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要約

統合された細胞操作のプラットホームは周囲条件の下で個々の懸濁細胞のライン分析のための単一調査の質量分析の組み合わせの使用のために開発される。

要約

単一細胞質量分析(SCMS)は、個々の細胞レベルで広範囲の細胞種の敏感な検出と正確な分析を可能にします。マイクロスケールサンプリングおよびイオン化デバイスであるシングルプローブは、周囲条件下での細胞成分のオンライン、迅速なSCMS分析のための質量分析計と結合することができます。以前は、単一プローブSCMS技術は、主に基板上に固定化された細胞を測定するために使用され、研究のための細胞の種類を制限していました。現在の研究では、単一プローブSCMS技術は、通常体外受精に使用される細胞操作システムと統合されています。この統合された細胞操作および分析プラットフォームは、細胞選択プローブを使用して、特定された個々の浮遊細胞を捕捉し、微小スケール分解のための単一プローブ先端に細胞を移し、その後即時質量分析分析を行います。この捕捉および伝達プロセスは、分析前に周囲の溶液から細胞を除去し、質量分析におけるマトリックス分子の導入を最小限に抑えます。この統合されたセットアップは、体液サンプル(例えば、尿、血液、唾液など)に存在する標的患者単離細胞のSCMS分析が可能であり、ヒト医学および疾患生物学へのSCMS分析の潜在的な応用を可能にする。

概要

ヒト生物学、特に疾患生物学は、個々の細胞のレベルでの活動の結果であるとますます理解されていますが、液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)などの従来の分析方法は、一般的に分析に使用されています。細胞の集団から調製されたサンプルは、取得した分子情報が個々の細胞レベルの化学プロセスを正確に表すことができない。これらの標準的な従来の方法は、分析測定に対する細胞の不均一性の影響を識別することができず、細胞を破壊し、混合してリサートを調作するプロセスは、細胞の変化または損失につながる可能性があるコンポーネント1,2.従来の方法のこれらの制限は、得られたサンプルが多くの異なる細胞タイプの複雑な混合物を含むことができる患者細胞の分析において特に重要である。これらの欠陥を克服するために、単細胞質量分析(SCMS)法を含む単細胞分子解析法は、特に細胞代謝産物および低分子量のバイオアナリシスにますます開発され、適用されつつある。生体分子3,4.

開発された最初のSCMS技術は、非周囲条件2、5、6、7、8、9の下で分析を行うために真空ベースの技術を使用して開発されました。 10、11.非アンビエントSCMS技術は、細胞脂質および代謝産物を分析することができるが、人工的な条件下でサンプル前処理を必要とするため、リアルタイム分析には適していない。非アンビエント分析のためのサンプル調製プロセスは、マトリックス成分の添加を含み、この調製物は、その自然環境12から細胞成分を変更することができる。したがって、サンプリング環境に真空を必要としない周囲質量分析(MS)技術は、ほぼネイティブ環境で細胞を分析するために利用される。真空環境を持たないと、実験設計の汎用性が可能になります。カメラは、細胞プロセスを監視するために追加することができ、柔らかいイオン化技術は、各単一細胞実験4、12、13からより良い情報を受け取るために分離技術と組み合わせることができます ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 、41、42。

