Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

Resumo

A entrega reforçada por convecção (CED) é um método que permite a efetiva entrega da terapêutica no cérebro por perfusão direta de grandes volumes de tecido. O procedimento requer o uso de cateteres e um procedimento de injeção otimizado. Este protocolo descreve uma metodologia para CED de um anticorpo em um cérebro do rato.

Resumo

A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais usando um sistema de cateter. Tal aproximação fornece um método seguro da entrega que passa a barreira do cérebro de sangue (BBB), assim permitindo o tratamento com a terapêutica com o BBB-permeabilidade pobre ou aqueles para que a exposição sistemática não é desejada, por exemplo, devido à toxicidade. O CED exige a optimização do projeto do cateter, do protocolo da injeção, e das propriedades do infusate. Com este protocolo nós descrevemos como executar o CED de uma solução que contem até 20 μg de um anticorpo no putamen caudado dos ratos. Descreve a preparação de cateteres de degrau, testando-os in vitro e realizando o CED em camundongos usando um programa de injeção em rampa. O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão e pode ser usado para injetar vários traçadores ou substâncias farmacologicamente ativas ou inativas, incluindo quimioterápicos, citocinas, partículas virais e lipossomas.

Introdução

A barreira hematoencefálica (BBB) forma uma borda semipermeável separando o sistema nervoso central (SNC) da circulação sanguínea. Alcançar o CNS com terapêutica é entretanto necessário no contexto de várias doenças, como tumores cerebrais, doença de Alzheimer (AD) ou doença de Parkinson (PD) entre outros¹. Isto torna-se importante no desenvolvimento de novas terapias, especialmente se a droga testada exibe permeabilidade BBB pobre ou a sua exposição sistémica pode levar a toxicidade perigosa^1,2. Alguns dos anticorpos clinicamente utilizados exibem ambas estas características. Uma solução para este problema seria a de entregar a terapêutica diretamente por trás do BBB.

A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais. Isto é conseguido cirurgicamente instalando um ou mais cateteres na área alvo. Durante a aplicação da droga, um gradiente de pressão é formado na abertura do cateter, que se torna a força motriz da dispersão do infusato no tecido^3,4. É, portanto, a duração da infusão e não os coeficientes de difusão que determinam a faixa de perfusão^2,4,5. Isto fornece a entrega uniforme do infusato sobre um volume muito maior do cérebro comparado ao convencional, a difusão baseou métodos intracerebral da injeção^2,6. Ao mesmo tempo, esta modalidade da entrega tem um risco mais baixo de dano de tecido². Consequentemente, o CED pode permitir a administração segura e eficaz da quimioterapêutica convencional para o tratamento de tumores do CNS, assim como a entrega de agentes imunomoduladores ou de anticorpos agonístico e antagônicas em uma multidão de outras desordens do CNS^{2 ,7,8,9}. CED é atualmente testado em terapias da doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, bem como glioma de alto grau^2,7,8,10,11.

O delineamento do cateter e o esquema de injeção estão entre os fatores mais importantes que influenciam o desfecho do CED ^{10,12,13,14,15,16}. Além disso, requer propriedades físico-químicas específicas do infusato, incluindo tamanho moderado das partículas, carga aniônica e baixa afinidade tecidual ^10,17. Cada um destes parâmetros tem que ser ajustado potencialmente de acordo com as características histológicas da região do cérebro a ser alvejada^2,10,17.

Aqui nós descrevemos a metodologia para executar o CED de uma solução do anticorpo no putamen caudado (striatum) dos ratos. Além disso, o protocolo inclui a preparação de cateteres de degrau em uma instalação laboratorial, testando-os in vitro e realizando o CED.

Existem vários projetos de cateter disponíveis na literatura, diferindo pela forma da cânula, os materiais utilizados e o númerode aberturas de cateter^{12,15,18,19,20 ,21,22}. Nós estamos usando um cateter da etapa feito de um capilar fundido do silicone que projeta 1 milímetro de uma agulha sem corte do metal da extremidade. Este projeto do cateter pode facilmente ser manufacturado em um laboratório de pesquisa e dá resultados bons de CED quando testado in vitro com blocos do agarose com parâmetros físicos que assemelham-se ao parênquima do cérebro in vivo²³.

