細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

要約

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。

要約

Jドメインタンパク質(JGP)は、真核細胞において最大かつ最も多様なコシャペロンファミリーを形成します。最近の知見は、JDPファミリーの特定のメンバーが真核生物の一過性ヘテロ複合体を形成し、70 kDaヒートショックタンパク質(Hsp70)シャペロンベースのタンパク質分解物の基質選択を微調整できることを示している。JDP複合体は、急性/慢性ストレス誘発凝集タンパク質を標的とし、タンパク質凝集体の表面に複数のHsp70sをリクルートすることにより、逆凝縮物を組み立てるのに役立つ可能性があります。これらの物理的に相互作用するJDPによって形成されるタンパク質品質管理(PQC)ネットワークの程度は、生体内ではほとんど特徴付けられていないままである。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)と名付けられたその中の顕微鏡ベースのタンパク質相互作用アッセイについて説明し、真核細胞の異なる細胞区画においてこれらの一時的に形成されたシャペロン錯体を強く捕捉することができる。我々の研究は、PLAの雇用をヒト細胞から酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(エシェリヒア・コリ)に拡大し、両方で一過性に形成されたタンパク質アセンブリのダイナミクスを監視する重要なツールを提供する。原核生物および真核細胞。

概要

膨大な量のゲノム情報は、細胞相互作用の我々の不完全な理解のために解釈できないままである。従来のタンパク質とタンパク質の相互作用検出方法は、化学的架橋およびタンパク質の共局在化を伴うタンパク質共免疫沈殿などの方法論であるが、広く使用されているが、様々な欠点を提起する。主な欠点のいくつかは、相互作用の定量化が不十分であり、非ネイティブ結合イベントの潜在的な導入が含まれます。これに対し、新しい近接ベースの技術は、細胞内のタンパク質相互作用を捕捉するための代替的かつ強力なアプローチを提供します。近接ライゲーションアッセイ(PLA)1は、現在独自のキットとして利用可能であり、相互作用するサブユニットの近接性に基づいてタンパク質複合体を特異的に標的とする抗体を採用している。

PLAは、標的タンパク質複合体の表面に小さなDNAタグ(PLAプローブ)を持つ一次および二次抗体からなる足場の形成によって開始される(図1、ステップ1-3)。次に、DNAタグの近接性によって決定され、コネクタオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して円形DNA分子が生成される(図1、ステップ4)。円形DNAの形成は、DNAライゲーション工程によって完了する。新たに形成されたDNAの円形片は、共役オリゴヌクレオチドタグの1つによってプライミングされた後続の転がり円増幅(RCA)ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして機能する。これにより、抗体足場を介してタンパク質複合体に付着した一本鎖連結DNA分子が生成される(図1、ステップ6)。連結DNA分子は、増幅されたDNAに散在する複数のユニークな配列にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて可視化される(図1、ステップ7)2)生成されたPLAシグナルは、蛍光ドット(図1、ステップ7)として現れ、細胞内の標的タンパク質複合体の位置に対応する。その結果、アッセイは高い空間精度でタンパク質複合体を検出することができました。この技術は、単にタンパク質相互作用を捕捉するだけではなく、高感度1、2のタンパク質上の単一分子またはタンパク質修飾を検出するためにも利用することができる。