単一プローブSCMS法は、ほぼネイティブ環境21、43、44、45、46における生きた哺乳類癌細胞株を分析する周囲技術である。さらに、単一プローブ装置は、多細胞スフェロイドにおける細胞外分子の解析や組織のMSイメージングを含む他の質量分析用途に使用され、47、48、49 、50、51、52。しかしながら、この方法では基板上の細胞固定化が必要とされるので、懸濁細胞は、この技術3,53を用いて直接分析することができない。したがって、単一プローブSCMSシステムは、患者の血液または他の体液から単離された非付着性細胞株または懸濁細胞のような非付着性単一細胞を直接サンプリングするために使用することができなかった54。本研究では、統合細胞操作プラットフォーム(ICMP)を単一プローブSCMS技術と組み合わせて、最小限のサンプル調製でオンラインで懸濁細胞を分析する(図1)46。ICMPは、細胞選択を監視する反転顕微鏡、ガラス細胞選択プローブ、個々の浮遊細胞を捕捉するマイクロインジェクター、細胞温度を維持する加熱プレート、空間を制御する2つの細胞操作システムで構成されています。ガラス細胞選択プローブとシングルプローブの両方の動きと、細胞選択プローブ先端から単一プローブ先端への細胞移動を観察するデジタル顕微鏡。単一プローブの製造は、以前の出版物で詳しく説明されており、ここでは21,48については説明しません。ICMP/シングルプローブシステムは、高解像度質量分析計に結合されています。この統合されたセットアップは、マトリックス分子からの最小限の効果で複雑な生物学的サンプルから同定された単一細胞のサンプリングを可能にします。

プロトコル

1. ガラス細胞選択プローブ製作

  1. シングルボアガラスチューブを鋭利な先端でテーパードプローブに変換します。
    1. シングルボアガラスチューブ(ID:0.3mm、OD:1.1.mm)を垂直ピペットホルダーのクランプに入れ、加熱コイルに対してガラスを中心に締め付け、チューブを固定します。加熱コイルは、金属棒(直径=3.90mm)の周りに巻かれた18ゲージのニッケルクロム抵抗ワイヤー(長さ約60mm)で構成され、2.5倍です。
    2. ガラス管に温度プログラム19.5(メーカーの単位)を設定します。このパラメータは、特定の計測器に対して変更できます。
    3. ソレノイドプランジャーを4(メーカーユニット)にセットします。このパラメータは、特定の計測器に対して変更できます。
    4. ソレノイドを引き起こしてガラス管を引っ張ります。このステップでは、先端に融合した2つのプローブが作成されます。
    5. ピンセットを使用して各プローブの先端から約1mm離し、プローブ先端に直径約10μmのオリフィスを作成します。
  2. ICMP/シングルプローブSCMSセットアップに簡単にカップリングするためのガラスプローブを曲げます。
    1. 引っ張られたガラスプローブをマイクロフォージにセットし、先端をプラチナ加熱ワイヤーの上に約3mm上に置きます。
    2. 白金線の熱を最高温度の30%にします。
    3. プローブを元の位置から~45°曲げる(図2)。

2. 統合されたセル操作プラットフォームアセンブリ

  1. 反転顕微鏡、マイクロインジェクタ、および2つの細胞操作システムを電動テーブル上に置き、質量分析計と容易に結合します。
    1. 端部をアーム クランプに置き換えることで、単一プローブに対応するようにセル操作システムの 1 つを変更します。
    2. マイクロインジェクターにミネラルオイルを充填するには、針でプラスチック製の注射器を使用します。これは吸引に影響を与えるので、チューブ内の気泡を避けてください。
    3. 反転顕微鏡のステージインサートを加熱プレートに交換します。分析前に加熱プレートを37°Cに設定します。
  2. ガラスセル選択装置を設定します。
    1. マイクロインジェクターの金属ホルダー内にガラスセル選択プローブを挿入し、長い(曲げのない)側をキャピラリーホルダーに入れ、ネジを締め付け、プローブを所定の位置に固定します。プローブ先端の角度を加熱プレートに平行に配置します。
      注意:ガラスプローブは非常にシャープで壊れやすく、簡単に壊れます。マイクロインジェクターにプローブを挿入する際は、目を保護し、特に注意してください。
    2. マイクロインジェクターの金属ホルダーをセル操作システムに固定します。プローブ先端を反転顕微鏡光の中央付近に配置します。

3. 質量分析計の入り込み用に拡張イオン転写管を作成する

  1. 金属カッターを使用して、ステンレス鋼チューブ(OD:0.0625(1/16))で、ID:0.021インチ)~250mmの長さで切断します。
  2. 端部から135mmを測定し、金属の野生を配置するので、〜135ミリメートルは大気にさらされ、〜115ミリメートルは質量分析計の内部になります。2つのレンチを使用して野生を固定し、それを締めます。

