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要約

げっ歯類モデルを用いた基礎研究で機能評価を行う4台のカメラとデータ処理ソフトウェアを含む3次元モーションキャプチャ装置を用いた運動解析法を紹介します。

要約

坐骨神経機能指数(SFI)と比較して、運動学的分析は、坐骨神経損傷げっ歯類モデルの機能的評価を行うためのより信頼性の高い、敏感な方法です。本プロトコルでは、ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルを用いた機能評価に3次元(3D)運動キャプチャ装置を用いた新規運動学的解析法について述べた。まず、ラットはトレッドミルウォーキングに精通しています。マーカーは、指定された骨のランドマークに取り付けられ、ラットは、所望の速度でトレッドミルの上を歩くように作られています。一方、ラットの後肢の動きは4台のカメラを使用して記録される。使用するソフトウェアに応じて、マーカートレーシングは自動モードと手動モードの両方を使用して作成され、必要なデータは微妙な調整の後に生成されます。3Dモーションキャプチャー装置を使用する運動解析のこの方法は、優れた精度と精度を含む多くの利点を提供します。包括的な機能評価では、さらに多くのパラメータを調査できます。この方法には、考慮が必要ないくつかの欠点があります:システムは高価であり、操作が複雑になり、皮膚のシフトに起因するデータ偏差を生じる可能性があります。それにもかかわらず、3Dモーションキャプチャー装置を用いた運動学的解析は、機能的前肢および後肢評価を行う上で有用である。今後、この方法は、様々な外傷および疾患の正確な評価を生成するためにますます有用になる可能性がある。

概要

坐骨神経機能性指数(SFI)は、機能的な坐骨神経評価を行うためのベンチマーク法である1。SFIは広く採用されており、ラット坐骨神経損傷に関する様々な機能評価研究で頻繁に使用されています2,3,4,5,6.その人気にもかかわらず、SFIには、オートマチネーション7、共同拘縮リスク、および足跡8の塗抹など、いくつかの問題があります。これらの問題は、その予後の値に深刻な影響を与えます9.したがって、SFIの代用として、代わりのエラーが発生しやすい方法が必要です。

そのような代替方法の1つは、運動学的分析である。これには、骨のランドマークやジョイントに取り付けられたトラッキングマーカーを使用した包括的な歩行分析が含まれます。キネマティック解析は、機能評価9にますます使用されています。この方法は、SFI11,12に起因する欠点を持たない機能評価10のための信頼性の高い敏感なツールとして徐々に認識されている。

このプロトコルでは、トレッドミル、4つの120 Hz充電式結合デバイス(CCD)カメラ、およびデータ処理ソフトウェアからなる3Dモーションキャプチャ装置を使用する一連の運動学的解析について説明します(資料表を参照)。この運動学的分析方法は、一般的なビデオ歩行または歩行分析13、14とは異なります。2 台のカメラは、1 つの側面から後肢の動きを記録するために、異なる方向に配置されます。続いて、後肢の3Dデジタルモデルがコンピュータグラフィックス9を使用して構築される。実際の四肢の寸法を厳密に再現することで、股関節、膝関節、足首関節、つま先関節などの指定関節角度を計算できます。また、ストライド/ステップ長や、スイング相に対するスタンス相の比率など、さまざまなパラメータを決定できます。これらの再構成は、2組のカメラによって送信されたデータから生成された後肢の完全に再構築された3Dデジタルモデルに基づいています。想像上の重心(CoG)軌道でさえ、自動的に計算することができます。

この3Dモーションキャプチャ装置を使用して、ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルの文脈における時間の経過に伴う機能的変化を明らかにする複数の運動学的パラメータを導入し、評価しました。

プロトコル

京都大学動物実験委員会により議定書が承認され、京都大学動物実験委員会ガイドライン(承認番号:MedKyo17029)に従ってすべての議定書が実施されました。

1. トレッドミル歩行でラットを知る

  1. トレッドミルの両側に2枚の透明なプラスチックシートを設置し、12週齢の雄のルイスラットをまっすぐ正面方向に歩かせ、電気ショックグリッドをオンにします。
  2. 各ラットにトレッドミルの上を歩いしてもらいます。トレッドミルを目的の速度(20cm/sまたは12 m/分)まで徐々に加速し、ラットをこの速度で5分間正常に歩かせます。歩行の各セッションの後、1-2分の休憩を与えます。このプロセスを 1 日あたり 3 倍、週 5 日、1 週間繰り返します。
    注:ステップ2の1週間前にトレッドミルを開始します。
  3. 12時間の明暗サイクルでケージあたり3群のラットを収容し、市販のラット食品と水道水アドリビタムに餌を与える。