Além disso, nós implementamos um regime de rampa para a entrega de 5 μL de infusato in vivo. Em tal protocolo, a taxa de injeção é aumentada de 0,2 μL/min para um máximo de 0,8 μL/min, minimizando assim as chances de refluxo infusato ao longo do cateter, bem como o risco de dano tecidual¹⁶. Usando este protocolo, nós administramos com sucesso ratos com os até 20 μg do anticorpo em 5 μL de PBS sobre o curso de 11 minutos 30 s.

O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão ou para injetar várias outras substâncias, por exemplo, quimioterápicos, citocinas, partículas virais ou lipossomas^{2,10,14,18 ,22}. Em caso do uso do infusato com propriedades físico-químicas drasticamente diferentes comparadas a uma solução salina tamponada fosfato (PBS) ou do líquido cerebrospinal artificial (ACSF) de anticorpos, as etapas adicionais da validação são recomendadas. Para o conjunto do cateter, a validação e o CED, nós descrevemos todas as etapas usando um robô stereotactic com uma unidade da broca e da injeção montada em um frame stereotactic regular. Este procedimento pode igualmente ser executado com um frame stereotactic manual conectado à bomba programável da microinfusão que pode conduzir as Microseringas de vidro descritas.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo escritório veterinário suíço cantonal o número de licença ZH246/15.