4. ICMPをシングルプローブ設定と組み合わせて

  1. シングルプローブを含むガラススライドをセル操作システムのアームクランプに固定します。
    注:単一プローブは、現在の研究で2つのマイナーな変更を伴う以前に公開されたプロトコル48に従って製造される:ナノESIエミッタは質量分析計への容易な結合のために長く作られ、単一のプローブはガラスに接着されるガラスセル選択装置の空間的な動きに干渉しないように、右側の側(図2)。
  2. 溶剤を供給する毛細血管を導電性組合に接続し、毛細血管をプラスチックフェルールのスリーブ(1/16 x .005インチ)に入れ、フィッティングを指で締める。
    1. 導電性ユニオンの反対側をキャピラリー(ID:40 μm、OD:150 μm)に接続し、サンプリング溶媒を含むシリンジに接続し、キャピラリーをスリーブ(1/32 x.007インチ)に入れ、フィッティングを締めます。これらの実験では、0.1%ギ酸を含むアセトニトリルをサンプリング溶媒として使用します。
      注:サンプリング溶媒は柔軟ですが、主に急速なマイクロスケール細胞溶解のためにアセトニトリル(またはギ酸を含むアセトニトリル)を含む必要があります。
    2. 質量分析計のシリンジポンプにシリンジを固定します。
    3. 電導性ユニオンに取り付けられた銅線の上にイオン化電圧コードを置きます。
  3. ナノESIエミッタを拡張イオン転写管のオリフィスに約1mm置きます。
    1. 細胞操作システムを使用して、シングルプローブの空間的な動きを制御し、拡張イオン転送チューブの前にナノESIエミッタを中央に配置します。

5. 中断された細胞サンプルの調製

  1. 分析の前日(〜18〜24時間)、細胞培養フラスコ(T25)で試験用の細胞を種を出す。K562ヒト骨髄性白血病細胞を本研究のモデルとして用いられる。
    1. 熱1xリン酸緩衝生理食生(PBS)とロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地は、10%合成ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン連鎖マイシンを30分間30分間補充した。
    2. 細胞を温暖培地と組み合わせて10mLの総体積でシード~1×106細胞を播種する。一般に、10mLピペットを使用して、8 mLのRPMI培地を細胞培養フラスコに入れます。次いで、2mLピペットを用いて、2mLのコンフルエントK562細胞を~1x106細胞用の培地に入れる。
    3. 分析するまで37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。
  2. 分析用にセルを準備します。
    1. 細胞培養フラスコから15mL遠心管にピペット細胞を入れます。
    2. 400 x gと37 °Cで5分間セルをスピンダウンし、上清を廃棄します。
    3. 所望の治療濃度で薬物化合物を含有するRPMI培地の4mLで細胞を再懸濁する。
      注: コントロールセルの解析では、RPMI 培地の 4 mL でセルを再中断し、ステップ 6にスキップします。
    4. 37°Cおよび5%CO2で処理時間の持続時間のために細胞をインキュベートする。
    5. 400 x gと37 °Cで5分間セルをスピンダウンし、上清を吸引します。
    6. 細胞はPBSの10 mLで再懸濁し、遠心分離機は400 x gおよび37°Cで5分間である。回転後、上清を捨てます。細胞外成分からの薬物の検出を最小限に抑えるために、この手順を3回繰り返します。
    7. 分析のためにPBSの4 mLで細胞を再中断する。

