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要約

ゼブラフィッシュ胚は、化学化合物の毒性を評価するために使用されます。それらは外部で発達し、化学物質に敏感であり、微妙な形知らずの変化の検出を可能にする。実験は少量の化合物しか必要としないが、これは胚を含むプレートに直接添加され、試験システムを効率的かつ費用対効果の高い方法にする。

要約

ゼブラフィッシュは、疾患および表現型ベースの創薬のために広く使用されている脊椎動物モデル生物である。ゼブラフィッシュは、多くの子孫を生成し、透明な胚と迅速な外部発達を有する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、貴重で少量で入手可能な薬物の毒性の迅速な評価にも使用することができる。本記事では、1〜5日後受精胚を用いて化学化合物の毒性を効率的にスクリーニングする方法について説明する。胚は、化合物の異なる濃度への暴露によって引き起こされる見型学的欠陥を調査するために、立体顕微鏡によって監視されます。化合物の半分最大致死濃度(LC50)も決定される。本研究では、阻害剤化合物の3〜6mgを必要とし、実験全体は、基本的な設備を有する実験室の個人が完了するのに約8〜10時間かかります。現在のプロトコルは、創薬の初期段階で化合物の耐えうない毒性またはオフターゲット効果を識別し、細胞培養または他の動物モデルで見逃される可能性のある微妙な毒性効果を検出するために、任意の化合物をテストするのに適しています。この方法は、手続き上の遅延と薬剤開発のコストを削減します。

概要

医薬品開発は高価なプロセスです。単一の化学化合物が食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認される前に、数千の化合物が10億ドル以上の費用でスクリーニングされます1.前臨床開発の間、この費用の最も大きい部分は動物実験2のために要求される。コストを制限するために、医薬品開発の分野の研究者は、化学化合物3の安全性スクリーニングのための代替モデルを必要とします。したがって、薬剤開発の初期段階では、適切なモデルにおける化合物の安全性および毒性を迅速に評価できる方法を用いることは非常に有益であろう。動物および細胞培養モデルを含む化学化合物の毒性スクリーニングに使用されているいくつかのプロトコルがありますが、検証され、一般的に使用される単一のプロトコルはありません 4,5.ゼブラフィッシュを使用する既存のプロトコルは、長さが異なり、利便性要件6、7、8、9、および、その利便性要件に従って毒性を評価した個々の研究者によって使用されています。10歳,11歳,12.

最近では、ゼブラフィッシュは、胚発生時の化学化合物の毒性の評価のための便利なモデルとして浮上している 6,7.ゼブラフィッシュは、化学化合物13の評価のための多くの内蔵の利点を有する。ゼブラフィッシュメスは、急速にex vivoを開発し、200〜300個の卵のバッチを産むことができるので、大規模な実験でさえ、1週間まで外部摂食を必要とせず、透明である。化合物は、彼らが(化合物の性質に応じて)絨皮を通して拡散することができ、そして孵化後、皮膚、エラおよび幼虫の口を通して、水に直接添加することができる。実験は、胚の小さなサイズのために大量の化学化合物14を必要としない。ゼブラフィッシュ胚の開発は、正常な発達結果を達成するために必要なタンパク質のほとんどを発現する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、潜在的な薬物が発達的に重要なタンパク質またはシグナル伝達分子の機能を妨げることができるかどうかを評価する敏感なモデルである。ゼブラフィッシュの器官は2-5 dpf15の間で機能し、胚発生のこの敏感な期間中に有毒である化合物は、ゼブラフィッシュ幼虫のフェノティピック欠陥を誘発する。これらの型分法の変化は、侵襲的な技術を用いずに単純な顕微鏡を用いて容易に検出することができる11.ゼブラフィッシュ胚は、細胞培養モデル16,17を用いてインビトロ薬物スクリーニングに比べて生物学的複雑性が非常に大きいため、毒物学的研究に広く使用されている。 脊椎動物として、ゼブラフィッシュの遺伝的および生理学的構成はヒトに匹敵し、したがって化学化合物の毒性はゼブラフィッシュとヒト8、18、19の間で類似している。20歳,21歳,22.ゼブラフィッシュは、したがって、化学化合物の毒性および安全性の評価のための創薬の初期段階における貴重なツールである。

