Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

Resumo

Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.

Resumo

O zebrafish é um organismo modelo vertebrado extensamente usado para a descoberta da doença e do phenotype-baseado da droga. O zebrafish gera muitos descendentes, tem embriões transparentes e desenvolvimento externo rápido. Os embriões de zebrafish podem, conseqüentemente, ser usados igualmente para a avaliação rápida da toxicidade das drogas que são preciosas e disponíveis em quantidades pequenas. No presente artigo, descreve-se um método para a triagem eficiente da toxicidade de compostos químicos utilizando embriões de adubação pós-fertilização de 1-5 dias. Os embriões são monitorados por estereomicroscópio para investigar os defeitos fenotípicos causados pela exposição a diferentes concentrações de compostos. Concentrações letais semimáximas (LC₅₀) dos compostos também são determinadas. O presente estudo exigiu 3-6 mg de um composto inibidor, e todo o experimento leva cerca de 8-10 h para ser completado por um indivíduo em um laboratório com instalações básicas. O protocolo atual é apropriado para testar todo o composto para identificar efeitos tóxicos ou fora-alvo intolerável do composto na fase adiantada da descoberta da droga e para detectar os efeitos tóxicos sutis que podem ser faltado na cultura de pilha ou em outros modelos animais. O método reduz os atrasos processuais e os custos do desenvolvimento de fármacos.

Introdução

O desenvolvimento de drogas é um processo caro. Antes de um único composto químico é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA) vários milhares de compostos são rastreados a um custo de mais de 1.000.000.000 dólares¹. Durante o desenvolvimento pré-clínico, a maior parte deste custo é necessária para o teste de animais². Para limitar os custos, os pesquisadores no campo do desenvolvimento de fármacos necessitam de modelos alternativos para a triagem de segurança de compostos químicos³. Portanto, na fase inicial do desenvolvimento da droga, seria muito benéfico usar um método que possa avaliar rapidamente a segurança e a toxicidade dos compostos em um modelo adequado. Existem vários protocolos que têm sido utilizados para a triagem de toxicidade de compostos químicos envolvendo modelos de cultura animal e celular, mas não há um único protocolo que é validado e está em uso comum^4,5. Protocolos existentes usando zebrafish variam de comprimento e têm sido utilizados por pesquisadores individuais que avaliaram a toxicidade de acordo com sua exigência de conveniência^{6,7,8,9, 10} de ^{, 11} anos de ^{, doze anos}.

No passado recente, o zebrafish surgiu como um modelo conveniente para a avaliação da toxicidade de compostos químicos durante o desenvolvimento embrionário^6,7. O zebrafish tem muitas vantagens incorporadas para a avaliação de compostos químicos¹³. Mesmo experimentos em grande escala são amenable, como uma fêmea zebrafish pode colocar lotes de 200-300 ovos, que se desenvolvem rapidamente ex vivo, não precisa de alimentação externa para até uma semana e são transparentes. Os compostos podem ser adicionados diretamente na água, onde podem (dependendo da natureza do composto) difusa através do Chorion, e após a eclosão, através da pele, brânquias e boca de larvas. Os experimentos não necessitam de quantidades copiosas de compostos químicos¹⁴ devido ao pequeno tamanho do embrião. O desenvolvimento de embriões de zebrafish expressa a maioria das proteínas necessárias para atingir o desfecho normal do desenvolvimento. Portanto, um embrião zebrafish é um modelo sensível para avaliar se um potencial fármaco pode perturbar a função de uma proteína ou molécula de sinalização que é desenvolvimental significativo. Os órgãos do zebrafish tornam-se funcionais entre 2-5 DPF¹⁵, e os compostos que são tóxicos durante este período sensível do desenvolvimento embrionário induzem defeitos fenotípicos em larvas do zebrafish. Estas mudanças fenotípicas podem prontamente ser detectadas usando um microscópio simples sem técnicas invasoras¹¹. Os embriões de zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa toxicológica devido à sua complexidade biológica muito maior em comparação com a triagem de fármacos in vitro utilizando modelos de cultura celular^16,17.  Como um vertebrado, a composição genética e fisiológica de zebrafish é comparável aos seres humanos e, portanto, toxicidades de compostos químicos são semelhantes entre zebrafish e seres humanos^8,18,^{19, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22}. zebrafish é, portanto, uma ferramenta valiosa na fase inicial de descoberta de drogas para a avaliação da toxicidade e segurança dos compostos químicos.