Hsp70は、ハウスキーピングおよびストレス関連機能の配列に参加することにより、細胞タンパク質恒常性を維持するために根本的に重要な非常に汎用性の高いシャペロンシステムを形成する。Hsp70シャペロンシステムのハウスキーピング活動には、デノボタンパク質折りたたみ、細胞膜間のタンパク質転移、タンパク質複合体の組み立ておよび分解、タンパク質活性の調節および異なるタンパク質折りたたみ/リンクが含まれます。品質管理機械3.同じシャペロンシステムはまた、誤った折り畳み/展開されたタンパク質を折りたたみ、タンパク質凝集を防止し、タンパク質の分解を促進し、細胞プロテアーゼと協力して、末端に誤った折り畳み/損傷を受けたタンパク質を分解し、細胞修復を容易にします。プロテオトキシックストレス4,⁵.この機能的多様性を達成するために、Hsp70シャペロンは、Hsp70のATP依存性アロステリック制御を微調整するJDPファミリーとヌクレオチド交換因子(NEF)のパートナーシップコシャペロンに依存し、基質結合および放出3、 ⁶.さらに、JDPコシャペロンは、この汎用性の高いシャペロンシステムの基板選定において重要な役割を果たします。このファミリーのメンバーは、プロトタイプJDP、大腸菌DnaJに対する構造相同性に基づいて3つのクラス(A、BおよびC)に細分化される。クラスA JGPは、Hsp70と相互作用するN末端Jドメイン、グリシンフェニルアラニン豊富な領域、亜鉛指様領域(ZFLR)と2つのβバレルドメインからなる基質結合領域、およびC末端二量化ドメインを含む。N末端Jドメインおよびグリシンフェニルアラニンが豊富な領域を有するJGPは、ZFLRを欠いているが、クラスBに分類される。一般に、これら 2 つのクラスのメンバは、チャペロン関数に関与しています。J^{ドメイン4}のみを共有するJGPを含むキャッチオールクラスCに該当するメンバーは、Hsp70sを募集して様々な非チャペロン機能を実行します。Hsp70システムの交換可能な基板認識「アダプター」としてのJDPの重要な役割は、進化中の家族の拡大によって反映される。たとえば、人間には 42 を超える異なる JDP メンバー⁴があります。これらのJDFは、モノマー、ホモダイマーおよび/またはホモ/ヘテロオリゴマー4、5として機能します。近年、クラスA間の一過性複合体形成による機能的協力(例えば、H.サピエンスDNAJA2;S. セレビシエYdj1) とクラス B (例えば, H.サピエンスDNAJB1;S.セレビシエSis1)真核生物JDPは、インビトロ7,8における非晶質タンパク質凝集体の効率的な認識を促進することが報告された。これらの混合クラスJDP複合体は、おそらくHsp70-およびHsp70+Hsp100ベースのタンパク質分解ガス7、8、9の形成を容易にするために凝集タンパク質の表面に集合する^10.真核細胞におけるこれらの一過性形成混合クラスJDP複合体の存在を支持する重要な証拠をPLA8で提供した。

PLAは、主に哺乳動物細胞におけるメタゾアにおけるタンパク質相互作用の評価にますます採用されています。ここでは、真核生物および原核生物単細胞生物(発芽酵母S.セレビシエおよび細菌大腸菌)において一過性に形成されたシャペロン複合体をモニタリングするこの技術の拡大に成功したと報告する。重要なことに、この拡張は、ヒトおよび動物細胞に感染する微生物を検出および分析する際のPLAの潜在的な使用を強調している。

プロトコル

1. HeLa細胞製剤

1. 次の材料を準備する: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4,1.8 mM KH₂PO_4),pH 7.4;DMEM, 10% FCS と 1% ペンストレップを補充;PBSで4%パラホルムアルデヒド;0.5% PBS でトリトン X100;TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM トリス, 0.05% ツエン), pH 7.4;0.0001% 無菌ポリ-リジン溶液;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋;ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
   注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。
2. 湿ったティッシュで閉じた箱の底を覆うことによって湿気の多い部屋を準備する。実験を開始する前に湿度の高いチャンバーを37°Cに置き、酵素反応をインキュベートしながらチャンバ温度が37°Cであることを確認します。
3. T25フラスコにおける培養HeLa細胞は、DMEMの5mL(高グルコース、グルタミン酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウム補充)で10%FCSおよび1%ペンストレップを補充し、5%CO2を含む37°C CO2インキュベーター中に含まれる。 0.05%トリプシン-EDTAを用いて付着細胞を解離する。解離した細胞に新鮮なDMEMを添加した後、細胞計数室を使用して細胞をカウントし、湿度の高いチャンバー内の診断スライド上で成長する。
4. 無菌細胞培養フードにUV照射により診断スライドを30分間殺菌します。
5. 実験に必要な各ウェルに100 μLの滅菌濾過0.0001%ポリL-リジンを加えます。30分間インキュベートし、50 μLの超純水で各ウェル3倍を洗浄することにより、余分なポリL-リジンを洗い流します。
6. HeLa細胞をトリプシン化し、各ウェルに約15,000個の細胞を追加します。必要に応じて、ウェル当たりのDMEMの少なくとも30〜50 μLに細胞を希釈する。
7. 約24時間の37°C5%CO2インキュベーター内の湿気のあるチャンバー内で細胞を成長させる細胞は、PLAを開始する前に60%〜80%のコンフルエントでなければなりません。
   注:合流率が高すぎると試薬の吸収が減少し、プロトコルの終わりに得られた信号が減少します。
8. ウェルの端にティッシュペーパーを置いて培地を取り除きます。PBSの50 μLでウェルを3倍洗います。
   注:細胞は、液体が過酷に添加されると、切り離さの対象となります。これは、新しい液体を追加する前に井戸を完全に乾燥させないようにし、井戸の端に穏やかに新しい液体を追加することによって防ぐことができます。
9. PBSに50μLの新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加えて細胞を固定します。室温で10分間インキュベートします。
10. PBSでスライドを3倍洗います。100mLのPBSを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。
11. コプリンスライド染色瓶にPBSで0.5%トリトン-X100の100 mLのスライドを浸すことによって細胞膜を透過化する。揺れることなく室温で10分間インキュベートします。
12. TBS-Tでスライドを3倍洗います。TBS-Tの100mLを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。
13. 最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接性ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができています。

2. S. セレビシエ細胞製剤

1. 次の材料を準備する: 100mM KPO 4, pH 6.5, ウォッシュバッファーと呼ばれる;37% ホルムアルデヒド;4% 100 mM KPO₄でパラホルムアルデヒド, pH 6.5;1.2 Mソルビトール 100 mMKPO 4, pH 6.5;リチケース溶液(500 μg/mLリチケース、20 mM β-メルカプトエタノール、100 mMKPO 4、pH 6.5);0.0001% ポリ-リジン溶液;1% 100 mM KPO₄でトリトン X100, pH 6.5;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.2のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
   注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。
2. 振りながら30°Cで非選択的酵母エキス、ペプトンおよびデキストロース(YPD)培地で一晩培養を成長させる。
   注:実験要件に応じてS.セレビシエ細胞は、代わりに合成コンプリート(SC)培地または選択的合成最小(SM)培地で増殖させることができる。
3. 静止培養を20mL培地で0.1のOD600に希釈する。OD 600が0.5に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。
4. 20 mL 培養を 50 mL 遠心分離管に移します。665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。新鮮な培地の5 mLで細胞を再中断する。
5. 培養に37%ホルムアルデヒドの550 μLを添加して細胞を固定します。室温で15分間インキュベートします。
6. 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。ウォッシュバッファーで作成した4%パラホルムアルデヒドの1mLでペレットを再中断します。室温で45分間インキュベートします。
7. インキュベーション中に、各ウェルに0.01%ポリL-リジン溶液の100 μLを加えて診断スライドを調製します。室温で30分間スライドをインキュベートします。
8. 30分後、余分なポリL-リジンを超純水で洗い流し、スライドの空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。
9. 洗浄バッファーの1 mLで細胞を2回洗浄します。665 x gで3分間の細胞の遠心分離による洗浄を行い、上清を取り出し、ウォッシュバッファー内の細胞を再中断します。
10. 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの1mLで細胞を再中断します。
11. 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。細胞壁を消化するために、新たに調製されたLyticase溶液の250 μLでペレットを再中断します。揺れながら30°Cで15分間Lyticase溶液中の細胞をインキュベートする。
12. 消化後、665 x gで遠心分離で細胞を3倍に洗浄し、上清を除去する。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの250 μLで細胞を再中断します。
    注:細胞は細胞壁の消化後に壊れやすいので、細胞を損傷しないように非常に慎重に再中断します。
13. ポリLリジンコーティングされたスライドに再懸濁細胞の20 μLを追加します。50 μLの洗浄バッファーでウェルを3倍に洗い流し、非付着細胞を30分間スライドに取り付けます。
14. 洗浄バッファーで1%トリトン-Xの50 μLで3倍を洗浄することにより、細胞膜を透過化します。
    注:この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。

3.大腸菌細胞製剤

1. 次の材料を準備する: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K₂HPO_4,1.5 mM KH₂PO_4,0.05% Tween-20), pH 7.4;リソザイム溶液 (2 mg/mL リソザイム, 25 mM トリス-HCl pH 8.0, 50 mM ブドウ糖, 10 mM EDTA);0.0001% ポリ-リジン溶液;99% 氷冷メタノール;99% 室温メタノール;99% アセトン;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.1.1のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
2. 揺れながら30°Cでルリア・ベルタニ(LB)培地で一晩培養する。
3. 静止培養を新鮮なLB培地で0.02_のOD600に希釈する。OD 600が対数相細胞の0.4に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。
4. 細胞が0.4のOD₆₀₀に達する約15分前に、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンの100 μLを加えてポリL-リジンコーティングスライドを調製する。室温で30分間スライドをインキュベートします。
5. 30分後、超純水で余分なポリL-リジンを洗い流し、空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。
6. 細胞が0.4のOD₆₀₀に達すると、2分間2,650 x gで無菌マイクロ遠心管およびペレット細胞に培養の1 mLを移移す。
7. LB培地の50μLで細胞を再中断する。
8. 氷冷99%メタノールの1 mLを加えて細胞を固定します。手で非常に穏やかに混ぜます。-20°Cで30分間細胞をインキュベートする。
9. 固定後、ポリL-リジンコーティングスライドに20 μLの細胞を追加します。スライドの空気を30分間乾燥させます。
10. 作りたてのリソザイム溶液を50μLのリソザイム溶液を各ウェルに加え、細胞壁を消化します。湿度の高いチャンバーで25°Cで30分間インキュベートします。
11. ウェルの端にティッシュペーパーを追加して、ウェルからリザイム溶液を取り除きます。PBS-Tの100 mLでスライド3xを洗浄します。コプリンのスライド染色瓶で30sの各洗浄を行い、揺れることなく行います。
12. ティッシュペーパーのスライドをタップして、スライドから洗浄バッファを取り外します。
13. 各ウェルに99%メタノールの50 μLを添加して細胞膜を透過化する。室温で1分間インキュベートします。
14. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってメタノールを取り除きます。
15. 各ウェルに99%のアセトンの50 μLを追加します。1分間インキュベートします。
16. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって余分なアセトンを取り除きます。スライドを空気乾燥させます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。

4. 近接リゲーションアッセイ

1. 次の資料を準備する: バッファをブロックします。抗体希釈バッファー;ウォッシュバッファー 'A' – (10 mM トリス, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4;ウォッシュバッファ 'B' – (200 mMトリス, 100 mM NaCl) pH 7.4;抗ウサギ二次抗体プラス;抗マウス二次抗体 MINUS;5xライゲーションバッファ;リゲス;5x増幅バッファー(オレンジ: λ_ex 554 nm; λ_em 576 nm);ポリメラーゼ;超純水;DAPIを含む取り付け媒体。
   注:PLA検出試薬は、変種グリーン(λ_ex 495 nm;λ_em 527 nm)、レッド(λ_ex 594 nm;λ_em 624 nm)、ファルレッド(λ_ex 644 nm;λ_em 669 nm)またはブライトフィールド(ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP))でも利用可能です。共役)。
2. 各ウェルにブロックバッファのドロップを追加してセルをブロックします。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。
3. 抗体希釈バッファー内のストック抗体を希釈することにより抗体溶液を調作する。各ウェルに対して40μLの抗体溶液が必要である。
4. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってブロッキングバッファを削除します。抗体希釈バッファーで希釈した抗体の40μLを各ウェルに添加する。湿度の高いチャンバーで60分間インキュベートし、37°Cまたは4°Cで一晩インキュベートします。
5. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。
6. 洗浄工程中、希釈5x二次抗体プローブ、抗ウサギPLUS&抗マウスMINUS(プローブの種特異性は使用される一次抗体に依存する)、抗体希釈バッファー内。ウェル当たり40μLの抗体溶液を調剤する。
7. 各ウェルに40μLの二次抗体溶液を添加する。湿気の多い部屋で37°Cで60分間インキュベートします。
8. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから二次抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。
9. 洗い流しの間に、ウェル当たり40μLのライゲーション混合物を調作し、5xライゲーションバッファーの8μL、31μLの超純水および1μLのリガーゼを混合する。
10. 各ウェルに40μLのライゲーション混合物を加えます。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。
11. ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、井戸からライゲーション混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを揺らさずに2分間洗浄します。
12. 洗い流しの間に、ウェル当たり40μLの増幅混合物を調作し、5倍増幅溶液の8μL、31.5μLの超純水、および0.5μLのポリメラーゼを混合する。
    注:5x増幅には蛍光プローブが含まれています。この混合物を光から保護します。また、次の各手順でスライドをライトから保護します。半透明のコプリンスライド染色瓶と湿度の高いチャンバーを使用する場合は、アルミ箔でそれらを包みます。
13. ウェルあたり40μLの増幅混合物を加えます。湿度の高い部屋で37°Cで100分間インキュベートします。
14. ウェルから増幅混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'B'の100 mLで2xを揺らさずに10分間洗浄します。
15. 洗浄バッファー'B'の100 mLでスライドを洗浄し、30sのコプリンスライド染色瓶で超純水で1:100を希釈します。
16. 井戸あたりの取り付け媒体を含むDAPIの20 μLをスライドに追加します。カバースリップでスライドを閉じ、マニキュアでスライドをシールします。
17. イメージングの場合は、光から保護しながら、10~15分間、取り付け媒体を含むDAPIを直ちにインキュベートする。そうでない場合は、光から保護された最大1週間-20°Cでスライドを保管してください。

5. 検出

1. 共焦点顕微鏡検査を使用して、20x/0.8 NA、63x/1.4 NA、100x/1.4 NAプランアポクロマットの目標を持つHeLa、S.セレビシエおよび大腸菌細胞の画像を取得します。405 nmパルスダイオードレーザーでDNA染色DAPIを励起します。PLA信号(この研究用)の場合は、561nmの固体レーザーで励起します。

結果

精製タンパク質を用いたインビトロ研究では、ヒトクラスAとクラスB JDPのサブセットが一時的な混合クラスJDP複合体を形成し、広範囲の凝集タンパク質を効率的に標的化し、Hsp70ベースの組み立てを容易にすることを明らかにした。タンパク質の分解性⁷.PLAを用いて、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)に混合クラス(A+B)JDP複合体が生じるかどうかを判定した。ヒトJGP DNAJA2(クラスA)および...

ディスカッション

共免疫沈殿および共局在化ベースのアプローチは、タンパク質集合を特徴付ける長年の方法として使用されてきた。一過性に形成された特定のシャペロン錯体の検出は、このような従来の方法では大きな課題であり、その結果、以前の所見は主に定性的解釈に限定される。細胞リシスベースの共免疫沈殿技術は、多くの場合、タンパク質とタンパク質の相互作用を安定させるために架橋を必?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Merck	103999
Acetone	Sigma-Aldrich	32201
anti-DNAJA2 antibody	Abcam	ab157216
anti-DNAJB1 Antibody	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody	In house
anti-mCherry antibody	Abcam	ab125096
anti-Sis1 Antibody	Cosmo Bio Corp	COP-080051
anti-Ydj1 antibody	StressMarq Biosciences	SMC-150,
anti-YFP antibody	In house
Coplin slide-staining jar	Sigma-Aldrich	S5516
Diagnostic slides	Marienfeld	1216530
DMEM	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma-Aldrich	DUO82049
Fetal Calf Serum	Thermo-Fischer	10082147
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer	15070063
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P47-07
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S7547
Triton-X100	Merck	108643
Trypsin	Thermo-Fischer	25300096
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zymolase 100T / / Lyticase	United States Biological	Z1004