10 dias após a reresposta e imagem para avaliar transientes de cálcio espontâneo em 3-4 semanas após a resposta.

7. aquisição e análise de imagens

Nota: Para mais informações sobre o sistema de aquisição, consultar Calabrese et al.¹².

1. Use um módulo de imagem para aquisição manual ou automatizada de imagens e um módulo de software de análise de imagem, como o CellProfiler¹³, para medições morfométricas.
2. Calcule o comprimento médio de TuJ1 positivos e MAP2 dendritos positivos medindo o comprimento total por campo de visão dividido pelo número de neurônios (DAPI + MAP2 ou TuJ1 células positivas) dentro do mesmo campo.

Resultados

A resposta de neurônios derivados de hiPSCs que foram diferenciadas por várias semanas oferece várias vantagens. No entanto, a desanexação e A resposta de neurônios diferenciados que têm dendritos e axônios longos e interligados (Figura 1a) podem resultar em uma fração alta de neurônios irreversivelmente danificados.

Como descrito na seção do protocolo, nós usamos a incubação com uma enzima proteolíticas para separar os neurônios...

Discussão

Nós demonstramos um procedimento reto para a ressuscita e a resposta de culturas neuronal humanas que aperfeiçoa a viabilidade, o sucesso da diferenciação, e a imagem latente subcellular em uma maneira que seja compatível com as plataformas elevadas da seleção satisfeita, e outros ensaios relevantes para a descoberta de fármacos. A Figura 6 ilustra o fluxo de trabalho geral e exemplos de tais aplicativos.

Embora aqui nós nos concentramos em neurônios der...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	Add 1 µM
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml final concentration
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Add 20 mL to 1 L N2B27 media
DMEM/F12 with Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL final concentration
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	Add 100 µL to 50 mL N2B27
MEM Nonessential Amino Acids	Thermofisher Scientific	11140035	Add 5 mL to 1 L N2B27 media
N2 (100x) Supplement	Life Technologies	17502048	Add 5 mL to 500 mL media
Neurobasal A Media	Thermofisher Scientific	10888022	Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media
Neurobasal Media	Thermofisher Scientific	21103049	for WT126 cells; neural basal media
SM1 Supplement	StemCell Technologies	5711	Add 1:50 to media
Sodium bicarbonate	Thermofisher Scientific	25080-094	Add 10 mL to 1 L N2B27 media
Plate Preparation
10 cm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	08772-E	Plastic TC-treated dishes
6-well Tissue Culture Dishes	Thomas Scientific	1194Y80	NEST plates
Mouse Laminin	Life Technologies	23017-015	Add 1:400 on plastic
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	Add 1:1,000 on plastic
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	To dilute Poly-L-Ornithine
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer	Corning	431752	Sterile, individually wrapped
384-well plate, uncoated	PerkinElmer	6007550	Coat with PLO and Laminin
DPBS	Life Technologies	14190144	Dulbecco's phosphate-buffered saline
Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates	PerkinElmer	6057500	Rinse before coating with laminin
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme
Fixation Materials
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F79-1	Dissolved in PBS
Sucrose	Fisher Scientific	S5-12	0.8 g per 10 mL of fixative
Immunostaining Materials
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse	Invitrogen	A-11001	secondary antibody
Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-11041	secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken	Invitrogen	A-21449	secondary antibody
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat	Invitrogen	A-11077	secondary antibody
DAPI	Biotium	40043	visualizes DNA
Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1)	Neuromics	MO15013	early stage neuronal marker
Rat antibody against CTIP2	Abcam	ab18465	layer 5/6 cortical neurons
Chicken antibody against MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	early stage neuronal marker
Chicken antibody against NeuN	Millipore	ABN91	late stage neuronal marker
Rabbit antibody against MAP2	Shelley Halpain	N/A	early stage neuronal marker
Mouse antibody against PSD-95	Sigma	P-246	post-synaptic marker
Rabbit antibody against Synapsin 1	Millipore	AB1543	pre-synaptic marker
Bovine serum albumin (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% in PBS for blocking
Titon X-100	Sigma	9002931	Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization
Viability Markers
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	cell death marker
Calcium Imaging
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	calcium reporter in a viral delivery system
hiPSC-derived NPCs
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	unpublished