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要約

ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。

要約

髄膜炎(髄膜炎)は狭い宿主範囲の微生物であり、世界的に細菌性髄膜炎の主な原因として認識されています。髄腔球菌は、健康な被験者のおよそ10%のヒト鼻咽頭の一過性の植民地である。特に状況では、粘膜関門を貫通する侵襲的な能力を獲得し、敗血症を引き起こす血流に侵入する。最新のケースでは、髄炎の結果的な発症がなくても、敗血症のフルミネリングが発生する可能性があります。逆に、細菌は血流の中で十分に増殖し、血液脳関門を通過し、中枢神経系に達し、フルミナント髄炎につながる可能性があります。細菌性髄炎のマウスモデルは、宿主と病原体の相互作用を調査し、この致死性疾患を引き起こす病因のメカニズムを分析するのに有用なツールを表す。しかし、過去数十年間にいくつかの実験モデルシステムが評価されてきたが、これらのいずれも髄膜炎球菌疾患の特徴的な病理学的事象を再現できなかった。この実験プロトコルでは、細菌の不必要な接種に基づくマウスモデルにおける髄膜炎球菌性髄膜炎の誘導に関する詳細な手順について説明する。ヒト髄炎の特異な徴候は、臨床パラメータ(例えば、温度、体重)の評価、生存率の評価、微生物学的分析および脳損傷の組織学的検査を通じてマウス宿主に記録された。インティリテーラーナル(i.cist.)接種を使用する場合、髄膜球菌はシステナマグナに直接完全に送達し、脳組織における非常に効率的な髄膜炎球菌複製をもたらす。約18時間で生存可能な数の生存率の1,000倍の増加が観察される。さらに、髄膜球菌は脾臓、および感染したマウスの肝臓にも見られ、肝臓が髄膜炎球菌複製の標的器官を表す可能性があることを示唆している。

概要

ナイセリア髄膜炎は、世界中の人間集団における髄膜炎および敗血症の最も一般的な原因の1つとしてよく知られている、ヒト宿主に限定されたグラム陰性β-プロテオバクテリウムである。健康で無症候性の担体(人口の2~30%)の上気道(鼻と咽喉)を植民地化しますが、細菌は時々様々な宿主の免疫防御を回避し、血流から脳に広がり、制御されない局所を引き起こします髄膜炎菌性髄膜炎として知られている炎症。宿主と細菌因子の組み合わせは、侵襲的な行動1への収容者からの移行に寄与しているように見える。

N. 髄膜炎は、ヒトの植民地化と感染に特化しています。それは狭い宿主範囲を有し、したがって、ヒト髄膜炎菌性疾患を再現する適切な動物モデルの欠如による生体内病因の研究に限られている。その結果、髄菌によって引き起こされる敗血症および髄炎の病因に関する理解の根本的なギャップにつながっていた。過去数十年の間に、多くのin vitroシステムの開発は、いくつかの髄膜炎球菌毒性因子2、3、4の同定を可能にした。これらの貴重な研究は、髄膜炎球菌感染の成功に対するこれらの因子の役割を理解するための重要な洞察を提供したが、これらのモデルは、体液性および細胞との細菌相互作用の結果の評価を可能にしなかった免疫システムと組織全体でさらに少ない.感染の生体内動物モデルは、ワクチン製剤によって与えられる保護度の評価のためにも大きな関連性がある。ヒト-熱帯病原体として、髄膜球菌は、表面構造(すなわち、IV型ピリおよび不透明性タンパク質)およびヒト受容体および輸送タンパク質の鉄取り込みシステム(すなわち、トランスフェリンおよびラクトフェリン)5、6、7は、適切に付着し、生き残り、ヒト宿主に侵入する。最後に、病原体の遺伝的変動能力は、ヒト免疫応答を回避および/またはブロックし、さらに高種のトロピズム8、9に寄与する。したがって、相互作用に関与する特定の宿主因子の欠如は、病原体のライフサイクルのステップを遮断し、髄膜炎球菌ライフサイクルを要約する小動物モデルの開発において重大な困難を確立する可能性がある。

