Indução meningocócica meningite sorogrupo C em camundongos via parto intracisternal

Resumo

Aqui, descrevemos um método para induzir a meningite meningocócica através de uma via intracisternal de infecção em camundongos adultos. Apresentamos um protocolo passo a passo de infecção meningocócica desde a preparação do inóculo para a infecção intracisternal; registre então a sobrevivência animal e avalie as cargas bacterianas em tecidos do murine.

Resumo

Neisseria meningitidis (meningococcus) é um microorganismo de alcance estreito, reconhecido mundialmente como a principal causa de meningite bacteriana. Meningococcus é um colonizador transitório da nasofaringe humana de aproximadamente 10% do sujeito saudável. Em circunstâncias particulares, adquire uma capacidade invasiva de penetrar na barreira da mucosa e invade a corrente sanguínea causando septicemia. No último caso, a sepse fulminante poderia surgir mesmo sem o consequente desenvolvimento da meningite. Por outro lado, as bactérias poderiam se multiplicar mal na corrente sanguínea, atravessar a barreira do cérebro sanguíneo, alcançar o sistema nervoso central, levando à meningite fulminante. Os modelos de urina de meningite bacteriana representam uma ferramenta útil para investigar as interações hospedógeno-patógeno e analisar os mecanismos pathogenéticos responsáveis por esta doença letal. Embora, vários sistemas de modelos experimentais tenham sido avaliados nas últimas décadas, nenhum deles foi capaz de reproduzir os eventos patológicos característicos da doença meningocócica. Neste protocolo experimental, descrevemos um procedimento detalhado para a indução da meningite meningocócica em um modelo de camundongo baseado na inoculação intracisternal de bactérias. Os sinais peculiares da meningite humana foram registrados no hospedeiro murina por meio da avaliação de parâmetros clínicos (por exemplo, temperatura, peso corporal), avaliação da taxa de sobrevida, análise microbiológica e exame histológico de lesão cerebral. Ao usar inóculo intracisternal (i.cist.), meningococos entrega completa diretamente em cisterna magna, levando a uma replicação meningocócica muito eficiente no tecido cerebral. Um aumento de 1.000 vezes da contagem viável de bactérias é observado em cerca de 18 h. Além disso, meningococos também são encontrados no baço, e fígado de camundongos infectados, sugerindo que o fígado pode representar um órgão-alvo para a replicação meningocócica.

Introdução

Neisseria meningitidis é um Gram negativo β-proteobacterium restrito ao hospedeiro humano, bem conhecido por ser uma das causas mais comuns de meningite e sepse na população humana em todo o mundo. Coloniza o trato respiratório superior (nariz e garganta) de portadores saudáveis e assintomáticos (2-30% da população), mas a bactéria às vezes evita várias defesas imunes do hospedeiro e se espalha da corrente sanguínea para o cérebro, causando um local descontrolado inflamação, conhecida como meningite meningocócica. Uma combinação de fatores do anfitrião e bacterianos parece contribuir à transição do commensal ao comportamento invasor^1.

N. meningitidis é especializada exclusivamente em colonização humana e infecção. Tem uma escala estreita do anfitrião e, conseqüentemente, limitou estudos in vivo do pathogenesis devido à falta dos modelos animais apropriados que reproduzem a doença meningocócica humana. Como resultado, levou a lacunas fundamentais na compreensão em relação à patogênese da septicemia e meningite causada pelo meningococcus. Nas últimas décadas, o desenvolvimento de muitos sistemas in vitro permitiu a identificação de vários fatores de virulência meningocócica^2,3,4. Embora esses estudos valiosos fornecessem insights importantes para entender o papel desses fatores para uma infecção meningocócica bem-sucedida, esses modelos não permitiram a avaliação das consequências das interações bacterianas com o humoral e celular sistema imunológico e ainda menos com todo o tecido. In vivo modelos animais de infecção são de grande relevância, bem como para a avaliação do grau de proteção conferida por formulações vacinais. Como patógeno humano-trópico, meningococcus possuem determinantes apropriados necessários para infecções bem-sucedidas, como estruturas superficiais (ou seja, pili tipo IV e proteínas de opacidade) e sistemas de captação de ferro para receptores humanos e proteínas de transporte (ou seja, transferrina e lactoferrina)^5,6,7 para aderir adequadamente, sobreviver e invadir o hospedeiro humano. Finalmente, as habilidades de variação genética do patógeno para fugir e/ou bloquear a resposta imune humana contribuem ainda mais para o tropotismo de espécies altas^8,9. Portanto, a ausência de fatores hospedeiros específicos, envolvidos na interação, pode bloquear etapas do ciclo de vida do patógeno, estabelecendo dificuldades significativas no desenvolvimento de pequenos modelos animais resumindo o ciclo de vida meningocócica.