1. preparação dos cateteres de degrau

1. Preparação de uma tubagem de sílica fundida para a etapa do cateter
   1. Corte o capilar de sílica fundida com diâmetro interno de 0,1 mm e espessura de parede de tubos de 0, 325 mm a um comprimento de 30 mm.
   2. Examine a tubulação para rachaduras e lustrador do calor as extremidades usando um microforge para assegurar-se de que as aberturas da tubulação tenham uma superfície lisa.
2. Fixação do tubo interno em uma agulha de metal
   1. Monte uma agulha de 27 G numa seringa de 10 μL e coloque a seringa num robô estereotáxico.
   2. Usando o robô, mova a seringa sobre uma superfície dura e toque-a com a ponta da agulha. Esta posição deve ser anotada ou conservada no software porque servirá como uma superfície de referência para ajustar o comprimento da etapa do cateter.
   3. Elevar a agulha para permitir a colocação do capilar de sílica fundido dentro da agulha
   4. Coloque o capilar de sílica fundido na agulha, de forma a que 20 mm do capilar se saliente da agulha.
   5. Usando uma pipeta, espalhe uniformemente 2 μL de adesivo de cianoacrilato de alta viscosidade sobre o capilar, partindo da agulha metálica e terminando 10 mm acima da extremidade inferior do capilar, conforme representado na Figura 2.
   6. Usando o robô estereotáxica, abaixe a agulha até que a ponta da agulha metálica seja de 1 mm sobre a superfície de referência. Desta forma, o capilar de sílica fundida será fixado na agulha metálica e formarão uma etapa de 1 mm a partir da ponta da agulha metálica. Retire qualquer excesso de cola formando no final da agulha de metal para evitar embotamento a etapa.
   7. Aguarde 15 minutos para que a cola endureça e retire a seringa com o cateter do robô estereotáxico. Confirme que na etapa toda a colagem adicional estêve removida verific a ponta do cateter um microscópio.
3. Testando o cateter da etapa usando um bloco do agarose
   1. Prepare 0,6% de solução de agarose em PBS em uma bandeja de gel convencional e aguarde até que ela polimerize. Corte o agarose em cerca de 20 mm x 20 mm blocos. Até o uso, manter os blocos imersos em PBS.
   2. Encha manualmente a seringa do cateter da etapa com 10 μL da solução de 0,4% do azul filtrado do Tripan.
   3. Utilizando o robô estereotáxico, dispense 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar a vedação da etapa do cateter durante o procedimento de fixação. A solução de azul de trypan deve ser visível unicamente na ponta do cateter. Limpe-o com um lenço de papel.
   4. Coloc o bloco do agarose no robô stereotactic e calibre o robô assim que a ponta do cateter é referenciada de encontro à superfície do bloco do agarose.
   5. Programe os parâmetros de injeção para CED.
      1. Para o volume de injeção de 5 μL, utilize os seguintes passos: 1 μL a 0,2 μL/min, depois 2 μL a 0,5 μL/min e 2 μL a 0,8 μL/min. Ajuste o volume final da injeção de acordo com o plano experimental específico, alterando proporcionalmente a duração de cada uma das etapas.
      2. A fim injetar a solução no putamen caudado murino (striatum), realize tal injeção em uma posição frontal de 1 milímetro e 1.5 – 2 milímetros lateral de Bregma na profundidade de 3,5 milímetros.
      3. Após a injeção, deixe o cateter no lugar por 2 min e depois retraia a 1 mm/min para garantir a dispersão adequada do fluido no cérebro e vedação do trato de injeção durante a remoção do cateter.
         Nota: Dependendo do robô estereotáxico específico usado, todos os parâmetros podem ser programados em um único script. Um exemplo de script está disponível como material complementar..
   6. Inicie o procedimento CED e injete 5 μL de solução azul de Tripan no bloco de agarose.
   7. Avalie a forma da nuvem do azul do Tripan no agarose e no escapamento potencial ao longo do intervalo do cateter. O azul de trypan deve formar um elipsóide ou uma nuvem redonda com o centro ao redor da ponta do cateter e um diâmetro de pelo menos 1 mm. Nenhum refluxo principal sobre a ponta da agulha de metal deve ser visível.
   8. Coloque um novo bloco de agarose e inicie uma segunda injeção de 1 μL a 0,2 μL/min para avaliar o entupimento do cateter com o agarose. O azul de trypan deve novamente começar a formar uma nuvem a partir da ponta do cateter imediatamente após o início da injeção.
   9. Avalie se o volume remanescente na seringa corresponde a 3 μL. Quaisquer variações podem apontar para um vazamento de fluido através da montagem do cateter ou êmbolo da seringa.
   10. Se todas as injeções do teste forem bem sucedidas, o cateter está bem selado, reto e nenhuma solução azul do Tripan é observada de outros pontos do que a ponta do cateter, lava o cateter com H₂o deionizada (DH₂o) até que nenhum traço do azul do Tripan esteja visível e depois lave dez vezes da seguinte forma: 70% etanol e 100% etanol seguido de rubor novamente com 70% de etanol e água limpa deionizada.
   11. Guarde o cateter em condições secas.

2. convecção-Enhanced entrega de solução de anticorpos para o cérebro murino

Nota: Dependendo dos regulamentos locais de bem-estar animal, vários tipos de anestésicos, analgésicos e antibióticos podem ser implementados para este procedimento. Este protocolo descreve o uso da anestesia da injeção. Os anestésicos inalatórios, como o isoflurano, também podem ser utilizados através da montagem de uma máscara nasal na armação estereotáxica. Além disso, recomendamos a adição de antibióticos para a água potável para a profilaxia da infecção.