過去数十年にわたり、髄膜炎菌感染周期に対する理解を深めるために、いくつかのアプローチが開発されてきました。マウスとラットの2つの動物モデルの感染症は、腹腔内(i.p.)または内膜(i.n.)のいずれかであり、髄膜炎球菌性疾患10、11、12、13、14を再現するために開発された ,15,16,17.実験室のマウスは、おそらく実験的な髄膜炎菌感染を誘発するためのより汎用性の高い動物の一つです。

しかし、i.p.感染の方法は、感染の自然な経路を模倣していないが、重度の敗血症の発症につながるのに対し、i.n.感染経路は髄膜炎球菌病因を評価するのに有用であったが、肺感染を誘発する可能性があるにもかかわらず、敗血症10、11、12、13、14、15、16、17に先立ちます。

i.p.マウスモデルは、髄膜炎球菌チャレンジ10、11、12からの保護を評価するのに役立ちました。感染経路に基づく髄膜炎菌のコロニー形成のマウスモデルは、乳児マウスで開発されており、髄膜炎球菌の影響を受けやすいため、ヒトにおける髄膜炎菌性疾患の経過を模倣した侵襲的感染を再現する13、14、15、16、17.さらに、マウス宿主における髄膜炎球菌複製を促進するために、感染を改善するために動物に対する鉄の投与を含む技術戦略の増加、高細菌イオクムの使用、マウス通過細菌株ならびに乳児または免疫不全動物宿主の雇用は、10、13、15、18、19である。CD46 20またはトランスフェリン21のような特定のヒト因子の発現は、このヒト熱帯細菌に対するマウスの感受性を増加させた。感染のヒト皮膚異種移植片モデルの採用はまた、ヒト内皮22、23に髄腔球菌の接着能を評価するのに有用であった。総称して、ヒト化トランスジェニックマウスの最近の発達は、髄膜炎球菌病因とその宿主相互作用の理解を改善した。

以前は、マウス通過菌24を有する成体マウスのシステナマグナに細菌の接種を行った髄膜炎菌性髄膜炎のマウスモデルを開発した。臨床パラメータおよび感染マウスの生存率は、ヒト宿主に見られるものに匹敵する特性を有する髄炎の確立、ならびに脳の微生物学的および組織学的分析を実証した。これらの感染マウスから、細菌は、また、血液、肝臓、脾臓から回収され、そして感染性線量と相関する末梢器官からの細菌負荷であった。特に、このモデルは、L-グルタミン酸トランスポーターGltT24における欠陥のある等素変異株の毒性を評価するために採用された。最近、i.cistに基づく髄膜炎菌性髄膜炎のマウスモデルを用いた。セログループC株93/42862、24およびUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ25に対するcssA遺伝子に欠陥のある等因性変異体を有する経路は、確立における露光シアル酸の役割を分析したマウスの病気の。

このプロトコルでは、i.cistに基づいて実験的髄膜炎菌性髄膜炎を誘導する簡単な方法を説明する。バルブ/c成体マウスにおける感染経路。この方法は、マウス宿主における髄膜炎球菌感染の特徴付け、ならびに野生型参照株と等因性変異体との間の病原性の評価のために特に有用である。感染の内細菌経路は、髄膜癌菌をシステナ・マグナに直接完全に送達することを保証し、脳脊髄液(CSF)における細菌複製を促進し、それらを模倣する特徴を有する髄膜炎を誘発するヒト2、24、25、26に存在する。

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プロトコル

このプロトコルは、1986年11月24日(86/609/EEC)の欧州共同体評議会指令に従って、動物の苦しみを最小限に抑え、マウスの数を減らすために行われました。本研究で報告された生体内実験は、倫理動物ケア・利用委員会(2012年12月14日)とイタリア保健省(Prot. 0000094-A-03/01/2013)によって承認された。すべての手順は、BSL2ルームのバイオセーフティキャビネット2(BSC2)内で行う必要があり、潜在的な感染廃棄物は専用の容器に処分する必要があります。