Ao longo das últimas décadas, várias abordagens foram desenvolvidas para melhorar a nossa compreensão do ciclo infeccioso meningocócico. Infecções de dois modelos animais, camundongos e camundongos, intraperitoneally (i.p.) ou intranasally (i.n.), foram desenvolvidas para reproduzir a doença meningocócica^{10,11,12,13, 14 , 15,16,17.} O rato de laboratório é provavelmente um dos animais mais versáteis para induzir a infecção meningocócica experimental.

No entanto, a forma de infecção do i.p. leva ao desenvolvimento de sepse grave, embora não imite a via natural da infecção, enquanto a via de infecção do i.n. foi útil para avaliar a patogênese meningocócica, mesmo que possa induzir infecção pulmonar antes da sepse^{10,11,12,13,14,15,16,17.}

O modelo de mouse i.p. foi fundamental para avaliar a proteção contra o desafio meningocócico^10,11,12. O modelo do rato da colonização meningocócica baseada na rota i.n. da infecção foi desenvolvido com ratos infantis, porque são mais suscetíveis aos meningococci, para reproduzir uma infecção invasora que imita o curso da doença meningocócica nos seres humanos ^{13,14,15,16,17.} Além disso, para promover a replicação meningocócica no hospedeiro murine, um número crescente de estratégias técnicas também foram aplicadas, incluindo a administração do ferro para os animais para melhorar a infecção, o uso de alto inóculobacteriano , cepa bacteriana passagem por camundongos, bem como o emprego de animais infantis ou imunocomprometidos hospeda^{10,13,15,18,19}. A expressão de fatores humanos específicos como CD46²⁰ ou^{transferrin21} aumentou a susceptibilidade dos camundongos para esta bactéria humano-trópico; o emprego do modelo de xenoenxerto de pele humana de infecção também tem sido útil para avaliar a capacidade de adesão de meningococos ao endotelio humano^22,23. Coletivamente, o recente desenvolvimento de camundongos transgênicos humanizados melhorou a compreensão da patogênese meningocócica e suas interações hospedeiras.

Anteriormente, desenvolvemos um modelo de urina de meningite meningocócica, onde a inoculação de bactérias foi realizada na cisterna magna de camundongos adultos com bactérias de passagem de ratos²⁴. Parâmetros clínicos e a taxa de sobrevida de camundongos infectados demonstraram o estabelecimento de meningite com características comparáveis às observadas no hospedeiro humano, bem como as análises microbiológicas e histológicas do cérebro. Destes camundongos infectados, as bactérias foram, também, recuperados de sangue, fígado e baço, e cargas bacterianas de órgãos periféricos correlacionados com a dose infecciosa. Em particular, este modelo foi empregado para avaliar a virulência de uma cepa mutante isógênica com defeito no transportador L-glutamato GltT²⁴. Recentemente, usando nosso modelo do rato da meningite meningococcal baseada em i.cist. rota com cepa sorogrupo C 93/4286^2,24 e um mutante isogênico defeituoso na codificação de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase²⁵, analisamos o papel do ácido siálico exposto no estabelecimento de doença em camundongos.

Neste protocolo, descrevemos um método simples para induzir a meningite meningocócica experimental com base no i.cist. rota de infecção em camundongos adultos Balb/c. Este método é particularmente útil para a caracterização da infecção meningocócica em um hospedeiro de urina, bem como para a avaliação da virulência entre cepas de referência do tipo selvagem e mutantes isogênicos. A via intra-cisterna da infecção garante a entrega completa dos meningococos diretamente na cisterna magna, que por sua vez facilita a replicação bacteriana no líquido cefalorraquidiano (CSF) e induz meningite com características que imitam aqueles presente emseres humanos^2,24,25,26.

Protocolo

Este protocolo foi conduzido para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de camundongos de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE). Experimentos in vivo relatados neste estudo foram aprovados pelo Ethical Animal Care and Use Committee (Prot. número 2, 14 de dezembro de 2012) e pelo Ministério da Saúde italiano (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos os procedimentos devem ser realizados dentro do Gabinete de Biossegurança 2 (BSC2) em uma sala BSL2, e os resíduos potenciais infectados devem ser descartados em recipientes dedicados.

