免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成

要約

オルソトピックヒト肝転移性ブドウ球色黒色移植マウスモデルは、培養ヒトブドウ色腫細胞株を用いた患者由来腫瘍チャンクおよび針注射技術を用いた外科的オルトトピック移植技術を用いて作成された。

要約

ここ数十年、皮下移植患者由来異種移植片腫瘍または培養ヒト細胞株は、従来の確立されたヒト細胞よりも免疫不全マウスにおけるヒト癌を研究する代表的なモデルとしてますます認識されているインビトロの行。近年、マウスに直交移植患者由来腫瘍異種移植片(PDX)モデルが開発されており、患者腫瘍の特徴をより良く複製することが挙げられる。肝臓の正接異種移植片マウスモデルは、腫瘍生物学と薬物療法に関する洞察を提供する有用な癌研究プラットフォームであることが期待される。しかしながら、肝臓の正形トピック腫瘍移植は一般に複雑である。ここでは、患者由来肝転移性うveveal黒色腫腫瘍のオルソトピック移植のためのプロトコルについて説明する。ヒト肝転移性ブドウ球色黒色腫細胞株を免疫不全マウスに培養した。このプロトコルは、患者由来のブドウ色腫腫瘍の塊を持つ外科的オルトトピック移植技術または培養ヒト細胞株を用いた針注入技術のいずれかを用いて、一貫して高い技術的成功率をもたらすことができます。また、内部肝腫瘍を検出するCTスキャンや、再移植を達成するために凍結保存腫瘍を用いた再移植技術についても説明する。一緒に, これらのプロトコルは、翻訳研究における肝転移性ウVEVE性黒色腫の肝直芽性腫瘍マウスモデルのためのより良いプラットフォームを提供します。

概要

うびよ黒色腫は、西洋世界の成人の間で最も一般的な眼内悪性腫瘍である。過去50年間、米国1、2では、ウベル黒色腫(100万人当たり5.1例)の発生率が安定している。うまん性黒色腫は虹彩、毛様体、または甲状腺のメラノサイトから生じ、転移を発症すると非常に致死性の疾患である。うびろ黒色腫転移患者の死亡率は、転移の初期診断後2年で1年で80%、2年で92%であった。転移と死亡の診断の間の時間は、典型的には、^治療3、4に関係なく、6ヶ月未満の短い。癌は血液を介して広がり、肝臓に支配的に転移する傾向がある(89-93%)4、5。肝転移性うveal黒色腫のさらなる調査には、効果的なマウスモデルが緊急に必要である。翻訳研究のために、肝局在性転移性うveanomaマウスモデルを生成する明確な需要がある。

患者由来腫瘍異種移植片(PDX)マウスモデルは、個別化医療戦略を提供することが期待される。これらのモデルは、臨床結果の予測であり得る、 前臨床薬物評価に有用であり、^腫瘍6の生物学的研究に使用される。代表的なPDXモデルは、皮下部位に腫瘍を有する子宮外腫瘍移植異種移植マウスである。ほとんどの研究者は、特別な^練習7、8なしで皮下移植のための手術を行うことができます。彼らはまた、皮下腫瘍を容易に監視することができます。皮下PDXモデルは研究段階で普及しましたが、実用化に向けていくつかのハードルがあります。皮下移植は、患者由来の腫瘍を腫瘍起源とは異なる微小環境で生着させ、生着障害および遅い腫瘍増殖9、10、11につながる^{ようにする。 12、13、14}.直交移植は、元の^{腫瘍15、16}と同じ器官を使用するので、PDXモデルにとってより理想的で合理的なアプローチであり得る。

最近では、培養ヒト肝臓転移性ブドウ色黒色腫細胞株をNODで培養した患者由来肝転移性ブドウ色腫腫瘍の外科的オルトトピック移植技術と針注射技術のプロトコルを開発した。Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) マウス^17,18.プロトコルは、一貫して高い技術的成功率をもたらす。また、内部肝腫瘍の検出に役立つCT走査技術を確立し、PDXプラットフォームで凍結保存腫瘍の再移植を開発しました。我々は、ウVEAL黒色腫腫瘍異種移植片モデルが、組織病理学的および分子的特徴を含む元の患者肝腫瘍の特徴を維持することを見出した。これらの技術は、翻訳研究における子宮頸黒色腫の肝直芽腫瘍モデルのためのより良いプラットフォームを提供する。