本稿では、1~5日間の受精後受精(dpf)ゼブラフィッシュ胚を用いて炭酸アンヒドラーゼ(CA)阻害剤化合物の安全性と毒性を評価するために用いられる方法の詳細な説明を、単一の研究者による。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を異なる濃度の化学阻害剤化合物に暴露し、胚発生時の死亡率および先記異動の変化を研究することを含む。化学化合物への曝露の終わりに、化学物質のLC50用量が決定される。この方法は、個人が1〜5の試験化合物の効率的なスクリーニングを行うことを可能にし、方法を持つ人の経験に応じて約8〜10時間かかります(図1)。化合物の毒性を評価するために必要な各ステップは、図2に概説されています。CA阻害剤の毒性の評価は8日を必要とし、交配ペアの設定を含む(1日目)。繁殖タンクから胚のコレクション, 洗浄し、28.5 °Cインキュベーターに転送 (2 日目);24ウェルプレートのウェルへの胚の分布と希釈されたCA阻害剤化合物の添加(3日目)。幼虫のフェ記視分析および画像化(4~8日目)、およびLC50用量(day8)の決定。 この方法は、迅速かつ効率的であり、少量の化学化合物と実験室の基本的な設備のみを必要とする。

プロトコル

タンペレ大学のゼブラフィッシュコア施設は、国立動物実験委員会(ESAVI/7975/04.10.05/2016)によって認可された設立許可を受けています。ゼブラフィッシュ胚を用いたすべての実験は、東フィンランド州政府、タンペレ地域サービスユニットプロトコル#LSLH-2007-7254/Ym-23の社会保健省に従って行われた。

1. 一晩ゼブラフィッシュ交配タンクのセットアップ

  1. 2-5成人の雄ゼブラフィッシュと3-5大人の雌のゼブラフィッシュを一晩交配タンクに入れます。(繁殖は一晩自動暗いと光サイクルによって午前中に誘発されます)
  2. 2つ以上の化学化合物の毒性を評価するのに十分な胚を得るためにいくつかの十字架を設定します。毒性の評価のために、各濃度は20個の胚23以上を必要とする。
  3. 動物へのストレスを処理しないようにするには、動物が繁殖のために同じ個体を使用する前に2週間休息できるようにします。

2. 化学化合物への曝露のための胚の採取とプレートの準備

  1. 胚を収集し、翌日の正午前に、微細メッシュストレーナーを使用して、E3胚培地[5.0 mM NaCl,0.17 mM KCl,0.33 mM CaCl 2,0.33 mM MgSO4、および0.1%w/vメチレンブルー]を含むペトリ皿に移します。
  2. プラスチック製のパスツールピペット(食品や固形廃棄物など)を使用して破片を除去します。立体顕微鏡下の胚の各バッチを調べて、未受精/死んだ胚(不透明な外観によって識別される)を除去する。
  3. 胚をインキュベーターで28.5 °Cに保ちます。翌朝、立体顕微鏡下で胚を調べ、不健康または死んだ胚を取り除く。また、古いE3培地を新鮮なE3培地に置き換えます。
    注:ゼブラフィッシュ胚は、実験室の条件下で常に28.5 °Cで維持されています。
  4. 胚を覆うのに十分なE3培地を含む24ウェルプレートの各ウェルに1個の胚を慎重に移します。