1. Infecção de camundongos com N. meningitidis Serogroup C Strain

CUIDADO: N. meningitidis é potencialmente um patógeno prejudicial e todas as precauções necessárias devem ser tomadas ao manusear este microrganismo. Toda a experimentação requer contenção do Nível 2 de Biossegurança (BSL2). O pesquisador envolvido em estudos com animais deve usar equipamentos descartáveis de proteção individual (Epi) durante o experimento.

1. Preparação de bactérias para estudos de infecção in vivo
   1. Escolha uma única colônia de uma nova cultura neisseria meningitidis em GC (Gonococcal) placa de ágar complementada com 1% (vol / vol) suplemento de polivitox e inoculação em 10 mL de caldo GC.
   2. Crescer a bactéria a 37 °C em uma incubadora orbital shaker com a velocidade de 220 rpm. Continue verificando o O.D. da cultura com um espectrômetro. Crescer a cultura até a fase exponencial precoce em uma densidade óptica OD_600nm de 0,7, correspondente a 7 x 10⁸ CFU/mL.
   3. Uma vez que o O.D. necessário é obtido, faça estoques congelados adicionando o glycerol de 10%. Dispense 1 mL da cultura nos crioviais. Guarde os frascos a -80 °C até o uso.
      Nota: Embora seja melhor usar a cultura bacteriana fresca, os estoques congelados foram usados para simplificar e estandardizar a experiência in vivo. Normalmente, as unidades populacionais congeladas foram empregadas dentro de cerca de 6 meses a partir da preparação.
   4. Antes da infecção, descongele bactérias congeladas à temperatura ambiente.
   5. Colher as células bacterianas por centrífuga por 15 min a 1.500 x g e resuspender em 1 mL de caldo GC fresco contendo dextran de ferro (5 mg/kg).
      Nota: O caldo GC é preparado com a adição de ferro dextran (5 mg/kg) para favorecer a replicação de meningococos no tecido hospedeiro^14,18,27.
   6. Antes de usar, realizar contagens viáveis de bactérias para determinar o número exato de CFU para a infecção. Para isso, pegue 10 μL de suspensão bacteriana e prossiga com diluições em série e espalhe cada diluição em placas de ágar gc e incubaem a 37 °C com 5% de CO₂, para 18-24 h.
2. Injeção intracisterna de camundongos
   Nota:Todo o procedimento é realizado no armário de fluxo laminar para manter condições assépticas.
   1. Camundongos de laboratório da casa (8 semanas de idade, balb/c fêmea) condições específicas de livre patógeno. Fornecer pelotas de alimentos e água ad libitum.
   2. Acomode os animais no novo ambiente por 1 semana antes de iniciar o experimento.
   3. Antes de iniciar o experimento, pesar e avaliar a temperatura do corpo.
      Nota: Os camundongos fêmeas Balb/c consanguíneos de oito semanas de idade pesam uma média de cerca de 19 g. A temperatura média dos ratos de laboratório fisiologicamente variando de 36-38 °C²⁴.
   4. Scruff o animal do pescoço, limpar a área do abdômen com o etanol de 70% e injetar i.p. ferro dextran (dissolvido em 1% tampão de soro fisiológico fosfato, 250 mg/kg) no quadrante inferior direito do abdômen murine usando uma agulha 25 G 0,5 mm x 16 mm aproximadamente 2-3 h antes da infecção.
      Nota: A injeção intraperitoneal foi executada no quadrante direito mais baixo do abdômen do murine para evitar danificar órgãos abdominais tais como a bexiga urinária, o cecum, etc. A administração da fonte de ferro exógena, na forma de ferro dextran, para animais antes da infecção favorece a multiplicação bacteriana no hospedeiro^14,18,27.