1. Instalação cirúrgica
   1. Prepare soluções anestésicos e antídoto. Os camundongos podem ser anestesiados com segurança por meio de anestesia de três componentes contendo fentanil (0, 5 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg) diluídos em dH estéril₂O. Realizamos um procedimento de despertar em duas etapas usando duas soluções de antídoto, uma contendo flumazenil (0,5 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) em dH estéril₂O (primeira solução de antídoto). O segundo contém atipamezol (2,5 mg/kg) em dH estéril₂O (segunda solução de antídoto).
   2. Preparar a solução de analgesia contendo carprofeno (5,667 mg/kg) diluído com dH estéril₂O.
   3. Limpe a armação estereotáxica, a almofada de aquecimento e os elementos do robô estereotáxico. Tenha em mente que nem todas as partes do robô podem ser limpas sem risco de danos. Consulte o manual do robô para obter detalhes sobre a limpeza e preparação para o uso.
   4. Monte a seringa com o cateter de degrau e lave-a várias vezes com dH₂o, 70% etanol e 100% etanol seguido de rubor novamente com 70% de etanol e DH₂o. Finalmente, lave a seringa com PBS ou outros buffers para ser usado para a preparação da solução para injeção intracraniana, por exemplo, líquido cefalorraquidiano artificial. O êmbolo da seringa deve mover-se suavemente e livremente durante todo o procedimento.
   5. Calibre o software estereotáxica do robô com a armação estereotáxica.
   6. Teste o software do robô estereotáxica assegurando que os braços do robô se movem livremente e que a bomba de injeção está conectada corretamente e pode executar o procedimento CED sem quaisquer distúrbios. Isto inclui o teste do movimento do robô, a injeção de rampa, verificando a etapa de espera de 2 min e a velocidade da retração do cateter. Todos os parâmetros devem caber o procedimento de CED pré-programado descrito no ponto 1.3.5.
   7. Insira a broca na broca. Recomenda-se esterilizar os bocados de broca antes de usar.
   8. Prepare a solução do anticorpo usando PBS ou outras soluções do amortecedor tais como aCSF. 1 a 20 μg de anticorpo em 5 μL podem ser injetados em um único procedimento de CED. Outros volumes e quantidades de proteínas devem ser testados antes da realização do experimento. Esteja ciente de que o uso de soluções de alta viscosidade pode levar ao entupimento do cateter.
   9. Carregue manualmente a seringa com o anticorpo diluído.
2. Injeção de anticorpos por CED em estriado
   1. Pesar o rato e injetar a solução da anestesia do três-componente no peritônio de acordo com o peso de corpo. Anote o tempo de injeção. Transfira o mouse para uma gaiola separada aquecida com uma almofada de aquecimento.
   2. Observe o mouse para determinar quando a sedação começa. Assim que o mouse pára de se mover, aplique pomada oftálmicas sobre os olhos para proteger a córnea de secar durante a cirurgia. A sedação completa geralmente começa 10 – 15 min a partir da injeção da solução de anestesia de três componentes.
   3. Verifique as reações de dor usando o teste pitada-reflexo para garantir a anestesia completa do animal.
   4. Raspar a cabeça usando um aparador de cabelo.
   5. Desinfecte a pele com cotonetes embebidos em solução de iodo. Esfregue a pele três vezes em movimento circular.
   6. Usando um bisturi, faça uma incisão da pele de 10 milímetros ao longo do midline craniano que termina no nível de olho.
   7. Fixe o rato na armação estereotáxica utilizando a braçadeira nasal e as barras auriculares. Assegure-se de que a superfície do crânio esteja horizontal e firmemente fixada. Além da correta navegação anatômica, isso também é crucial para evitar a inclinação do crânio durante a perfuração e o procedimento CED.
   8. Coloque a seringa no robô estereotáxica.
   9. Sincronize o bit de broca com a ponta do cateter em um ponto de referência. É crucial que a relação entre a posição da broca e a seringa seja determinada precisamente no software, assim que a injeção pode ser executada na região anatômica desejada do cérebro.
   10. Retrair a pele usando fórceps e localize Bregma na superfície do crânio.
   11. Referência Bregma no software usando a ponta da broca.
   12. Mova a broca para uma posição frontal de 1 mm e 2 mm lateral de Bregma e perfure um furo de rebarba. Tenha cuidado para não danificar a dura-máter.
   13. Mova a seringa sobre o orifício de rebarba.
   14. Dispense 0,5 – 1 μL da seringa para garantir que não restam bolhas de ar no cateter.
   15. Inicie o programa CED descrito no ponto 1.3.5. Observe a superfície do crânio para quaisquer vestígios de refluxo fluido do ponto de injeção. Monitore a taxa de respiração do animal.
   16. Assim que o programa CED terminar e o cateter for retirado do cérebro, inicie a bomba de injecção a 0,2 μL/min para verificar o entupimento do cateter durante o CED. Se nenhum entupimento ocorreu, você deve ver imediatamente uma gota de mistura de injeção proveniente da ponta do cateter.
   17. Antes de reusar ou armazenar o cateter, examine visualmente a etapa do cateter para quaisquer sinais de dano ou desgaste um microscópio e limpe-o como na etapa 1.3.10.
3. Acordando o procedimento
   1. Retire suavemente o rato da armação estereotáxica.
   2. Lave o local da cirurgia com solução salina estéril.
   3. Usando fórceps, encha o furo de rebarba com cera óssea.
   4. Feche a pele com fórceps de ponta fina e Aplique cola cirúrgica com uma pipeta de 10 μL sobre o corte. Aguarde 15 – 30 s para que a cola polimerize.
   5. Aplique a solução de analgesia por injeção subcutânea. Anote o tempo de injeção.
   6. Aplique a primeira solução de antídoto. Anote o tempo de injeção.
   7. Transfira o mouse para uma gaiola separada com uma almofada de aquecimento e monitore o animal para reflexos de startle.
   8. Se o rato não tiver ganhado a consciência cheia 15 minutos após a administração da primeira solução do antídoto, aplique a segunda solução do antídoto pela injeção subcutaneous.
   9. Monitore animais durante a fase de recuperação.
   10. Verifique 1 – 2 h mais tarde, bem como no dia seguinte para complicações pós-operatórias. Se necessário, aplique novamente a analgesia.
   11. Para a profilaxia da infecção, adicionar sulfadoxina (concentração final 0, 8% w/v) e trimetoprim (concentração final 0, 16% p/v) à água potável a que os animais têm acesso ad libitum por 1 semana após a cirurgia.