プロトコル

研究に登録された患者は、機関審査委員会承認のプロトコルによると、研究目的および遺伝学的研究のために廃棄された外科サンプルの使用を可能にする書面による同意を提供すべきである。このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に厳密に従って行われ、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 新鮮な患者由来腫瘍組織の収集

1. 病院の手術室で手術または針生検から患者由来の腫瘍組織を得る。
2. ハンクスのバランスのとれた塩溶液(HBSS)溶液を氷の上に入れた100mLの容器に腫瘍組織を入れます。
3. 実験室で組織を無菌フード(バイオセーフティレベル2)に移す。
4. できるだけ早くステップ 2 に進みます。
   注:安全上の理由から、既知のHIVまたはB型肝炎またはC型肝炎感染の患者を除外する。

2. 新鮮な患者由来腫瘍組織の処理

1. 氷上にリン酸緩衝生理食塩糸(PBS)を含む50mLチューブに組織を入れます。組織を洗浄するには、チューブにPBSを加え、チューブからPBSを2回捨てます。
2. 氷上のPBSを含むペトリ皿に組織を移します。
3. 滅菌鉗子とはさみを使用して、組織の壊死部分を取り除きます。ステップ2.3~2.5の間、ティッシュを湿らせて冷たく保ちます。針生検サンプルの場合は、ステップ2.3および2.5をスキップし、サンプルをカットしないでください。
   注:壊死組織は触れると分解しやすいことが多い。
4. 外科的肝臓移植のために組織を1mm³立方体に切断する。
5. 残りのティッシュをペトリ皿の2mmの立方体に切ります。
6. 組織学的分析用に4%ホルマリンを備えた1.7mmマイクロチューブと、ゲノムおよびプロテオミクス解析用の別のチューブに転送します。
7. 液体窒素入りの液体窒素瓶にマイクロチューブを入れます。チューブを-80°Cの冷凍庫に移して永久保存します。
   注:患者からのサンプル除去と組織処理の間の時間は30分を超えてはならない。