   5. Após 2-3 h, realizar anestesia animal com cetamina (50 mg/kg) e xilamina (3 mg/kg) e lubrificante oftalmológico.
   6. Verifique se há profundidade de anestesia, garantindo a ausência de resposta da dor ao beliscar o dedo do pé.
   7. Posicione o rato em decubitus sternal e estique com cuidado os membros e a espinha cervical para manter a coluna vertebral em uma posição reta.
   8. Misture delicadamente a suspensão bacteriana para manter uma suspensão consistente antes de carregar uma seringa de 30 G agulha x 8 mm.
      Nota: Prepare a suspensão bacteriana o mais próximo possível do tempo de injeção; enquanto isso, armazená-lo à temperatura ambiente.
   9. Com base no titer bacteriano pós-descongelamento (CFU/mL), prossiga com o cálculo do total da UE a ser utilizado, no que diz respeito ao número total de animais a serem infectados (dose bacteriana da UEA por número de animais). Prossiga com o cálculo do volume exato a ser retirado do frasco para obter o total de CFU aplicando uma proporção entre o titer bacteriano pós-descongelamento (CFU/mL) e o CFU total útil para a infecção de n camundongos (após o descongelamento do titer bacteriano CFU : ml = CFU total : x). Estabelecer o volume final em relação ao número total de animais a serem infectados.
      Nota: Nestes experimentos, uma ampla gama de titer de 10⁴ a 10⁹ por animal foi utilizado.
   10. Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
   11. Identifique o ponto de injeção com a ajuda de uma agulha e injete na CFU estabelecida de meningococos (cepa selvagem do tipo e cepa mutante isogênica), ou caldo GC complementado com dextran de ferro (5 mg/kg) como controle, em um volume total de 10 μL na cisterna magna de camundongos através de um buraco de rebarba occipital usando uma agulha 30 G x 8 mm.
       1. Realize o inóculo cisterna colocando a agulha na junção craniocervical, especificamente no espaço subaracnoide dorsal. Ventroflex a cabeça para tornar este espaço acessível²⁸.
       2. Resumidamente, coloque o animal em recumbency lateral, segure as orelhas para fora do caminho e flexione o pescoço moderadamente (90 a 100°). Certifique-se de que a linha média do pescoço e da cabeça (do nariz ao occiput) estão em posição perfeitamente paralela à mesa.
       3. Toque nas asas atlas e certifique-se de que elas se sobrepõem, eliminando a rotação axial. Um recuo natural geralmente pode ser tocado no meio da linha, onde a agulha é mais provável de entrar no buraco occipital.
       4. Descarte a seringa e agulha com segurança após a injeção de ratos com Neisseria.
   12. Coloque o animal na gaiola e aguarde o despertar e a recuperação total do movimento.
   13. Mantenha as gaiolas com ratos infectados um armário de fluxo laminar.
   14. Monitor camundongos, 24 h pós infecção, para sinais clínicos de coma de acordo com a escala de coma²⁹. Escala de coma: 1 = coma, 2 = não fica de pé depois de ser virado para trás, 3 = fica ereto dentro de 30 s, 4 = fica na posição vertical dentro de 5 s, atividades ambulatorativas mínimas, 5 = normal.
        Nota: Quando nos animais foi registrado dor, foi administrada a analgesia com meloxicam (5 mg/kg i.p. para duração do estudo).
   15. Prossiga para a sobrevivência animal ou CFU conta o ensaio sobre os animais infectados como detalhado no passo 2.
   16. Realize a eutanásia dos ratos com uma contagem de 2 pela deslocação cervical e recorde como inoperante para a análise estatística.

