细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子茶龙组件的原位监测

摘要

Cognate J-domain 蛋白质与 Hsp70 伴护器合作，协助处理从蛋白质折叠到降解的各种生物过程。在这里，我们描述了一个原位接近结扎测定，它允许监测这些瞬时形成的伴菌机在细菌，酵母和人类细胞。

摘要

J-domain蛋白（JdPs）是真核细胞中最大、最多样化的共体细胞家族。最近的发现表明，JDP家族的特定成员可以在真核生物中形成瞬态异质复合物，以微调70 kDa热休克蛋白（Hsp70）基于配体蛋白的基质选择。JDP复合物针对急性/慢性应激诱导的聚合蛋白，并可能通过在蛋白质聚合体表面招募多个Hsp70s来帮助组装分离的气体。这些物理相互作用的JdPs形成的蛋白质质量控制（PQC）网络在体内基本上没有特征。在这里，我们描述了一种基于显微镜的原位蛋白相互作用测定，名为接近结扎测定（PLA），它能够在真核细胞的不同细胞隔间中强有力地捕获这些瞬时形成的伴结复合物。我们的工作将PLA的用法从人类细胞扩展到酵母（糖母细胞）和细菌（大肠杆菌），从而成为监测两者中瞬态形成的蛋白质组体的动力学的重要工具。原核细胞和真核细胞。

引言

由于我们对细胞相互作用的不完全了解，大量的基因组信息仍然无法解释。传统的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，如蛋白质共免疫沉淀与/没有化学交联和蛋白质共定位，虽然广泛使用，造成一系列缺点。一些主要缺点包括相互作用的量化不佳，以及可能引入非本机绑定事件。相比之下，新兴的基于接近的技术为捕获细胞中的蛋白质相互作用提供了另一种强有力的方法。接近结扎测定（PLA）1，现在作为专有试剂盒提供，利用抗体根据相互作用亚单位的接近度专门靶向蛋白质复合物。

PLA是由在靶向蛋白复合物表面形成一个脚手架，由具有小DNA标记（PLA探针）的初级和二级抗体组成（图1，步骤1-3）。接下来，由DNA标记的接近性决定，一个圆形DNA分子通过与连接器寡核苷酸杂交产生（图1，步骤4）。圆形DNA的形成通过DNA结扎步骤完成。新形成的圆形DNA片作为后续滚环扩增（RCA）型聚合酶链反应（PCR）的模板，由其中一个结合的寡核苷酸标记。这通过抗体支架产生单链连体DNA分子附着在蛋白质复合物上（图1，步骤6）。串联DNA分子是使用荧光标记的寡核苷酸进行可视化的，这种核苷酸杂交到分散在扩增DNA上的多个独特序列（图1，步骤7）2。生成的PLA信号，显示为荧光点（图1，步骤7），对应于细胞中靶向蛋白质复合物的位置。因此，该测定可以检测高空间精度的蛋白质复合物。该技术并不仅限于捕获蛋白质相互作用，但也可用于检测高灵敏度1，2的蛋白质上的单个分子或蛋白质修饰。

Hsp70 通过参与一系列内务管理和与压力相关的功能，形成了一个高度通用的护套系统，对于维持细胞蛋白平衡至关重要。Hsp70伴郎系统的家政活动包括脱新蛋白折叠、细胞膜中蛋白质易位、蛋白质复合物的组装和拆解、蛋白质活性的调节以及连接不同的蛋白质折叠/质量控制机器³.同样的伴松系统还重新折叠错折叠/展开的蛋白质，防止蛋白质聚集，促进蛋白质分解，并与细胞蛋白酶合作，降解最终错折叠/损坏的蛋白质，以促进细胞修复后蛋白毒性应力4，5。为了实现这种功能多样性，Hsp70 伴侣依赖于 JDP 家族的合作伙伴和核苷酸交换因子 （NEF），这些因子可微调 Hsp70 的基于 ATP 的基板结合和释放³的依合体^{控制， 6}.此外，JDP共同护带器在选择这种多功能护带系统的基板方面发挥着至关重要的作用。这个家族的成员根据他们与原型JDP（大肠杆菌DnaJ）的结构同源性，被细分为三类（A、B和C）。 A 类 JKP 包含一个 N 端 J 域，该域与 Hsp70、甘氨酸-苯丙氨酸富集区、由锌手指状区域 （ZFLR） 和两个 β管域组成的基板结合区域以及一个 C-终端二分化域。具有 N 端 J 域和甘氨酸-苯丙氨酸富区但缺少 ZFLR 的 JSP 属于 B 类。通常，这两个类的成员都参与伴校函数。属于C类的会员，其中只包含共享J^域4的JdP，招募Hsp70执行各种非伴奏功能。Hsp70 系统作为可互换基板识别"适配器"的重要作用体现在在进化过程中家庭成员的扩展。例如，人类有超过42个不同的JDP成员4。这些JJD功能作为单体，同构体和/或同质/异质寡聚物4，5。最近，通过A类之间的瞬态复杂形成进行功能合作（例如，H.智人DNAJA2;S. cerevisae Ydj1） 和 B 类（例如，H.智人DNAJB1;据报道，S.cerevisiae Sis1）真核JGP促进在体外7、8对非晶蛋白聚集物的有效识别。这些混合类JDP复合物大概在聚合蛋白的表面组装，以促进Hsp70-和Hsp70_Hsp100基蛋白的分解7，8，9，^10.支持这些在真核细胞中暂时形成的混合类JDP复合物存在的关键证据被PLA⁸提供。

PLA越来越多地用于评估元动物的蛋白质相互作用，主要是哺乳动物细胞。在这里，我们报告这项技术的成功扩展，以监测真核和原核单细胞生物中暂时形成的伴生复合物，如萌芽酵母S.cerevisae和大肠杆菌。重要的是，这种扩展凸显了PLA在检测和分析感染人类和动物细胞的微生物方面的潜在用途。

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研究方案

1. 赫拉细胞制备

1. 准备以下材料: PBS （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na₂HPO₄， 1.8 mM KH₂PO_4），pH 7.4;DMEM，辅以 10% FCS 和 1% 笔链;4%甲醛在PBS中;0.5% Triton-X100 在 PBS 中;TBS-T （150 mM NaCl， 20 mM Tris， 0.05% 补间）， pH 7.4;0.0001% 无菌多L-莱辛溶液;10 well 诊断幻灯片;潮湿的室内;纸巾;和科普林滑动染色罐。
   注:为确保最佳的固定效率，在每次实验前应新鲜制备甲醛溶液。
2. 用湿纸巾覆盖封闭盒子的底部，准备一个潮湿的房间。在开始实验前，将潮湿室置于37°C，以确保室温度在37°C，同时孵育酶反应。
3. 在T25烧瓶中的培养HeLa细胞，在5mL的DMEM（高葡萄糖，谷氨酸和丙酸钠补充）补充10%FCS和1%笔链，在37°CCO₂培养箱中含有5%CO_2。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA分离粘附细胞。将新鲜的DMEM添加到分离的细胞后，使用细胞计数室对细胞计数，并在潮湿腔室内的诊断幻灯片上生长。
4. 在无菌细胞培养罩中通过紫外线照射对诊断幻灯片进行消毒 30 分钟。
5. 在实验所需的每口井中加入100 μL无菌过滤0.0001%多L-莱辛。孵育30分钟，用50μL超纯水清洗每口井3次，洗去多余的多L-莱辛。
6. 胰腺化 HeLa 细胞，并在每个井中添加大约 15，000 个细胞。如有必要，将细胞稀释至每口至少30-50μL的DMEM。
7. 在37°C 5%CO2培养箱内湿腔内生长细胞约24小时。在开始使用PLA之前，细胞应60%~80%的汇合。
   注:过高的汇合降低试剂的吸收，降低在协议结束时获得的信号。
8. 将纸巾放在井边，取出介质。用 50 μL 的 PBS 清洗水井 3 倍。
   注:当液体被猛烈添加时，细胞会脱落。在添加新液体之前，不让油井完全干燥，并将新液体轻轻添加到井边，可以预防这种情况。
9. 将PBS中50μL新鲜制备的4%甲醛加入每个井，修复细胞。在室温下孵育10分钟。
10. 在 PBS 中清洗幻灯片 3 倍。在含有 100 mL PBS 的科普林滑动染色罐中进行处理。每次洗涤时，在室温下孵育5分钟，不摇晃。
11. 在 PBS 中将 100 mL 的 0.5% Triton-X100 中的滑片浸入科普林滑动染色罐中，从而渗透细胞膜。在室温下孵育10分钟，不摇晃。
12. 在 TBS-T 中清洗幻灯片 3 倍。在含有 100 mL TBS-T 的科普林滑动染色罐中进行处理。每次洗涤时，在室温下孵育5分钟，不摇晃。
13. 上次清洗后，用纸巾去除多余的缓冲液。此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，该协议将在第 4 节中讨论。

2. S. 塞雷维西亚细胞制剂

1. 准备以下材料:100 mM KPO₄，pH 6.5，称为洗涤缓冲液;37%甲醛;4%甲醛在100mM KPO4，pH 6.5;1.2 M 山梨醇在100 mM KPO_4，pH 6.5;利蒂箱溶液（500μg/mL溶性，20mMβ-甲壳醇，100 mM KPO4，pH 6.5）;0.0001% 多L-莱辛溶液;1% Triton-X100 在 100 mM KPO₄， pH 6.5;10 well 诊断幻灯片;潮湿室（如步骤1.2中准备）;纸巾;和科普林滑动染色罐。
   注:为确保最佳的固定效率，在每次实验前应新鲜制备甲醛溶液。
2. 在30°C下在30°C下生长在非选择性酵母提取物、肽和Dextrose（YPD）培养基中一夜培养。
   注:根据实验要求，S.cerevisae细胞可以在合成完整（SC）培养基或选择性合成最小（SM）培养基中生长。
3. 在 20 mL 介质中将固定培养物稀释至 0.1 的 OD_600。在30°C下生长细胞，同时摇动，直到OD₆₀₀达到0.5。
4. 将 20 mL 培养层转移到 50 mL 离心管中。在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。在5 mL的新鲜培养基中重新悬浮细胞。
5. 通过在培养物中加入550μL 37%甲醛来修复细胞。在室温下孵育15分钟。
6. 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。将颗粒重新悬浮在1 mL中，在洗涤缓冲液中注入新鲜制备的4%的甲醛。在室温下孵育45分钟。
7. 在孵育过程中，通过在每口井中加入100μL 0.01%的聚L-流并表示溶液来制备诊断幻灯片。在室温下孵育幻灯片30分钟。
8. 30分钟后，用超纯水洗去多余的多聚L-流水，让滑道空气干燥。干滑道可供使用。
9. 用1 mL的洗涤缓冲液洗涤细胞两次。通过665 x g的细胞离心进行洗涤3分钟。去除上清液，在洗涤缓冲液中重新悬浮细胞。
10. 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。在洗涤缓冲液中重新悬浮在1mL的1.2M山梨醇中。
11. 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。将颗粒重新悬浮在250 μL新鲜制备的Lyticase溶液中，以消化细胞壁。在30°C下在Lyticase溶液中孵育细胞15分钟，同时摇动。
12. 消化后，在665 x g下将细胞离心3倍，3分钟，并去除上清液。在洗涤缓冲液中重新悬浮在250μL的1.2M山梨醇中。
    注:由于细胞壁消化后易碎，因此请非常仔细地重新悬浮细胞，不要损伤细胞。
13. 将20 μL的再悬浮细胞添加到聚-L-赖因涂层幻灯片中。允许它们附着在幻灯片上30分钟，用50μL的洗涤缓冲液清洗水井3倍，洗去非粘附细胞。
14. 在洗涤缓冲液中用50μL的1%Triton-X洗涤3x，渗透细胞膜。
    注:此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，将在第 4 节中讨论。

3.大肠杆菌细胞制剂

1. 准备以下材料: PBS-T （140 mM NaCl， 2 mM KCl， 8 mM K₂HPO₄， 1.5 mM KH₂PO₄， 0.05% 补间-20）， pH 7.4;液化酶溶液（2毫克/mL液化酶，25 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM葡萄糖，10 mM EDTA）;0.0001% 多L-莱辛溶液;99%冷甲醇;99%室温甲醇;99%丙酮;10 well 诊断幻灯片;潮湿室（如步骤1.1.1）中准备）;纸巾;和科普林滑动染色罐。
2. 在 Luria-Bertani （LB） 培养30°C的培养基中生长一夜文化，同时摇动。
3. 在新鲜的 LB 介质中，将固定培养物稀释到 0.02 的 OD_600。在30°C下生长细胞，同时摇动，直到OD₆₀₀达到0.4对数相细胞。
4. 在细胞达到 OD₆₀₀的 0.4 之前大约 15 分钟，通过在每口井中添加 100 μL 0.0001% 聚L-流并表示来制备聚L-流膜滑片。在室温下孵育幻灯片30分钟。
5. 30分钟后用超纯水洗去多余的多聚L-流水，让滑流空气干燥。干滑道可供使用。
6. 当细胞达到OD₆₀₀ 0.4时，将培养的1 mL转移到无菌微离心管和颗粒细胞，在2，650 x g下2分钟。
7. 在 50 μL 的 LB 培养基中重新悬浮细胞。
8. 加入1 mL的冰冷99%甲醇，修复细胞。用手非常轻柔地混合。在-20°C下孵育细胞30分钟。
9. 固定后，将20 μL的细胞添加到聚-L-流膜涂层幻灯片中。让滑轨风干30分钟。
10. 在每个孔中加入50μL新鲜制备的液干溶液，以消化细胞壁。在25°C下在潮湿室中孵育30分钟。
11. 在井边添加纸巾，从井中取出液化溶液。在 100 mL 的 PBS-T 中清洗幻灯片 3 倍。在科普林滑动染色罐中进行每次洗涤 30 s，无需晃动。
12. 通过点击纸巾上的幻灯片，从幻灯片中取出洗涤缓冲液。
13. 通过在每个孔中加入50μL的99%甲醇来渗透细胞膜。在室温下孵育1分钟。
14. 将纸巾放在井边，取出甲醇。
15. 在每个井中加入 50 μL 的 99% 丙酮。孵育1分钟。
16. 将纸巾放在井边，去除多余的丙酮。让幻灯片风干。此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，将在第 4 节中讨论。

4. 邻近结扎测定

1. 准备以下材料:阻塞缓冲液;抗体稀释缓冲液;洗涤缓冲液"A" = （10 mM Tris， 150 mM NaCl， 0.05% 补间-20） pH 7.4;清洗缓冲液"B"= （200 mM Tris， 100 mM NaCl） pH 7.4;抗兔子二级抗体加;抗小鼠二次抗体减度;5x 结扎缓冲液;利加塞;5x 放大缓冲液（橙色:=_前554 nm;μem 576 nm）;聚合酶;超纯水;和包含 DAPI 的安装介质。
   注: PLA 检测试剂也可用于变型绿色 （+ex 495 nm; +_em 527 nm）， 红色 （+ex 594 nm; +_em 624 nm）， FarRed （+ex 644 nm; +_em 669 nm） 或光明场 （马萝卜过氧化物酶 （HRP） 共偶）。
2. 通过向每个井添加一滴阻塞缓冲区来阻止单元格。在潮湿的室内37°C下孵育30分钟。
3. 通过稀释抗体稀释缓冲液中的库存抗体制备抗体溶液。对于每口井需要40μL的抗体溶液。
4. 将纸巾放在井边，去除阻塞缓冲液。在每个井中加入40μL的抗体稀释剂。在37°C的潮湿腔室中孵育60分钟，或在4°C下孵育过夜。
5. 在井边放置一张纸巾，从井中取出抗体溶液。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 倍，无需晃动。
6. 在洗涤步骤中，稀释5倍二级抗体探针，抗兔子PLUS和抗小鼠减号（探针的物种特异性取决于所使用的主要抗体），在抗体稀释缓冲液中。每口井制备40μL的抗体溶液。
7. 在每个井中加入40μL的二级抗体溶液。在潮湿的室内37°C下孵育60分钟。
8. 在井边放置一张纸巾，从井中取出二级抗体溶液。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 倍，无需晃动。
9. 在注射过程中，通过混合8μL的5x结扎缓冲液、31μL的超纯水和1μL的利扎酶，每口井制备40μL的结扎混合物。
10. 在每个井中加入40μL的结扎混合物。在潮湿的室内37°C下孵育30分钟。
11. 将纸巾放在井边，从井中取出结扎混合物。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 分钟，无需晃动。
12. 在浇解过程中，通过混合8μL的5倍扩增溶液、31.5μL的超纯水和0.5μL的聚合酶，每口井制备40μL的扩增混合物。
    注:5倍放大包含荧光探针。保护这种混合物免受光线照射。此外，在以下步骤中保护幻灯片免受光线照射。如果使用半透明的科普林滑动染色罐和潮湿的腔室，将它们包裹在铝箔中。
13. 每口井加入40μL的扩增混合物。在潮湿的室内37°C下孵育100分钟。
14. 从井中取出扩增混合物。在科普林滑动染色罐中清洗 2x 在 100 mL 中的洗涤缓冲液"B"，无需晃动 10 分钟。
15. 在 100 mL 的洗涤缓冲液"B"中将 1:100 稀释在科普林滑动染色罐中的超纯水中，30 s。
16. 在幻灯片中添加 20 μL 的 DAPI，每口井包含安装介质。用盖玻片合上幻灯片，用指甲油密封滑轨。
17. 如果成像，立即孵育含有安装介质 10-15 分钟的 DAPI，同时防止光线照射。如果没有，将幻灯片存放在 -20°C 长达 1 周，防止光线照射。

5. 检测

1. 使用共聚焦显微镜获取HeLa、S.cerevisae和大肠杆菌细胞的图像，分别具有20x/0.8 NA、63x/1.4 NA和100x/1.4 NA计划异色物物。 使用 405 nm 脉冲二极管激光器激发 DNA 染色 DAPI。对于 PLA 信号（本研究）激发 561 nm 固态激光。

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结果

我们以前使用纯化蛋白质的体外研究表明，人类A类和B类JDPs的子集形成瞬态混合类JDP复合物，以有效地靶向广泛的聚合蛋白，并可能促进基于Hsp70的组装蛋白质异化7。我们利用PLA来确定混血类（A+B）JDP复合物是否发生在人类宫颈癌细胞（HeLa）中。人类JDPsDNAJA2（A类）和DNAJB1（B类）被以高度特异性原抗体和二级PLA探针（图2A-C）为目标。红色荧光...

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讨论

基于共免疫沉淀和共同定位的方法一直被用作描述蛋白质组装的长期方法。检测瞬时形成的特定伴郎复合物是这种传统方法的一大挑战，因此，以前的发现主要限于定性解释。基于细胞莱沙的共免疫沉淀技术通常需要交联以稳定蛋白质-蛋白质的相互作用。细胞莱沙会增加破坏瞬时形成的伴生复合物的风险，而交联可能引入非原生相互作用，特别是由大多数伴生者固有的"粘性"驱动。当使用共免疫?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Merck	103999
Acetone	Sigma-Aldrich	32201
anti-DNAJA2 antibody	Abcam	ab157216
anti-DNAJB1 Antibody	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody	In house
anti-mCherry antibody	Abcam	ab125096
anti-Sis1 Antibody	Cosmo Bio Corp	COP-080051
anti-Ydj1 antibody	StressMarq Biosciences	SMC-150,
anti-YFP antibody	In house
Coplin slide-staining jar	Sigma-Aldrich	S5516
Diagnostic slides	Marienfeld	1216530
DMEM	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma-Aldrich	DUO82049
Fetal Calf Serum	Thermo-Fischer	10082147
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer	15070063
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P47-07
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S7547
Triton-X100	Merck	108643
Trypsin	Thermo-Fischer	25300096
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zymolase 100T / / Lyticase	United States Biological	Z1004