1. N. 髄膜炎血清基C株を有するマウスの感染

注意:N.髄膜炎は潜在的に有害な病原体であり、この微生物を取り扱う際に必要なすべての予防措置を講じる必要があります。実験全体にはバイオセーフティレベル2(BSL2)封じ込めが必要です。動物実験に関与する研究者は、実験期間中、使い捨て可能な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。

  1. 生体内感染研究のための細菌の調製
    1. GC(ゴノコッカル)寒天プレートに新鮮なナイセリア髄膜炎培養から単一のコロニーを選び、1%(vol/vol)ポリビトックスサプリメントを補充し、GCブロスの10 mLで接種する。
    2. 220 rpmの速度で軌道シェーカーインキュベーターで37°Cで細菌を成長させます。分光光度計で培養物のO.D.をチェックし続けます。0.7の光学密度OD600nmで初期の指数位相まで培養を成長させ、7 x 108 CFU/mLに対応する。
    3. 必要なO.D.が得られたら、10%グリセロールを加えて冷凍ストックを作ります。極低温培養物に1mLの培養液を分配する。バイアルは使用するまで-80°Cで保管してください。
      注:新鮮な細菌培養物を使用する方が良いですが、冷凍ストックは、インビボ実験を簡素化し、標準化するために使用されました。通常、凍結された株式は、準備から約6ヶ月以内に雇用されています。
    4. 感染前に、凍結した細菌を室温で解凍する。
    5. 1,500 x gで15分間遠心分離して細菌細胞を収穫し、鉄デキストラン(5mg/kg)を含む新鮮なGCスープを1mLで再懸濁します。
      注:GCブロスは、宿主組織14、18、27における髄腔球菌の複製を支持するために鉄デキストラン(5mg/kg)を添加して調製される。
    6. 使用する前に、細菌の生存可能な数を実行して、感染のためのCFUの正確な数を決定します。これを行うには、細菌懸濁液の10 μLをピックアップし、シリアル希釈を進め、GC寒天プレート上の各希釈を広げ、5%CO2で37°Cでインキュベートし、18-24時間。
  2. マウスの胸腔内注射
    メモ：全体のプロシージャは無菌条件を維持するために層流のキャビネットで行われる。
    1. ハウスラボマウス(8週齢、雌バーブ/c)は、特定の病原体遊離条件下で。食品ペレットと水アドリビタムを提供します。
    2. 実験を開始する前に、新しい環境で1週間動物を決済します。
    3. 実験を開始する前に、体重を量り、体温を評価します。
      注:8週齢の近親者Balb/c雌マウスの体重は平均約19gである。実験室マウスの平均温度は36〜38°C24から生理学的に及ぶ。
    4. 首から動物をスクラップし、70%エタノールで腹部領域をきれいにし、25 G針0.5mm x 16 mmを使用して、マウス腹部の右下象限にi.p.鉄デキストラン(1%リン酸生理食塩水バッファー、250 mg/kgに溶解)を注入する、感染前に約2〜3時間。
      注:腹腔内注射は、尿膀胱、精液などの腹部器官に損傷を与えないように、マウス腹部の右下象限で行った。外因性鉄源の投与は、鉄デキストランの形態で、感染前の動物に対して、宿主14、18、27における細菌増殖を好む。
    5. 2~3時間後、ケタミン(50mg/kg)とキシラジン(3mg/kg)と眼用潤滑剤で動物麻酔を行う。
    6. つま先をつまむ際の痛みの反応がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。
    7. マウスを胸骨デキュビタスに置き、手足と頸椎を慎重に伸ばして椎骨柱をまっすぐな位置に保ちます。
    8. 30 G針×8mmの注射器をローディングする前に、細菌懸濁液を穏やかに混合し、一貫した懸濁液を維持します。
      注:注射時間にできるだけ近い細菌懸濁液を準備します。その間、室温で保管してください。
    9. ポスト解凍細菌価動植物(CFU/mL)に基づいて、感染する動物の総数に対して、使用するCFUの合計(動物数当たりのCFU細菌用量)の計算を進める。バイアルから採取する正確な体積の計算を進めて、後解凍後細菌価動 (CFU/mL) と n 匹のマウスの感染に役立つ合計 CFU (後解凍細菌性価動き CFU) との間に比例を適用する合計 CFU を取得します。: ml = 合計 CFU : x). 感染する動物の総数に対して最終体積を設定します。
      注:これらの実験では、動物1匹あたり104~109の幅広い範囲の観度を用いた。
    10. 70%エタノールで手術領域をきれいにします。
    11. 針の助けを借りて注射点を特定し、メニンゴコッチ(野生型株および等因性変異株)の確立されたCFUを注入するか、または制御として鉄デキストラン(5mg/kg)を補充したGCブロスを、マウスのシステナマグナに10μLの総体積で注入する30 G針x 8 mmを使用して後頭バリ穴を通して。
      1. 頭蓋頸部接合部、特に後部くも膜下腔に針を置いて、水槽接種を行う。このスペースをアクセス可能にするためにヘッドをベントロフレックス28.
      2. 簡単に言えば、動物を横の再開胎に入れ、耳を邪魔し、首を適度に曲げる(90〜100°)。首と頭部の中間線(鼻からオクシプトまで)が卓上に完全に平行な位置にあることを確認します。
      3. アトラスの翼に触れ、それらが重なっていることを確認し、軸回転を排除します。自然なインデントは、通常、針が後頭穴に入る可能性が最も高い中間線に触れることができます。
      4. ナイセリアでマウスを注射した後、注射器と針を安全に捨てる.
    12. ケージに動物を配置し、目覚めと動きの完全な回復を待ちます。
    13. 感染したマウスを積層状のフローキャビネットの下に置いてください。
    14. マウスをモニターし、24時間後感染、昏睡スケール29による昏睡の臨床徴候に対して。昏睡スケール:1 =昏睡、2 =背中をオンにした後に直立しない、3=30s内に直立し、4=5s以内に直立し、最小限の歩行活動、5 =正常。
       注:動物に痛みを記録した場合、メロキシカム(研究期間中は5mg/kg i.p.)を用いた鎮痛を投与した。
    15. 動物の生存またはCFUは、ステップ2で詳述したように感染した動物に対するアッセイをカウントする。
    16. 子宮頸部脱臼によるスコア2のマウスの安楽死を行い、統計分析のために死んだものとして記録する。