2. Sobrevivência animal e contagem de CFU

1. Sobrevivência animal
   1. Prepare inocula bacteriana em doses diferentes (variando de 10⁴ a 10⁹ CFU por rato) para infectar animais pelo i.cist. rota (ver passo 1.2).
   2. Inoculam camundongos controle com caldo GC, complementado com ferro dextran (5 mg/kg), da mesma maneira.
   3. Monitorar animais para sintomas clínicos: pele de babados, aparência curvada, hipotermia, perda de peso, letargia, ou^{moribundo 24,25,26,30}, todos os dias durante todo o experimento por 168 h (7 dias) pelo menos duas vezes por dia durante o período do experimento.
   4. Medir o peso corporal e temperatura usando um equilíbrio digital e um termômetro retal, respectivamente todos os dias.
   5. Registre a sobrevivência de ratos por uma semana.
      Nota: Registre a morte natural da infecção pós animal, enquanto os animais que atingem um valor de coma de 2 ou que sobrevivem mais de 168 h de observação serão sacrificados.
   6. Camundongos anestesios com um valor de coma de 2 ou que sobrevivem durante o tempo de observação com cetamina (50 mg/kg) e xilazine (3 mg/kg) e aplicam pomada oftalmocômica.
   7. Verifique se a resposta à dor está ausente por pitada do dedo do pé.
   8. Executar a eutanásia dos ratos pela deslocação cervical e registro como inoperante para a análise estatística.
2. Avaliação de unidades formadoras de colônias (CFU) conta em órgãos periféricos
   1. Use uma dose bacteriana subletal (5 x 10⁵CFU/mice) com base nos resultados de sobrevivência animal para inocular animais pelo i.cist. rota (ver subseção 1.2).
   2. Monitorar a temperatura retal todos os dias durante a infecção e realizar anestesia de animais em 48 h pós infecção, como mencionado no passo 2.
   3. Prossiga com a desinfecção de etanol de 70% do tórax e retire 600-700 μL de sangue por perfuração cardíaca da cavidade torácica usando uma agulha de 25 G 0,5 mm x 16 mm.
   4. Coletar o sangue em um tubo contendo citrato de sódio de 3,8% e armazenar a -80 °C para as contagens de células bacterianas mais tarde viáveis.
   5. Realizar luxação cervical para sacrificar os animais. Confirme a morte registrando a ausência de batimento cardíaco, depois de sacrificar o mouse de acordo com todas as diretrizes institucionais e éticas relevantes.
   6. Coloque o rato na posição supina e use tesouras e fórceps para prosseguir com o corte da pele ao longo do plano sagital do corpo. Corrigir a pele com a pele nas laterais do corpo com pinos.
   7. Corte a membrana peritoneal usando tesoura afiada. Use tesouras e fórceps descartáveis para extirpar os órgãos (por exemplo, baço e fígado) e coloque cada um em placa de Petri estéril com 1 mL de caldo GC complementado com 10% (vol/vol) glicerol.
   8. Descarte com segurança o corpo do mouse de acordo com as diretrizes da IACUC.
   9. Homogeneize os órgãos mecanicamente à temperatura ambiente com o desentupidor de uma seringa de 5 mL por cerca de 2-3 min até que uma suspensão de célula única seja formada e a transfira em um tubo.
   10. Coloque o tubo com a amostra de tecido homogeneizado imediatamente no gelo seco.
       Nota: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C em um tubo estéril de 2 mL para realizar a avaliação viável de contagens de células bacterianas em pontos posteriores.
   11. Faça placas de ágar GC com antibióticos quando necessário. Seque as placas antes do uso pré-incubação a 37 °C para 2-3 h.
   12. Prepare diluições em série de 10 vezes das amostras em caldo GC de cada tecido homogeneizado e placa em placas de ágar GC. Incubar durante a noite em 37 °C com 5% CO₂.

3. Preparação de tecidos cerebrais para contagem de CFU

1. Use uma dose bacteriana subletal (5 x 10⁵ CFU/mice) com base nos resultados de sobrevivência animal para inocular animais pelo i.cist. rota (ver subseção 1.2).
2. Realizar anestesia de animais no tempo de infecção estabelecida, como mencionado no passo 2.
3. Realizar a eutanásia de animais por luxação cervical.
4. Limpe a área cirúrgica com 70% de etanol.
5. Corte a cabeça do rato usando uma tesoura grande.
6. Rsect a pele e a pele com a ajuda de tesouras cirúrgicas pequenas e de um forceps de aço derrubado fino, continuando para a parte superior do crânio para poder ver claramente as suturas e guiar a abertura do crânio.
7. Insira a ponta de uma pequena tesoura através do foramen magnum para abrir o crânio.
8. Corte em direção ao centro do crânio e através da linha média de osso parietal para o lado oposto do crânio. Corte suavemente ao longo da borda lateral da sutura lambdoid.
9. Levante o crânio a partir do canto parietal posterior e puxe-o diagonalmente para cima para descobrir o cérebro, usando fórceps finos inclinados.
10. Certifique-se de que o tecido cerebral não está ligado a nenhum osso da cabeça, quando o crânio é levantado.
11. Use fórceps descartáveis para remover qualquer tecido conjuntivo entre o crânio e o cérebro, para garantir que o tecido cerebral seja removido junto com o crânio.
12. Não permita que o tecido cerebral seque muito. Coloque o cérebro, usando fórceps descartáveis, em uma placa de Petri com 1 mL de caldo GC complementado com 10% (vol/vol) glicerol.
13. Homogeneize o cérebro mecanicamente com o desentupidor de uma seringa de 5 mL (ver passo 2.2.9). Transfira as amostras para um tubo estéril de 2 mL e guarde -80 °C para a avaliação de contagem de células bacterianas mais viável posterior, conforme discutido no passo 2.2.