3. 患者由来腫瘍組織による外科的肝臓移植

1. 70%エチルアルコールで手術のためにフードに入ってくるすべてのオブジェクトをスプレーします。
   注:これには外科用器具、暖房パッドおよび麻酔機械が含まれる。
2. 綿棒と布シートの重量を測定します。
3. 誘導室に入れて3~5%のイソフルラン気化器でマウスを麻酔します。
4. マウスが完全に麻酔されたら、加熱パッド上の位置に置きます。マウスのスネアウトにアイソフルランコーンを置き、麻酔の維持のために1.5~3%のアイソフルランを吸入します。
   注:マウスは、手順全体の間に加熱パッド上にある必要があります。暖房の欠如は低体温症を引き起こす可能性があります。
5. マウスの足が超微細鉗子で刺されたとき、反応なしで適切な麻酔を確認します。
6. 外科手術前にマイクロシリンジに27G針を使用して、脇腹にブプレノルフィン(0.6 mg/kg)を皮下注射する。
7. 腹部に70%エチルアルコールを適用し、毛皮を上下に広げます。毛皮を広げた後、より簡単にカットするために、左肋下領域の下の皮膚のより容易な可視化を確認します。腹部から毛皮を剃らないでください。
   注:毛皮は、手術後に切開部位を隠し、マウスが切開後の手術を引っ掻くのを防ぎます。しかし、機関の基準に従って切開部位の感染を防ぐために毛皮を剃ることができます。
8. ヨウ素を塗布し、皮膚に吸収させます。
9. マウスに2cmの穴を開けた滅菌手術用ドレープを置きます。
10. 湾曲した超微細鉗子で腹部の皮膚を持ち上げ、湾曲したはさみで1cmの横肋下皮膚切開を行います。
11. 切開の皮膚の下に湾曲したはさみの先端を挿入し、少し開いて腹腹を皮膚から分離します。閉じた刃で切開部からはさみを引き込みます。
    注:マウスの内側のはさみを開閉すると、損傷や出血を引き起こす可能性があります。
12. 腹腹腹の下に肝臓を見つける.腹腹を通して濃い赤みがかった色を確認します。
13. 湾曲したはさみで、腹腹蓋に1cmの横方向の切開を行います。腹動脈が最先端から出血した場合は、直ちに焼灼法で出血を止める。
14. 片手で湾曲した超微細鉗子を使用して脂肪組織をつかみ、左肝葉の下に綿棒の端を挿入し、もう一方の手で綿棒を下方に転がして肝臓を引き出します。
    注:脂肪組織をつかむことは、脂肪組織が綿棒に付着しないようにすることが重要です。
15. 綿棒の上に肝臓を外装し、不織布の上に肝臓を置きます。
    注:ファブリックシートは、肝臓を安定させ、出血を吸収する上で2つの重要な役割を果たしています。
16. 滅菌No.11メスブレードを使用して幅と深さ5mmの切開を行い、綿棒で切開部位を柔らかく押しながら、毛様腫にポケットを形成します。
    1. ブレードを肝臓の表面と平行に挿入し、水平に切断します。
    2. 綿棒で切開部位を押して出血を止める。
       注:ブレードを垂直に保つな、そうでなければ肝臓を突破し、肝臓の真ん中に大きな血管を傷つける。
17. 綿棒を上方に転がして切開部位を開き、1mm³立方体の腫瘍組織を湾曲した超微細鉗子でポケットに埋め込む。綿棒を逆回転で転がしながら鉗子を引き込み、押し下げる。
    注:鉗子を引き込みながら綿棒で切開部位を押し下げると、ポケットの中の腫瘍の変位を防ぐのに役立ちます。
18. 着床後、綿棒を切開部位からそっと取り出します。できるだけ早くステップ 3.19 に進みます。
19. 切開部位に吸収可能な止端を置きます。
20. 止血を確認します。出血が続く場合は、切開部位に止血剤を追加します。
21. 鉗子(好ましくは鈍い終わり)で生地のシートから肝臓を剥がし、肝臓を腹腔に戻す。
22. 5-0吸収性縫合糸を使用した二重合字の縫合腹系。
23. 5-0吸収性縫合糸を用いたトリプル合字付き縫合皮膚。
    注:三重合字は外科的切開の解力の変形を防ぐのに役立つ。
24. 完全に目が覚めるまでマウスを観察し、ケージに戻します。
25. 手術中の出血量に対して、綿棒と生地シートの重量を血液で測定します。手術前の元の体重と比較してください。手術中の出血をマウスの循環血液量の10%未満に減らす。

4. 培養ヒト肝臓転移性ブドウ球色黒色腫細胞株の収集と処理

1. 培養細胞を調製する。
2. セルを収集し、セル カウンタを使用してセル番号を計算します。
3. 15 mLチューブ内の10.0 x 10⁶細胞に対して適量の細胞懸濁液を調製します。
4. 室温で遠心分離機で300 x gでチューブを5分間回転させます。
5. 15 mLチューブの上清を取り除き、セルペレットはチューブの底に置いておきます。
6. 50 μL の RPMI 1640 培地を 1.7 mL チューブに追加します。
7. 200°L先端の先端をはさみで切り、先端の開口部を拡大します。
8. RPMIを持つ1.7 mLチューブに、カット先端のピペットを使用して60°Lの基底膜マトリックスを追加します。
9. 1.7 mLチューブにRPMIとマトリックスを混ぜます。ボルテックスだ
10. 混合物の110 μLを15 mLチューブ内のセルペレットに加えます。セル懸濁液を新しい1.7 mLチューブに移します。
11. 針注射の前にチューブを氷の上に置いておきなさい。