2. 動物の生存とCFUカウント

  1. 動物の生存
    1. i.cistによって動物に感染するために、異なる用量(マウスあたり104〜10 9 CFUの範囲)で細菌のイノクラを準備します。ルート(ステップ 1.2 を参照)。
    2. GCブロスを用いて対照マウスを接種し、鉄デキストラン(5mg/kg)を同様に補充する。
    3. 臨床症状のために動物を監視する:フリル毛皮、ハンチング外観、低体温、体重減少、無気力、またはモリバンド24、25、26、30、168時間の実験全体を通して毎日(7日間)実験期間中は少なくとも1日2回。
    4. 毎日デジタルバランスと直腸温度計を使用して体重と温度を測定します。
    5. マウスの生存期間を1週間記録する。
      注:2の昏睡値に達する動物、または観察の168時間以上生存する動物が安楽死する間、動物ポスト感染の自然死を記録する。
    6. 昏睡値が2のマウスを麻酔するか、ケタミン(50mg/kg)とキシラジン(3mg/kg)で観察時間をかけて生存し、眼科軟膏を塗布する。
    7. つま先のピンチによって痛みの反応が欠けていることを確認します。
    8. 子宮頸部脱臼によるマウスの安楽死を行い、統計解析のために死んだものとして記録する。
  2. 末梢器官におけるコロニー形成単位(CFU)カウントの評価
    1. i.cistによって動物を接種するために動物の生存結果に基づいて、サブ致死性細菌用量(5 x 105CFU/マウス)を使用してください。ルート(サブセクション 1.2 を参照)。
    2. 感染中に毎日直腸温度を監視し、ステップ2で述べたように48時間後感染で動物の麻酔を行う。
    3. 胸部の70%エタノール消毒を進め、25G針0.5mm x 16mmを用いて胸腔の心臓穿刺により600~700μLの血液を取り出します。
    4. 3.8%クエン酸ナトリウムを含むチューブで血液を収集し、後で生存可能な細菌細胞数のために-80°Cで保存します。
    5. 動物を犠牲にするために子宮頸部脱臼を行います。すべての関連する制度および倫理的ガイドラインに従ってマウスを犠牲にした後、ハートビートの不在を記録する死を確認します。
    6. 仰向けの位置にマウスを置き、はさみと鉗子を使用して、体の矢状面に沿って毛皮のカットを進めます。ピンで体の側面に毛皮で皮膚を固定します。
    7. 鋭いはさみで腹膜を切り落とす。はさみと使い捨て鉗子を使用して臓器(脾臓や肝臓など)を切除し、10%(vol/vol)グリセロールを補充したGCブロス1mLで滅菌ペトリ皿にそれぞれを入れます。
    8. IACUC ガイドラインに従ってマウス本体を安全に廃棄してください。
    9. 5 mL注射器のプランジャーで室温で機械的に、単一細胞懸濁液が形成されるまで約2~3分間均質化し、チューブに移す。
    10. 均質化された組織サンプルを含むチューブを直ちにドライアイスに置きます。
      注:試料は、後の時点で生存可能な細菌細胞数評価を行うための2mL滅菌チューブに-80°Cで保存することができる。
    11. 必要に応じて、抗生物質でGC寒天プレートを作ります。使用前にプレートを37°Cで2~3時間乾かしてください。
    12. 各均質化された組織とプレートからGC寒天プレートにサンプルの10倍の連続希釈を調製します。5%CO2で37°Cで一晩インキュベートする。