Resultados

Sobrevivência de camundongos infectados com N. meningitidis tipo selvagem e cepas mutantes isogênicos.
As cepas Neisseria meningitidis utilizadas nestes resultados representativos são a estirpe de referência serogrupo C 93/4286 (ET-37) e o seu mutante isogênico 93/4286ΩcssA obtido por inativação insercional do gene cssA, codificação para o UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerase, que mapeia na síntese cápsula locus²⁵. Para avaliar o g...

Discussão

Neste estudo, descrevemos um protocolo experimental para induzir meningite meningocócica em camundongos adultos por i.cist. inoculação de bactérias meningocócicas. A nosso conhecimento, nenhum outro modelo da meningite meningococcal foi desenvolvido nos ratos do laboratório contaminados pelo i.cist. rota; no passado, desta forma tem sido explorada para fornecer modelos de meningite meningocócica em ambos os ratos³¹ e coelho³². É sabido que a maior taxa de doença me...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,8 Skirted Cryovial With external thread	Starlab	E3090-6222
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070	30 mm x 115 mm
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	Stainless Steel
Alarm-Thermometer	TESTO	9000530
BactoTM Proteose Peptone	BD	211693
BD Micro Fine syringe	BD	320837	U-100 Insulin
BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch	BD	300014	05 mm x 16 mm
BD Plastipak syringe 5 mL	BD	308062	07 mm x 30 mm
BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET	Bio Air s.c.r.l.	Aura B3
BioPhotometer	Eppendorf	Model #6131
Bottle D	Tecniplast	D	Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm
C150 CO2 Incubator	Binder	9040-0078
Cage Body Eurostandard Type II	Tecniplast	1264C	267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2
Cell Culture Petri Dish With Lid	Thermo Scientific	150288	Working Volume: 5 mL
Centrifuge	Eppendorf	Microcentrifuge 5415R
Cuvetta semi-micro L. Form	Kartell S.p.A.	01938-00
di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate	Carlo erba	471767
di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis	Carlo Erba	480141	g1000
Diete Standard Certificate	Mucedola s.r.l.	4RF21	Food pellet for animal
Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel	F.S.T. by DUMONT	AGT5034	0.10 x 0.06 mm2 tip
Electronic Balance	Gibertini	EU-C1200	Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g
Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock	Eppendorf	T3545-1000EA
Erythromycin	Sigma-Aldrich	E-6376	25 g
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08	Stainless Steel
Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps	Tecniplast	1264C400SUC
GC agar base	OXOID	CM0367
Gillies Forceps 1 x2 teeth	F.S.T.	11028-15	Stainless Steel
Glicerin RPE	Carlo Erba	453752	1 L
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10	Serrated Tip Width: 0.8 mm
Inner lid	Tecniplast	1264C116
Iron dextran solution	Sigma-Aldrich	D8517-25ML
Ketamine	Intervet
Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II	Faster	BH-EN 2004
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	BRAND	PP780751	screw cap PP, grad
Mouse Handling Forceps	F.S.T.	11035-20	Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm
Mucotit-F2000	MERZ	61846	2000 mL
Natural Latex Gloves	Medica	M101
New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker	PBI international	C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker
Petri PS Dishes	VWR	391-0453	90 x 14.2 mm2
Pipetman Classic P20	Gilson	F123600	2-20 μL
Pipetman Classic P200	Gilson	F123601	20-200 μLL
Pipetman Classim P1000	Gilson	F123602	200-1,000 μL
Polyvitox	OXOID	SR0090A
Potassium Chloride	J.T. Baker Chemicals B.V.	0208	250 g
Potassium Dihydrogen Phosphate	J.T. Baker Chemicals B.V.	0240	1 kg
PS Disposible forceps	VWR	232-0191
Removable Divider	Tecniplast	1264C812
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Falcon	352063	5 mL
Sodium Chloride	MOLEKULA	41272436
SS retainer and Polyester FilterSheet	Tecniplast	1264C
Standard Pattern Forceps	F.S.T.	11000-12	Stainless
Stevens Tenotomy Scissors	F.S.T.	14066-11	Stainless Steel
Surgical Scissor - ToughCut	F.S.T.	14130-17	Stainless
Touch N Tuff disposible nitrile gloves	Ansell	92-500
Ultra Low Temperature (ULT) Freezer	Haier	DW-86L288	Volume = 288 L
Wagner Scissors	F.S.T.	14070-12	Stainless Steel
Xylazine	Intervet