6. ICMP/シングル・プローブ・セットアップを使用してSCMS測定を実行する

  1. 実験用の質量分析計のパラメータをカスタマイズします。
    1. 計測器ソフトウェアの[スキャンモード]見出しで、[スキャンの定義]を選択します。m/z 400、1マイクロスキャン、100ミリ秒の最大射出時間、自動ゲイン制御(AGC)で60,000 m/mの解像度を使用します。実験には100~1000の質量範囲(m/z)を利用した。パラメータは、計測器モデルに基づいて変更できます。
    2. シリンジポンプでは、150 nL/minの流量を選択し、各実験に最適化する必要があります。
    3. NSIソースを選択し、約4.5 kVの電圧を印加します。このパラメータは、実験ごとに最適化する必要もあります。
  2. 反転顕微鏡(トッププレートとボトムレンズの両方に40倍の倍率を選択)をオンにし、ノートパソコンのUSBポートに接続してライブビデオフィードをキャプチャします。加熱プレートの電源を入れ、37°Cに設定します。
  3. コンピュータで[データの取得]タブに移動し、[取得時間]の下にある [継続的に]を選択します。
  4. 分析用のサンプルを準備します。
    1. 小さいペトリ皿(35 mm x 12 mm)のふたにサンプルのピペット2-3 mL。
    2. 6.4.2 加熱されたプレートの上に反転顕微鏡から光の中心にサンプルを配置します。
  5. 分析用のガラスセル選択プローブを準備します。細胞操作システムを使用してプローブを動かして、先端が細胞と同じ平面内の反転顕微鏡の下に集中するようにします。
  6. 分析用に個々のセルを選択します。
    1. セル操作システムを使用して、セル選択プローブの先端をターゲットセルに移動します。このプロセスは、反転顕微鏡を使用して監視されます。
      注: セル選択プローブの先端をセルと同じ平面に集めることができない場合は、プローブの曲がった部分が適切に角度付けされていない可能性があります。両方のプローブの先端が顕微鏡下の細胞と一緒に焦点を合わせることができるまで、細胞選択プローブの位置を調整します。
    2. マイクロインジェクターのハンドルをそっと回して、チューブ内の鉱物油の位置を調整します。マイクロインジェクターによって穏やかな吸引が提供され、標的細胞を細胞選択プローブ先端に固定します。
      注:吸引力を介して細胞選択プローブで細胞を捕捉できない場合は、細胞選択プローブをチェックして、毛細管ホルダーに完全に挿入されていることを確認してください。また、マイクロインジェクターとチューブ内の鉱物油レベルを検査し、空気があれば排出します。
    3. 細胞操作システムを使用して、単一プローブ先端に焦点を当てたデジタル顕微鏡を使用して、細胞選択プローブ先端の細胞を単一プローブ先端に移動させ、このプロセスを監視します。触れると、単一プローブ先端の小さなアセトニトリル液滴が細胞の急速なlysesを誘発し、その後、細胞リサートは、オンラインMS分析のために直ちにイオン化されます。
      注: 選択したセルは、穏やかな吸引を通じてセル選択プローブの先端に固定されているため、このセルはシングルプローブ先端への転送中にデタッチされる可能性があります。したがって、典型的な細胞脂質のイオンシグナル(以下の代表的な結果を参照)が5s以内に観察されない場合、細胞が取り付け解除され、異なる細胞の選択が必要となる可能性がある。

結果

まず、未処理のK562細胞を用いて実験方法を確立する。典型的なSCMS実験では、細胞の転写、細胞内容の検出中、および測定終了後の質量スペクトルの明らかな変化が観察される(図S1)。PC(34:4)(m/z 754.536)、PC(36:4)(m/z 782.567)、PC(m/z 882.583)の3つの一般的な細胞脂質ピーク(ホスファチジルコリン、PC)を含む3つの一般的な細胞脂質ピークは、細胞が正常に転送され、細胞細胞であることを確認するために監視されます。 内容物が検出される (図 S2)21,43,46,55,56.脂質ピークが5秒以内に見られない場合、マイクロインジェクター内のミネラルオイルレベルは、細胞選択プローブ先端で細胞を保持する吸引を減少させるために変更されます。細胞選択プローブからミネラルオイルが押し出されないように注意する必要があります。m/z 750-850の質量範囲における多くのPCの同一性は、未処理細胞リサートサンプル上のMS/MSを用いて確認された(図3、図S2、表1)46。

K562細胞はまた、方法の汎用性を拡大するために種々の薬物化合物による治療を行う。K562細胞は、それぞれ4時間および2時間の間、1時間とOSW-1(100nM、1 μM)のゲムシタビン(1 μM)とタキソール(1 μM)でインキュベートされます。細胞は、その後、細胞外含有量からの薬物化合物の検出を最小限に抑えるためにPBSで洗浄されます。細胞内容物の質量スペクトルに対するマトリックス(例えば、細胞培養培地からのイオン、PBS、溶媒)の寄与は、その著しく異なるイオン信号のために、データ減算を通じて排除することができる(図S3)。3 つの薬剤化合物はすべて、ICMP/シングルプローブ MS セットアップ (図 S4)46を使用して検出されます。これらの結果は、この方法が、ほぼネイティブ環境の溶液中の細胞から単細胞レベルで細胞内脂質、薬物、代謝産物を研究するために使用できることを示唆している。

figure-results-1422
図 1.単一懸濁液細胞MS実験の実験セットアップ。(A) 質量分析計と結合された統合細胞操作プラットフォーム(ICMP)。(B) 懸濁細胞の分析のための回路図。(C) 細胞選択プローブを用いて選択するK562細胞の実験図。Standke et al.46の許可を受けて転載。著作権2019アメリカ化学会。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-1958
図 2.単一懸濁細胞MS実験に利用される改変単一プローブおよび細胞選択プローブの写真。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2293
図 3.代表種(m/z 750-850)を示す単一細胞からのズームイン質量スペクトル。化学構造はMS/MS分析を用いて確認される(図S1)。Standke et al46の許可を受けて転載。著作権2019アメリカ化学会。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

薬物分子*m/z質量誤差(ppm)
[ゲムシタビン + H]+ 264.076の11.32年
[タキソール + ナ]+ 876.3182.74分
[OSW-1 + Na]+ 895.445の0.89円
細胞脂質
[PC(34:4) + H]+ 754.535の3.71
[PC(34:3) + H]+ 756.551の3.44
[PC(34:2) + H]+ 758.569の0.66年
[PC(36:5) + H]+ 780.551の3.07
[PC(36:4) + H]+ 782.568の2.17
[PC(36:3) + H]+ 784.585の0.64年
[PC(38:7) + H]+ 804.551円4.1年
[PC(38:6) + H]+ 806.567の2.48件
[PC(38:5) + H]+ 808.5832.72分
[PC(38:4) + H]+ 810.6010
[PC(40:7) + H]+ 832.583の3.12

表 1.ICMP/シングルプローブの設定を使用して、細胞成分を特定しました。全ての薬物化合物の検出は、MS/MS結果を標準化合物と比較することによって確認した。

ディスカッション

統合された細胞操作および分析のプラットホームは単一調査MS法の多様性を拡大するために組み立てられ、ほぼネイティブ環境の非付着細胞のライン、急速な分析を可能にする。この技術の主な利点は、最小限のサンプル調製が必要なため、細胞は標準状態を模倣した条件で分析されるということです。特に、対象となる個々の細胞を視覚的に同定して選択し、自然環境下で細胞を維持しながらMSイオン化効率に及ぼすマトリックス効果の影響を最小限に抑えることができるため、その結果はより代表的な細胞のネイティブ化を図る。ステータス (図 S3)この技術は、将来の研究で生体流体に懸濁された患者細胞を研究するために潜在的に使用することができる。この技術のもう一つの利点は、サンプリング溶媒の柔軟な選択です。マイクロスケール溶解が迅速に起こることができるように、主なサンプリング溶媒としてアセトニトリルを含むことが重要です。潜在的には、内部基準(例えば、同位体標識薬物化合物)をサンプリング溶媒に添加して、個々の細胞から目的とする分子(例えば、薬物分子)を定量し、革命に重要な役割を果たすことができる。将来の薬物治療をパーソナライズする54.