Resultados

Este protocolo possibilita a preparação de cateteres de degrau (Figura 1) para uso no procedimento de CED em ambiente laboratorial. A fim de controlar os cateteres para vazamento, refluxo ao longo do trato de agulhas e entupimento, recomendamos a realização de injeções de um corante, por exemplo, solução de Tripan azul, em um bloco de agarose. A Figura 3 retrata uma nuvem de azul de Tripan formando após a injeção de 1 μl em 0,5 μL/minuto usando um c...

Discussão

A entrega aumentada convecção, ou a infusão pressão-negociada da droga no cérebro, foram propor primeiramente no adiantado 1990³. Esta aproximação promete a perfusão de grandes volumes do cérebro atrás da barreira do cérebro do sangue em uma maneira controlada². No entanto, até agora, apenas alguns ensaios clínicos têm sido realizados usando essa abordagem, parcialmente porque CED em uma configuração clínica mostrou ser tecnicamente exigente

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL syringe	Hamilton	7635-01
27 G blunt end needle	Hamilton	7762-01
Agarose	Promega	V3121
Atipamezol	Janssen
Bone wax	Braun	1029754
Buprenorphine	Indivior Schweiz AG
Carprofen	Pfizer AG
Dental drill bits, steel, size ISO 009	Hager & Meisinger	1RF009
Ethanol 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
Fentanyl	Helvepharm AG
FITC-Dextran, 2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
Flumazenil	Labatec Pharma AG
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775-500ML
High viscosity cyanoacrylate glue	Migros
Iodine solution	Mundipharma
Medetomidin	Orion Pharma AG
Microforge	Narishige	MF-900
Midazolam	Roche Pharma AG
Ophthalmic ointment	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647	Jackson Immuno
Scalpels	Braun	BB518
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
Stereotactic frame for mice	Stoelting	51615
Stereotactic robot	Neurostar	Drill and Injection Robot
Succrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
Topical tissue adhesive	Zoetis	GLUture
Trypan blue	ThermoFischer Scientific	15250061
Water	Bichsel	1000004