3. 化学化合物のストック溶液の調製と希釈化合物の井戸への分布

  1. 4°Cに保存した阻害剤化合物を含有するバイアルを取り出す。
    注:化合物の特性に応じて、これらは異なる温度で格納されます。
  2. 化合物の数ミリグラム(mg)を正確に重量を量ることができる分析バランスを使用して化合物を重量を量る。
  3. 化合物の溶解性特性に基づいて、適切な溶媒(例えば、E3水またはジメチルスルホキシド(DMSO))内の各化合物に対して少なくとも250 μL(100mM)のストック溶液を調出す。
    注:上記の手順は、便利な時間に実験開始の前日に行うことができ、4 °Cで保存することができます。
  4. 15 mL遠心管でE3水を使用して、ストック溶液のシリアル希釈(例えば、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM、500 μM)を作ります。
    注:連続希釈の濃度と数は、その毒性レベルに応じて、ある化合物から別の化合物に異なります。
  5. 胚を含む24のウェルプレートから、パストゥールピペットと1 mLピペット(1dpf胚を含む)を使用して井戸からE3水を一列に取り除きます。
  6. 各ウェルに各希釈剤の1 mLを分配し(低くからより高い濃度に移動する)24ウェルプレートのウェルに分配します。
  7. 胚の同じバッチから対照群を設定し、対応する希釈剤量を追加します。
  8. 化合物の名前と濃度を持つ24ウェルプレートにラベルを付け、インキュベーターで28.5 °Cのプレートを保ちます。

4. 立体顕微鏡を用いた胚の型分分析とイメージング

  1. 化学化合物に曝露した後、24時間のパラメータを立体顕微鏡下で調べます。
    1. 死亡率、孵化、心拍、黄身袋の利用、水泳膀胱発達、魚の動き、心膜水腫、および体の形状23などのパラメータに注意してください。
    2. 化合物の各濃度にさらされた幼虫を取り、金属プローブを使用して3%高分子量メチルセルロースを含む小さなペトリ皿に横に置きます。
      注:3%メチルセルロース(高分子)は、顕微鏡検査に必要な向きで魚を埋め込むのに必要な粘性液体です。この液体の魚の向きのために、金属の調査は必要とされる。
    3. カメラに取り付けた立体顕微鏡を使用して画像を撮影します。実験が終わるまで、毎日別々のフォルダに画像を保存します。
    4. オンライン テーブルまたは印刷シートに、毎日テーブルにすべての観測値を入力します。
    5. 化合物が神経毒性である場合、4~5dpf幼虫は、変化した泳ぎパターンを示し、異常な運動パターンを示す幼虫の短い(30~1分)ビデオを捕捉することによって、そのような変化を記録する。
    6. 化学化合物への暴露の5日後、各化学物質の半分の最大致死濃度50(LC50)を計算するために胚の半分が死ぬ濃度に注意してください。
      注:LC50は、胚の50%が化学化合物への曝露の5日の終わりに死ぬ濃度である。化合物23の各濃度の毒性をテストするために、少なくとも20個の胚を使用する。
    7. 適切なプログラムを使用して、すべての濃度の胚の死亡率のための曲線を構築します。

結果

毒性の評価の重要な部分は、単一の実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。最初に、毒性の評価のための化合物を選択し、各化合物についてテストする濃度の数、およびそれに応じて、チャートを作成します(図3)。各化合物に固有の色を使用してサンプルを整理しました(図3)。溶剤耐性マー...

ディスカッション

培養細胞を用いてインビトロ毒性試験は、試験化合物によって誘導される毒性に関する限られた情報を提供する細胞の生存および形態学的研究を検出することができる。ゼブラフィッシュ胚を用いた化学化合物の毒性スクリーニングの利点は、関連するモデル生物における胚発生時の動物全体における化学的に誘発された型分法変化の迅速な検出である。タンパク質コードヒト遺伝子?...

開示事項

潜在的な利益相反は著者によって報告されなかった。

謝辞

この活動は、シグリッド・ジュセリウス財団(SP、MP)、フィンランド文化財団(AA、MH)、フィンランドアカデミー(SP、MP)、オリオン・ファルモス財団(MH)、タンペレ結核財団(SP、MH、MP)、ジェーン・アンド・アトス・エルコ財団(SP、MP)からの助成金によって支援されました。).イタリアとフランスの共同研究者であるスプーラン教授とウィナム教授は、抗結核および抗がん剤開発目的で安全性と毒性評価のための炭酸アンヒドラーゼ阻害剤を提供してくれたことに感謝します。アウリッキ・レムムスとマリアンヌ・クスラフティの技術支援に感謝します。我々はまた、ゼブラフィッシュの繁殖と胚の収集に彼らの助けのためにリーナ・メキネンとハンナリーナ・ピッポに感謝します。私たちは、原稿と洞察力に満ちたコメントの批判的な評価のためにハーラン・バーカーに心から感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

参考文献

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