3. CFUカウントのための脳組織の調製

  1. i.cistによって動物を接種するために動物の生存結果に基づいて、サブ致死性細菌用量(5 x 105 CFU/マウス)を使用してください。ルート(サブセクション 1.2 を参照)。
  2. ステップ2で述べたように確立された感染時に動物の麻酔を行う。
  3. 子宮頸部脱臼による動物の安楽死を行う。
  4. 70%エタノールで手術領域をきれいにします。
  5. 大きなはさみを使ってマウスの頭を切り落とします。
  6. 小さな外科はさみと細かい先端の鋼鉄鉗子の助けを借りて毛皮と皮膚を切除し、縫合糸を明確に見ることができ、頭蓋骨の開口部を導くことができるように頭蓋骨の上部に向かって進みます。
  7. 頭蓋骨を開くために、フォルメンマグナムを通して小さなはさみの先端を挿入します。
  8. 頭蓋骨の中心に向かって、頭蓋骨の反対側に頭頂骨の中間線を横切ってカットします。ラムドイド縫合糸の横縁に沿ってやさしくカットします。
  9. 後頭頂隅から始まる頭蓋骨を持ち上げ、斜めに上方に引き上げて脳を発見し、細かい先端鉗子を使用します。
  10. 頭蓋骨が持ち上げられたとき、脳組織が頭部のどの骨にも付着していないことを確認してください。
  11. 使い捨て鉗子を使用して頭蓋骨と脳の間の結合組織を取り除き、頭蓋骨と一緒に脳組織が除去されることを保証する。
  12. 脳組織の乾燥をあまり許さないでください。使い捨て鉗子を使用して脳を置き、10%(vol/vol)グリセロールを加えたGCブロス1mLのペトリ皿に入れます。
  13. 5 mL シリンジのプランジャーを使用して機械的に脳を均質化します (ステップ 2.2.9 を参照)。サンプルを2mL滅菌チューブに移し、後で実行可能な細菌細胞数評価のために-80°Cを保存します( ステップ2.2で説明したように)。

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結果

N.髄膜炎野生型および等素変異株に感染したマウスの生存
これらの代表的な結果で使用されるナイセリア髄膜炎株は、セログループC参照株93/4286(ET-37)およびその等因性変異体93/4286ΩcssAを、cssA遺伝子の挿入不活性化により得られ、コード化したUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼは、カプセル合成軌跡25にマップされる。本マ?...

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ディスカッション

本研究では、i.cistによる成人マウスにおける髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する実験プロトコルについて述べている。髄膜炎菌の接種私たちの知る限りでは、髄膜炎菌性髄膜炎の他のモデルは、i.cistによって感染した実験室マウスで開発されていません。ルート;過去に、この方法は、ラット31とウサギ32の両方で髄膜炎球菌性髄膜炎のモデルを提供するために?...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

研究は、PRIN 2012 [付与番号 2012WJSX8K]によって部分的にサポートされました: "粘膜感染症における宿主微生物相互作用モデル:新しい治療戦略の開発"と PRIN 2017 [2017SFBFER]: "間の相互作用に取り組むための統合されたアプローチ適応、ストレス条件と挑戦的な病原体の抗菌性」。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,8 Skirted Cryovial With external threadStarlabE3090-6222
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon35207030 mm x 115 mm
Adson ForcepsF.S.T.11006-12Stainless Steel
Alarm-ThermometerTESTO9000530
BactoTM Proteose PeptoneBD211693
BD Micro Fine syringeBD320837U-100 Insulin
BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inchBD30001405 mm x 16 mm
BD Plastipak syringe 5 mLBD30806207 mm x 30 mm
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINETBio Air s.c.r.l.Aura B3
BioPhotometerEppendorfModel #6131
Bottle DTecniplastDGraduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm
C150 CO2 IncubatorBinder9040-0078
Cage Body Eurostandard Type IITecniplast1264C267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2
Cell Culture Petri Dish With LidThermo Scientific150288Working Volume: 5 mL
CentrifugeEppendorfMicrocentrifuge 5415R
Cuvetta semi-micro L. FormKartell S.p.A.01938-00
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrateCarlo erba471767
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysisCarlo Erba480141g1000
Diete Standard CertificateMucedola s.r.l.4RF21Food pellet for animal
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless SteelF.S.T. by DUMONTAGT50340.10 x 0.06 mm2 tip
Electronic BalanceGibertiniEU-C1200Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lockEppendorfT3545-1000EA
ErythromycinSigma-AldrichE-637625 g
Extra Fine Bonn ScissorsF.S.T.14084-08Stainless Steel
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clampsTecniplast1264C400SUC
GC agar baseOXOIDCM0367
Gillies Forceps 1 x2 teethF.S.T.11028-15Stainless Steel
Glicerin RPECarlo Erba4537521 L
Graefe ForcepsF.S.T.11052-10Serrated Tip Width: 0.8 mm
Inner lidTecniplast1264C116
Iron dextran solutionSigma-AldrichD8517-25ML
KetamineIntervet
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class IIFasterBH-EN 2004
Microcentrifuge tubes 1.5 mL BRANDPP780751screw cap PP, grad
Mouse Handling ForcepsF.S.T.11035-20Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm
Mucotit-F2000MERZ618462000 mL
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New Brunswick Classic C24 Incubator ShakerPBI internationalC-24 Classic Benchtop Incubator Shaker
Petri PS DishesVWR391-045390 x 14.2 mm2
Pipetman Classic P20GilsonF1236002-20 μL
Pipetman Classic P200GilsonF12360120-200 μLL
Pipetman Classim P1000GilsonF123602200-1,000 μL
PolyvitoxOXOIDSR0090A
Potassium ChlorideJ.T. Baker Chemicals B.V.0208250 g
Potassium Dihydrogen PhosphateJ.T. Baker Chemicals B.V.02401 kg
PS Disposible forcepsVWR232-0191
Removable DividerTecniplast1264C812
Round-Bottom Polypropylene TubesFalcon3520635 mL
Sodium ChlorideMOLEKULA41272436
SS retainer and Polyester FilterSheetTecniplast1264C
Standard Pattern ForcepsF.S.T.11000-12Stainless
Stevens Tenotomy ScissorsF.S.T.14066-11Stainless Steel
Surgical Scissor - ToughCutF.S.T.14130-17Stainless
Touch N Tuff disposible nitrile glovesAnsell92-500
Ultra Low Temperature (ULT) FreezerHaierDW-86L288Volume = 288 L
Wagner ScissorsF.S.T.14070-12Stainless Steel
XylazineIntervet

参考文献

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