5. 培養ヒト肝臓転移性ブドウ球色黒色腫細胞株の肝臓への外科的針注入

1. 手順 3.1 から 3.15 までの上記のプロトコルに従います。
2. 27 G針でマイクロシリンジで細胞懸濁液を回収します。
3. 肝臓の表面に沿って針を挿入し、針の先端を5mm深く進めます。
4. 肝臓に20μLの細胞懸濁液を注入する。
5. 肝臓の挿入点を焼灼して、注射された細胞が漏れるのを防ぎます。止血を確認します。
6. 手順 3.21 から 3.24 までの上記のプロトコルに従います。

6. CTスキャン

1. マウスを目覚め状態の拘束器に入れ、
2. 消毒と血管拡張のための無菌アルコールパッドで尾を拭きます。
3. 1 mLの注射器に27G針で尾静脈を通してCT造影剤の100μLを注入する。
4. CTスキャンを行う前に、注射後4時間待ちます。
   注:薬剤が肝臓クッファー細胞によって取り込まれるまで4時間かかります。
5. 注射の4時間後、3~5%の気化したアイソフルランを誘導室に入れて腫瘍軸受マウスを麻酔する。
6. マウスが完全に麻酔されたら、CT上の傾向のある位置に置き、マウスのスーンにアイソフルランコーンを置き、麻酔の維持のために1.5〜3%のアイソフルランを吸入します。
7. マウスの足が超微細鉗子で刺されたとき、反応なしで適切な麻酔を確認します。
8. CTスキャンを15分間行います。
9. CTスキャン後に完全に覚醒するまでマウスがケージに戻したことを確認します。
10. 腫瘍の存在を評価し、CT画像上の腫瘍サイズを測定する。
    注:造影剤は、正常な肝性毛腫を増強し、非増強腫瘍を認識しやすいようにする。胆嚢と胃を腫瘍と誤解しないでください。

7. 組織の収穫と処理

1. CO2を使用してマウスを安楽死させ、その後、人差し指と親指を頭蓋骨の後ろに置き、尾の基部で体を引っ張ることによって、子宮頸部脱臼を行う。できるだけ早く手順 7.2 に進みます。
2. マウスを脊椎の位置に置き、70%エチルアルコールで腹部をスプレーします。
3. 滅菌鉗子と滅菌ハサミを使用して、腹部器官を露出させるために、xiphoidプロセスの下に3cmの横方向の切開を行います。
4. 腫瘍組織を取り出し、工程2.1~2.2を行う。
5. 残りの腫瘍をペトリ皿の2mmの立方体に切ります。
6. 凍結保存後の再移植のために極低温チューブに移す。
7. イソプロパノールで満たされた極低温凍結容器にチューブを入れます。
8. 容器を-80°Cの冷凍庫に移して一時保管します。凍結培地を含む凍結管を液体窒素タンクに直接入れないでください。腫瘍組織を保存するために-1°C/分の冷却速度でゆっくりと凍結します。
9. 翌日、チューブを液体窒素タンクに移し、永久保存します。

8. 再注入

1. 液体窒素で凍ったチューブを液体窒素で固留め、組織を移植する準備ができるまで保管してください。生存率を維持し、生着の可能性を高めるために、室温への組織の暴露を最小限に抑えます。
2. 37°水浴で凍結保存チューブを解凍します。
3. 手順 2.2 ~ 2.4 を実行します。
4. ステップ3.1~3.24に記載されているように、解凍した腫瘍をマウスに移植します。

結果

肝臓ポケット法を用いた外科的オルトトピック移植は、ヒト肝臓転移性うveveal黒色腫腫瘍を6ヶ月以内に80%の高い成功率でマウス肝臓に移植することができる。異種移植片腫瘍は、娘結節のない孤独な腫瘍として肝臓に生着する(図1および図3A)。マイクロニードルを用いた肝臓への外科的オルトトピック注射技術は、全症例?...

ディスカッション

現在のオルソトピック異種移植モデルは、手間がかかり、時間がかかり、作成にコストがかかります。肝臓癌に対する直交性腫瘍異種移植片マウスモデルは、20年以上前に確立された^19,20,21.しかし、この技術は複雑であり、マイクロニードルホルダーや6-0~8-0などの特殊な機器を使用する必要があります。顕微鏡の下の細か...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip