対流強化送達によるマウス脳への抗体の送達

要約

対流増強送達(CED)は、大きな組織体積を直接灌流することにより、脳への治療薬の効果的な送達を可能にする方法である。プロシージャはカテーテルおよび最大限に活用された注入プロシージャの使用を要求する。このプロトコルは、マウス脳に抗体のCEDのための方法論を説明する。

要約

対流増強送達(CED)は、カテーテルシステムを使用して大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。このようなアプローチは、血液脳関門(BBB)を通過して安全な送達方法を提供し、従って、毒性による全身暴露が望ましくない治療を可能にする。CEDは、カテーテルの設計、注入プロトコル、およびインフューサートの特性の最適化を必要とします。このプロトコルでは、マウスのコーデートプタメンに最大20 μgの抗体を含む溶液のCEDを実行する方法を説明する。ステップカテーテルの調製、インビトロでの試験、ランピング注射プログラムを用いたマウスでのCEDの実行について説明します。プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができ、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子、およびリポソームを含む様々なトレーサーまたは薬理学的に活性または不活性な物質を注入するために使用することができます。

概要

血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)と血液循環を分離する半透過性境界を形成する。しかし、治療薬でCNSに到達することは、脳腫瘍、アルツハイマー病(AD)またはパーキンソン病(PD)などの様々な疾患の文脈において必要である1。これは、新しい治療法の開発において重要になり、特に試験された薬物がBBB透過性が悪い場合またはその全身暴露が危険な毒性1、2につながる可能性がある場合。臨床的に使用される抗体のいくつかは、これらの特徴の両方を表示する。この問題の解決策は、BBBの真後ろに治療薬を提供することです。

対流増強送達(CED)は、大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。これは、1つ以上のカテーテルを対象領域に外科的に取り付けることによって達成される。薬物塗布中に、カテーテルの開口部に圧力勾配が形成され、これは組織3、4におけるインフューサテ分散の駆動力となる。したがって、灌流範囲2、4、5を決定する拡散係数ではなく、注入の持続時間です。これは、従来と比較してはるかに大きな脳容積にわたってインフュージョンの均一な送達を提供し、脳内注射法2,6^に基づく拡散を行う。同時に、この配信モダリティは、組織損傷2のリスクが低い。したがって、CEDは、CNS腫瘍の治療のための従来の化学療法薬の安全かつ有効な投与を可能にするだけでなく、他のCNS障害の多数における免疫調節剤またはアゴニストおよび拮抗抗体の送達を可能に^{する2 、7,8,9}.CEDは現在、パーキンソン病、アルツハイマー病、ならびに高品位の神経膠腫2、7、8、10、11の治療で試験されている。

カテーテルの設計および注入のレジメンはCED 10、12、13、14、15、16の結果に影響を与える最も重要な要因の1つである。 さらに、それは、粒子の適度なサイズ、アニオン電荷、および低組織親和性10、17を含む、インフューザーの特定の物理化学的特性を必要とする。これらのパラメータのそれぞれは、^標的にされる脳領域の組織学的特徴に従って潜在的に調整されなければならない 2,^10,17.

ここでは、マウスのコーデートプタメン(線条体)に抗体溶液のCEDを行うための方法論について説明する。さらに、プロトコルは実験室のセットアップのステップカテーテルの準備を含み、インビトロでそれらをテストし、CEDを行う。

カニューレの形状、使用される材料、カテーテルの開口部の数によって異なる複数のカテーテルの設計があり、12、15、18、19、20 、21、22。鈍い端の金属の針から1mm突出した融合シリカキャピラリー製のステップカテーテルを使用しています。このカテーテルの設計は実験室で容易に製造することができ、生体内の脳のパレンキマに似た物理的なパラメータを持つアガロースブロックとインビトロでテストされると、良好なCED結果を生み出すことができます。

さらに、生体内で5μLのインフューサトを送送るためのランピングレジメンを実装しています。このようなプロトコルでは、射出速度が0.2 μL/minから最大0.8 μL/minに増加し、カテーテルに沿った逆流の可能性と組織損傷のリスク^を最小限に抑えます16。このプロトコルを用いて、11分30秒の間にPBSの5μLで最大20 μgの抗体を有するマウスを正常に投与した。

プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができるか、または様々な他の物質、例えば、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子またはリポソーム2、10、14、18^{を注入する、22}.抗体のリン酸緩衝生理食べ物(PBS)または人工脳脊髄液(aCSF)溶液と比較して、大幅に異なる物理化学的特性を有するインフュー酸塩を使用する場合は、追加の検証ステップが推奨されます。カテーテルアセンブリ、検証およびCEDのために、我々は通常の立体フレームに取付けられるドリルおよび注入の単位が付いている立体ロボットを使用してすべてのステップを記述する。この手順はまた、記載されたガラスマイクロシリンジを駆動することができるプログラム可能なマイクロ注入ポンプに接続された手動定位フレームで行うことができます。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、ライセンス番号ZH246/15の下でスイス州獣医局によって承認されています。

ステップカテーテルの準備

1. カテーテルの工程のための融合シリカチューブの調製
   1. 内径0.1mm、壁厚0.0325mmの融合シリカキャピラリーを30mmの長さに切ります。
   2. チューブにひび割れがないか調べ、マイクロフォージを使用して端部を熱研磨し、チューブの開口部が滑らかな表面を持っていることを確認します。
2. 金属針中の内管の固定
   1. 10 μLシリンジに27Gの針を取り付け、シリンジを立体ロボットに入れます。
   2. ロボットを使用して、硬い表面の上に注射器を移動し、針の先端でそれに触れます。カテーテルステップの長さを設定するための基準面として機能するので、この位置は、ソフトウェアに注意するか、保存する必要があります。
   3. 針を上に上げるのは、針の内側に融合したシリカ毛細血管の配置を可能にする
   4. 針に融合したシリカ毛細血管を針に入れ、20mmの毛細血管が針から突き出ている。
   5. ピペットを用いて、高粘度シアノクリレート接着剤の2μLを毛細血管上に均等に広げ、金属針から始まり、毛細血管の下端より10mm上に仕上げる、図2に示すように。
   6. 立体ロボットを使用して、金属針の先端が基準面上で1mmになるまで針を下げます。このように融合シリカキャピラリーは、金属針に固定され、金属針の先端から1ミリメートルのステップを形成します。工程を鈍らせないように、金属針の端に過剰な接着剤の形成を取り除きます。
   7. 接着剤が硬化し、カテーテルでシリンジをステレオタクティックロボットから取り外すまで15分待ちます。ステップですべての余分な接着剤が顕微鏡下でカテーテルの先端をチェックすることによって除去されたことを確認してください。
3. アガロースのブロックを使用してステップカテーテルをテストする
   1. 従来のゲルトレイにPBSに0.6%アガロース溶液を準備し、重合するまで待ちます。アガロースを約20mm×20mmのブロックで切る。使用するまで、ブロックをPBSに浸しておきます。
   2. 手動で濾過されたトリパンブルーの0.4%溶液の10 μLのステップカテーテルシリンジを充填します。
   3. 定位ロボットを使用して、固定手順中にカテーテルの工程のシールを評価するために、0.2 μL/minで1 μLを分配します。トリパンブルー溶液は、カテーテルの先端のみに表示されるべきである。紙ティッシュで拭き取ります。
   4. 定位ロボットにアガロースブロックを配置し、カテーテルの先端がアガロースブロックの表面に対して参照できるようにロボットを校正します。
   5. CED の射出パラメータをプログラムします。
      1. 5 μL の射出量の場合は、次の手順を使用します: 0.2 μL/min で 1 μL、0.5 μL/min で 2 μL、0.8 μL/min で 2 μL. 各ステップの持続時間を比例的に変更して、特定の実験計画に従って最終注入量を調整します。
      2. マウスカウデートプタメン(線条体)に溶液を注入するために、3.5mmの深さでブレグマから1mmの正面および1.5-2 mmの位置でそのような注入を行う。
      3. 注射後、カテーテルを2分間所定の位置に残し、1mm/minで引き込み、脳内の流体の適切な分散とカテーテル除去時の注射管のシールを確保します。
         注:使用される特定の立体ロボットに応じて、すべてのパラメータを単一のスクリプトにプログラムすることができます。スクリプトの例は、補足資料として使用できます。
   6. CED手順を開始し、アガロースブロックに5 μLのトリパンブルー溶液を注入します。
   7. アガロースのトリパンブルーの雲の形状とカテーテル管に沿った潜在的な漏れを評価します。トリパンブルーは、カテーテル先端の周りの中心と少なくとも1ミリメートルの直径を持つ楕円体または円形の雲を形成する必要があります。金属針の先端に大きな逆流が見えるべきではありません。
   8. 新しいアガロースブロックを配置し、アガロースでカテーテルの詰まりを評価するために0.2 μL/minで1 μLの第2注射を開始します。トリパンブルーは、注射開始直後にカテーテルの先端から再び雲を形成し始める必要があります。
   9. 注射器の残量が3 μL に相当するかどうかを評価します。任意のバリエーションは、カテーテルの取り付けやシリンジプランジャーを介して流体の漏れを指す可能性があります。
   10. すべての試験注射が成功した場合、カテーテルは十分に密封され、まっすぐで、カテーテル先端以外の場所からトリパンブルー溶液は観察されない、トリパンブルーの痕跡が見えなくなるまで、脱イオン化されたH2 O(dH2 O)でカテーテルを洗うそして、次のように10回洗浄:70%エタノールと100%エタノール、その後、70%エタノールときれいな脱イオン水で再び洗い流します。
   11. 乾燥した条件の下でカテーテルを貯える。

2. マウス脳への抗体溶液の対流増強送達

注:地元の動物福祉規制に応じて、様々なタイプの麻酔薬、鎮痛薬、抗生物質をこの手順に実装することができます。このプロトコルは、注射麻酔の使用について説明する。イソフランなどの吸入麻酔薬は、立体フレームにノーズマスクを取り付けても使用することができる。また、感染予防のために飲料水に抗生物質を添加することをお勧めします。

1. 外科セットアップ
   1. 麻酔薬と解毒剤の溶液を準備します。マウスは、フェンタニル(0.05mg/kg)、ミダゾラム(5mg/kg)およびメデトミジン(0.5mg/kg)を無菌dH2Oで希釈した3成分麻酔を用いて安全に麻酔することができる。我々は、無菌dH 2 O(最初の解毒剤溶液)でフルマゼニル(0.5 mg/kg)とブプレノルフィン(0.1 mg/kg)を含む2つの解毒剤溶液を使用して2段階の覚醒手順を行います。第2のものは、無菌dH2O(第2解毒剤溶液)中のアティパメゾール(2.5mg/kg)を含む。
   2. 無菌dH2 Oで希釈したカルプロフェン(5.667mg/kg)を含む鎮鎮剤溶液を調剤する。
   3. 立体フレーム、加熱パッド、立体ロボットの要素をクリーニングします。ロボットのすべての部分が損傷の危険なしに洗浄できるわけではないことに注意してください。清掃や使用準備の詳細については、ロボットのマニュアルを参照してください。
   4. ステップカテーテルでシリンジを組み立て、dH₂O、70%エタノール、100%エタノールで複数回フラッシュし、その後70%エタノールとdH2 Oで再びフラッシュします。最後に、注射器をPBSまたは他のバッファーで洗い流し、頭蓋内注射のための溶液の調製に使用する、例えば人工脳脊髄液である。注射器のプランジャーは、全体の手順の間にスムーズかつ自由に移動する必要があります。
   5. 立体的なロボットソフトウェアを立体フレームで調整します。
   6. ロボットアームが自由に動き、射出ポンプが適切に接続され、妨害なしでCED手順を実行できることを確認して、定位ロボットソフトウェアをテストします。これには、ロボットの動き、ランピングインジェクション、2分の待機ステップとカテーテルの引き込み速度のチェックが含まれます。すべてのパラメータは、ポイント 1.3.5 で説明されている事前にプログラムされた CED 手順に適合する必要があります。
   7. ドリルビットをドリルに挿入します。使用前にドリルビットを殺菌することをお勧めします。
   8. PBSまたはaCSFなどの他の緩衝液を用いて抗体溶液を調作する。5 μLの抗体の1~20 μgは、単一のCED手順で注入することができる。他の体積およびタンパク質量は、実験を行う前にテストする必要があります。高粘度溶液を使用すると、カテーテルの詰まりにつながる可能性があることに注意してください。
   9. 希釈抗体を手動で注射器にロードします。
2. CEDによる線条体への抗体注射
   1. マウスの重量を量り、体重に応じて3成分麻酔溶液をペリトネウムに注入する。射出時間に注意してください。ヒーターパッドで加熱された別のケージにマウスを移します。
   2. マウスを観察して、いつ引き込むか判断します。マウスの動きが止まったらすぐに、手術中に角膜が乾燥するのを防ぐために眼科のチントを目に塗布する。完全な鎮下は、通常、3成分麻酔溶液の注射から10〜15分を開始する。
   3. 動物の完全な麻酔を確保するためにピンチ反射テストを使用して痛みの反応をチェックしてください。
   4. ヘアトリマーを使用して頭を剃ります。
   5. ヨウ素溶液に浸した綿棒で皮膚を消毒する。皮膚を3回円形にスクラブします。
   6. メスを使用して、目のレベルで頭蓋中間線仕上げに沿って10ミリメートルの皮膚切開を行います。
   7. 鼻クランプとイヤーバーを使用して、ステレオタクティックフレーム内のマウスを固定します。頭蓋骨の表面が水平でしっかりと固定されていることを確認します。正しい解剖ナビゲーションとは別に、これは掘削およびCEDプロシージャの間に頭蓋骨の傾きを避けるためにも重要である。
   8. シリンジを立体ロボットに置きます。
   9. ドリルビットを参照点のカテーテルの先端と同期させます。ドリルの位置と注射器の位置の関係がソフトウェアで正確に決定されることが重要であり、脳の所望の解剖学的領域で注射を行うことができる。
   10. 鉗子を使用して皮膚を引き込み、頭蓋骨表面にブレグマを局所化する。
   11. ドリルビットの先端を使用してソフトウェアでブレグマを参照します。
   12. ドリルをブレグマから1mm前面と2mmの横の位置に移動し、バリ穴を開けます。デュラの母校を損傷しないように注意してください。
   13. シリンジをバリ穴の上に移動します。
   14. シリンジから0.5~1 μLを分配し、カテーテルに気泡が残らないようにします。
   15. ポイント 1.3.5 で説明されている CED プログラムを起動します。注入スポットからの流体逆流の痕跡がないか、頭蓋骨の表面を観察します。動物の呼吸数を監視します。
   16. CEDプログラムが終了し、カテーテルが脳から引き抜かれたら、CEDの間にカテーテルの詰まりを点検するために0.2 μL/minで注入ポンプを開始する。目詰まりが起こらなかった場合は、カテーテル先端から注入ミックスの液滴がすぐに表示されます。
   17. カテーテルを再利用または保管する前に、カテーテルステップを顕微鏡で損傷または摩耗の兆候がないか目視で調べ、ステップ1.3.10のようにきれいにしてください。
3. ウェイクアップ手順
   1. ステレオタクティック フレームからマウスをそっと取り外します。
   2. 生理生理生理生理手の無菌溶液で手術部位を洗浄します。
   3. 鉗子を使用して、骨ワックスでバリ穴を埋めます。
   4. 薄い先端の鉗子で皮膚を閉じ、切り傷の上に10 μLピペットで外科接着剤を適用する。接着剤が重合するのを15~30~待ちます。
   5. 皮下注射による鎮鎮薬溶液を適用する。注射の時間に注意してください。
   6. 最初の解毒剤溶液を適用します。注射の時間に注意してください。
   7. ヒーターパッドで別のケージにマウスを転送し、驚くべき反射のために動物を監視します。
   8. マウスが第1の解毒剤溶液の投与後15分で完全な意識を得ていない場合は、皮下注射により第2の解毒剤溶液を塗布する。
   9. 回復段階で動物を監視します。
   10. 術後の合併症については、1~2時間後と翌日に確認してください。必要に応じて、鎮痛を再び適用します。
   11. 感染予防のために、スルファドキシン(最終濃度0.08%w/v)とトリメトプリム(最終濃度0.016%w/v)を、手術後1週間、動物がアドリビタムにアクセスできる飲料水に加える。

結果

このプロトコルは実験室の環境のCEDプロシージャの使用のためのステップカテーテル(図1)の準備を可能にする。漏れ、針路に沿って逆流、詰まりのためのカテーテルを制御するために、我々は、例えば、トリパンブルー溶液、アガロースブロックに染料の注射を行うことをお勧めします。図3は、CEDカテーテルを用いて0.5μL/分で1μLの注入後のトリ?...

ディスカッション

対流増強送達、または脳への圧力媒介薬物注入は、1990年初頭に最初に提案された3.このアプローチは、制御された方法で血液脳関門の背後にある大きな脳体の灌流を約束します².しかし、これまでのところ、このアプローチを用いて行われた臨床試験はごくわずかであり、一部は臨床セットアップにおけるCEDが技術的に要求が厳^{しい24、25}<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL syringe	Hamilton	7635-01
27 G blunt end needle	Hamilton	7762-01
Agarose	Promega	V3121
Atipamezol	Janssen
Bone wax	Braun	1029754
Buprenorphine	Indivior Schweiz AG
Carprofen	Pfizer AG
Dental drill bits, steel, size ISO 009	Hager & Meisinger	1RF009
Ethanol 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
Fentanyl	Helvepharm AG
FITC-Dextran, 2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
Flumazenil	Labatec Pharma AG
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775-500ML
High viscosity cyanoacrylate glue	Migros
Iodine solution	Mundipharma
Medetomidin	Orion Pharma AG
Microforge	Narishige	MF-900
Midazolam	Roche Pharma AG
Ophthalmic ointment	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647	Jackson Immuno
Scalpels	Braun	BB518
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
Stereotactic frame for mice	Stoelting	51615
Stereotactic robot	Neurostar	Drill and Injection Robot
Succrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
Topical tissue adhesive	Zoetis	GLUture
Trypan blue	ThermoFischer Scientific	15250061
Water	Bichsel	1000004