No presente artigo, fornecemos uma descrição detalhada do método utilizado para avaliar a segurança e a toxicidade de compostos inibidores da anidrase carbônica (CA) usando embriões de zebrafish de 1-5 dias pós-fertilização (DPF) por um único pesquisador. O protocolo envolve expor embriões de zebrafish a diferentes concentrações de compostos inibidores químicos e estudar a mortalidade e as alterações fenotípicas durante o desenvolvimento embrionário. No final da exposição aos compostos químicos, a dose de LC₅₀ do produto químico é determinada. O método permite que um indivíduo realize uma triagem eficiente de 1-5 compostos de teste e leva cerca de 8-10 h, dependendo da experiência da pessoa com o método (Figura 1). Cada uma das etapas necessárias para avaliar a toxicidade dos compostos é descrita na Figura 2. A avaliação da toxicidade dos inibidores da CA requer 8 dias, e inclui a criação de pares de acasalamento (dia 1); recolha de embriões de tanques reprodutores, limpeza e transferência para a incubadora de 28,5 ° c (dia 2); distribuição dos embriões nos poços de uma placa de 24 poços e adição de compostos inibidores de CA diluídos (dia 3); análise fenotípica e imagem de larvas (dia 4-8) e determinação da dose de LC₅₀ (dia8).  Este método é rápido e eficiente, requer uma pequena quantidade do composto químico e apenas instalações básicas do laboratório.

Protocolo

A unidade principal da zebrafish na Universidade de Tampere tem uma autorização de estabelecimento concedida pelo Conselho Nacional de experimentação animal (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos os experimentos com embriões de zebrafish foram realizados de acordo com o governo provincial da Finlândia Oriental, departamento social e de saúde do protocolo da unidade de serviço regional de Tampere # LSLH-2007-7254/YM-23.

1. criação de tanques de acasalamento zebrafish overnight

1. Coloque 2-5 zebrafish masculino adulto e 3-5 zebrafish fêmea adulta em tanques de acasalamento durante a noite. (A reprodução é induzida pela manhã por ciclo automático de luz escura e durante a noite).
2. Configurar várias cruzes para obter embriões suficientes para avaliar a toxicidade de mais de dois compostos químicos. Para a avaliação da toxicidade, cada concentração precisa de um mínimo de 20 embriões²³.
3. Para evitar o manuseio de estresse para os animais, permitir que os animais para descansar por 2 semanas antes de usar os mesmos indivíduos para reprodução.

2. coleta de embriões e preparação de placas para exposição aos compostos químicos

1. Recolher os embriões, no dia seguinte antes do meio-dia, usando um filtro de malha fina e transferi-los para uma placa de Petri contendo E3 meio embrião [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mm MgSO₄e 0,1% w/v azul de metileno].
2. Retire os detritos utilizando uma pipeta plástica Pasteur (por exemplo, alimentos e resíduos sólidos). Examine cada lote de embriões o estereomicroscópio para remover os embriões não fertilizados/mortos (identificados pela sua aparência opaca).
3. Mantenha os embriões a 28,5 ° c em uma incubadora. Examine os embriões, na manhã seguinte, um estereomicroscópio e remova quaisquer embriões insalubres ou mortos. Além disso, substitua o antigo meio E3 pelo meio novo E3.
   Nota: os embriões de zebrafish são mantidos sempre a 28,5 ° c em condições laboratoriais.
4. Transfira cuidadosamente 1 embrião para cada poço de uma placa de 24 poços contendo meio E3 suficiente para cobrir os embriões.

3. preparações da solução de estoque de compostos químicos e distribuição de compostos diluídos nos poços

1. Tirar os frascos contendo os compostos inibidores armazenados a 4 ° c.
   Nota: dependendo das propriedades do composto, estes são armazenados em temperaturas diferentes.
2. Pesar o composto (s) usando um equilíbrio analítico que pode pesar alguns miligramas (mg) do composto com precisão.
3. Prepare pelo menos 250 μL (100 mM) de solução de estoque para cada composto em um solvente apropriado (por exemplo, água E3 ou dimetil sulfóxido (DMSO), com base nas propriedades de solubilidade dos compostos.
   Nota: as etapas acima podem ser feitas um dia antes do início do experimento em um momento conveniente e armazenadas a 4 ° c).
4. Faça diluições seriais das soluções de estoque (por e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM e 500 μM) usando água E3 em tubos de centrífuga de 15 mL.
   Nota: as concentrações e o número de diluições seriais variam de um composto para outro composto, dependendo dos seus níveis de toxicidade.
5. A partir da placa de 24 poços que contém embriões, retire a água E3 das cavidades utilizando uma pipeta Pasteur e uma pipeta de 1 mL (contendo 1 embriões de DPF) uma fileira de cada vez.
6. Distribuir 1 mL de cada diluente em cada poço (a partir de menor e movendo-se para maior concentração) para os poços de 24-placa bem.
7. Configure um grupo de controle do mesmo lote de embriões e adicione a quantidade correspondente de diluente.
8. Rotule 24 placas do poço com o nome e a concentração do composto e mantenha as placas em 28,5 ° c em uma incubadora.