この統合システムは、広範囲の細胞を分析するために便利に使用できますが、この方法の限界は、単一プローブも細胞選択プローブも市販されていないことです。各実験の前に、多くのパラメータ(流量、電圧、ナノESIエミッタとイオン転写チューブ間の長さなど)の最適化の必要性を指示する。さらに、単一プローブおよび細胞選択プローブの小型化により、環境摂動(例えば、気流)が2つのプローブ間の接合点を確立するのが困難になる可能性があります。短期的な解決策は、テーパリングの長さを最小限に抑えるために、セル選択プローブの曲げを端に近づけることです。将来の作業は、環境への影響を最小限に抑えるために、セットアップの重要な部分を囲む住宅の開発が含まれています。細胞内容量が限られており、細胞からの取得時間が短い(~2~3秒)ため、MS/MS分析は比較的豊富な種に対してのみ行うことができます。検出感度に影響を与える他の要因としては、拡張イオン転写チューブを介した細胞および潜在的なイオン損失と共にマトリックスの導入によるイオン化効率の抑制が含まれる。

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、懸濁細胞と細胞リサート実験の両方のサンプル製剤の開発におけるナガ・ラマ・コタカリの研究に感謝している。さらに、著者らはNIH(R01GM116116およびR21CA204706)の資金調達に感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetontrileMillipore Co.AX0145-1Sampling solvent
CellTram VarioEppendorf6221ICMP
Copper wirestores.ebay.com/jewelerheavenDead soft, round, 20 guage, 25 ftConductive union setup
Digital stereomicroscopeShenzhen D&F Co.Supereyes T004Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µLRochester Scientific5065Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12"Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QSingle-probe fabrication
Epoxy resinDevconPart No. 20945Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation systemEppendorfTransferman NK517800397-U.R.ICMP
External nutVALCO*CHEMINERTEN1Ion transfer tube fabrication
Formic acidSigma-Aldrich399388-500MLSampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µmPolymicro TechnologiesTSP040105Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µmPolymicro Technologies1068150015Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS)Fischer SciSH3006603Cell culture
Inline MicroFilterIDEX Health & Science LLCM-520Conductive union setup
Laser pullerSutter Instrument Co.Model P-2000Single-probe fabrication
LED UV lampFoshan Liang Ya Dental EquipmentLY-C240Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometerThermo ScientificLTQ Orbitrap XLAnalysis
MicroforgeNarishige, Co.MF-9Cell-selection probe fabrication
MicrounionIDEX Health & Science LLCM-539Conductive union
PEEK tubing, 1/32x0.005x 5ftIDEX Health & Science LLC1576Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32x0.007x 5ftIDEX Health & Science LLC1577Conductive union setup
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies15140-122Cell culture
Petri dish, 35x10 mmVWR25382-334Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR0780-50LCell culture
Platinum wireNarishige, Co.Model PT-AMicroforge
Power supplyNikonPSM-2120ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagroCorning10-104-CVCell culture
Single-bore tubesBoralex5065Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" ODIDEX Health & Science LLCVHP-200-01xIon transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cmIDEX Health & Science LLCU-1128Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µLHamilton1725LTN250ULSampling syringe
T25 flaskCellStar690160Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flangeNew ObjectivePB5500Analysis
ThermoPlateTokaiHit55R30NICMP
TrypLE ExpressGibco12605-010Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steelSUPELCO58692-UIon transfer tube fabrication
USB digital photography microscopedx.comSO2 25~500XAnalysis
UV curing resinPrime DentalItem No. 006.030Single-probe fabrication
Vertical pipette pullerDavid Kopf InstrumentsModel 720Cell-selection probe fabrication
Voltage housingPicoChipPCH-A00120ICMP/MS interface
Wire cutterCraftsman4 1/2 in end nipperConductive union setup

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