4. análise fenotípica e imagiologia dos embriões utilizando um estereomicroscópio

1. Examine os embriões um estereomicroscópio para os parâmetros 24 h após a exposição aos compostos químicos.
   1. Observe os parâmetros como mortalidade, eclosão, batimento cardíaco, utilização de saco de gema, desenvolvimento da bexiga de natação, movimento dos peixes, edema pericárdico e forma do corpo²³.
   2. Leve as larvas expostas a cada concentração do composto e coloque-as lateralmente em uma pequena placa de Petri contendo 3% de celulose metílico de alto peso molecular usando uma sonda metálica.
      Nota: a 3% metil celulose (alta molecular com) é um líquido viscoso necessário para a incorporação dos peixes com uma orientação necessária para o exame microscópico. Para orientar o peixe neste líquido, uma sonda metálica é necessária.
   3. Pegue as imagens usando estereomicroscópio anexado a uma câmera. Salve as imagens em uma pasta separada todos os dias até o final do experimento.
   4. Insira todas as observações em uma tabela a cada dia em uma tabela on-line ou em uma folha impressa.
   5. Se os compostos são neurotóxicos, as larvas de 4 a 5 DPF podem mostrar o padrão de natação alterado, fazer um registro de tais alterações, quer através da captura de um curto (30 s a 1 min) vídeo das larvas exibindo padrão de movimento anormal.
   6. Após 5 dias da exposição aos compostos químicos, anote a concentração em que a metade dos embriões morre calculando a metade da concentração letal máxima 50 (LC₅₀) de cada produto químico.
      Nota: o LC₅₀ é a concentração em que 50% dos embriões morrem no final de 5 dias de exposição a um composto químico. Use um mínimo de 20 embriões para testar a toxicidade de cada concentração de um composto²³.
   7. Construir uma curva para a mortalidade de embriões para todas as concentrações usando um programa adequado.

Resultados

A parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou vários compostos químicos em um único experimento. No início, selecione os compostos para avaliação da toxicidade, o número de concentrações a testar para cada composto e, consequentemente, faça um gráfico (Figura 3). Utilizamos uma cor única para cada composto para organizar as amostras (Figura 3). O uso do marcador e da rotul...

Discussão

O teste de toxicidade in vitro utilizando células cultivadas pode detectar a sobrevivência e os estudos morfológicos das células que fornecem informações limitadas sobre a toxicidade induzida pelo composto de teste. A vantagem da seleção da toxicidade de compostos químicos que usam embriões do zebrafish é deteção rápida de mudanças fenotípicas quimicamente induzidas em um animal inteiro durante o desenvolvimento embrionário em um organismo modelo relevante. Aproximadamente 70% dos genes humanos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Nunc	Thermo Scientific
Balance (Weighing scale)	KERN	PLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)	Mettler Toledo	AB104-S/PH
CaCl2	JT.Baker	RS421910024
Disecting Probe	Thermo Scientific	17-467-604
DMSO	Sigma Aldrich, Germany	D4540
Falcon tubes 15 mL	Greiner bio-one	188271
High molecular weight methylcellulose	Sigma Aldrich, Germany	M0262
Incubator for zebrafish larvae	Termaks	B8000
KCL	Merck	1.04936.0500
Methyl Blue	Sigma Aldrich, Germany	28983-56-4
MgSO4	Sigma Aldrich, Germany	M7506
Microcentrifuge tubes	Starlab	S1615-5500
NaCl	VWR Chemicals	27810.295
Paraffin Histoplast IM	Thermo Scientific	8331
Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171
Petri dish	Thermo Scientific	101R20
Petri plates	Sarstedt	82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)	Thermo Scientific	4641230N, 4641210N
Plates 24-Well	Thermo Scientific	142485
Steriomicroscope/Camera	Zeiss	Stemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)	Fisherbrand	11569914
Zebrafish AB strains	ZIRC	ZL1