2. 坐骨神経クラッシュ傷害の実施

  1. ラットを麻酔誘導室に入れ、5%のイソファフルラン吸入液を導入する。
  2. 0.15 mg/kg メデトミジン塩酸塩、2 mg/kg ミダゾラム、および2.5 mg/kgブトルファントール酸をラットに調製した組み合わせ麻酔薬の腹腔内注射を提供する。ペダル反射神経の欠如を確認してください。その後、左大きなトロシャンターから大腿の真ん中まで電気剃り手で領域を剃ります。
  3. 無菌布を広げ、その上にネズミを置き、左横の位置に置きます。同様に布の上に滅菌手術器具を置きます。
  4. より大きなトロシャンターから大腿の真ん中まで、外科的な10番目のブレードでまっすぐ切開します。次に、外科的止血を用いて四頭筋フェモリスと上腕二頭筋の間で鈍い解剖を行い、坐骨神経を露出させる。
  5. 2組のマイクロ鉗子で周囲の組織から坐骨神経を取り外し、標準的な外科的止血を使用して坐骨神経を10sで粉砕し、臀部の結節性のすぐ下の部位で2mmの長いクラッシュ傷害を作り出す。
  6. マイクロ鉗子のペアを使用して傷害の近位端で9-0ナイロン上神経ステッチを行い、4-0ナイロン縫合糸で筋肉と皮膚を閉じます。
  7. 0.3 mg/kgのアチパメゾール塩酸塩を用いて調製した麻酔アンタゴニストの腹腔内注射をラットに与え、10分以内に目を覚ます。ラットが麻酔から回復した後、ラットが尾の基部によって吊り下げされている間、左のつま先の動きを観察する。つま先が全く広がらない場合、手術は成功した。
  8. 12時間の明暗サイクルで手術後にラットを個別に収容し、市販のラット食品と水道水アドリビタムに餌を与える。

3. マーカーの取り付け

  1. 訓練されたラットを麻酔誘導室に入れ、5%のイソファフルラン吸入液を導入する。つま先をつまんでペダル反射の欠如を確認してください。
  2. 麻酔マスク(2%イソファフルラン吸入液)を用いてラットを連続的に麻酔します。ラットは安定した麻酔を受けるが、電気剃り器を使用して腰から両側性のマレオリまでの領域を剃る。
    注意:漏れイソファフルランに研究者をさらすことを防ぐために、マスクがラットの頭と顔をしっかりと覆っていることを確認してください。
    注:ラットの損傷を防ぐには、髪をできるだけやさしく剃ってください。
  3. 起こりやすい位置にラットを置きます。黒いマーカーペンを使用して、剃った皮膚の次の骨のランドマークをマークする:腰椎から仙骨椎骨までの棘を通る線、前部の上腸骨棘、大きなトロシャンター、膝関節、横性マレオリ、5番目中足骨食後関節、および第4指の先端。
    注: 二国間マーカーが軸対称であるかどうかを判断するために、スピントプロセスを通る線が使用されます。
  4. 腰椎から仙骨椎骨までの棘プロセスと第4のつま先の先端を除く、これらの骨のランドマークに半球マーカーを取り付けるために液体接着剤を使用してください。混乱を避けるために、他のすべてのランドマークに異なる色を使用します。4番目のつま先の先端にはピンクのインクが付いています。
    注意:オペレータの露出した皮膚に接着剤を滴下しないように注意してください。
  5. すべてのマーカーを配置した後、ラットをケージに戻します。麻酔から完全に回復するまで、ラットをトレッドミルに置かないでください。
    注:ラットが麻酔から完全に回復しない場合、意識の低下は正常な歩行に深刻な影響を与える可能性があります。

4. キャリブレーションとソフトウェアの設定

  1. トレッドミルの両側に透明なプラスチックシートを2枚設置し、キャリブレーションボックスをトレッドミルの中央に置きます。記録ソフトウェアを開き、ディスプレイのキャリブレーションイメージアイコン(補足ファイル1)をクリックします。
  2. 120 Hz CCD カメラを使用して 4 方向から 1 ~ 2 s のビデオを録画するには、[記録] アイコンをクリックします。録音アイコンをもう一度クリックして、録音を停止します。
    注:録画が停止すると、ビデオは自動的に保存されます。
  3. 計算ソフトウェアでビデオファイルを開きます。画面右下隅にある校正ボックスの特性点をクリックして、4つの画像の対応するマーカーにドラッグします。次に、保存アイコンをクリックします。
    メモ:キャリブレーションが完了した後は、カメラの位置を変更しないでください。

5. 歩行を記録する

  1. 校正ボックスをトレッドミルから取り出し、電気ショックグリッドをオンにし、完全に目を覚ますラットをトレッドミルに置きます。記録ソフトウェアを開き、ラットのシリアル番号、歩行速度、および主要なオペレータの名前など、ラットに関する基本情報を入力します。
  2. トレッドミルをオンにし、速度を20cm/sに設定します。ラットが速度に適応し、正常に歩くことができる後、ディスプレイの録音アイコンをクリックして、4台のカメラで歩くラットを記録します。十分なステップが記録されたら(>10)、もう一度アイコンをクリックして録音を停止し、トレッドミルをオフにします。
    注:録画が停止すると、ビデオは自動的に保存されます。
  3. 麻酔用の麻酔誘導室にラットを戻します。ラットが連続麻酔下にある間(麻酔マスクを介して投与される)、半球マーカーを取り除く。
    メモ:ラットに痛みを起こさないように、マーカーをできるだけ穏やかに取り外してください。
  4. 指定された時間(例えば、1週間、3週間、または手術後6週間)で、ステップ3.1〜5.3を繰り返してラットの運動学的測定を行う。運動学的測定は、実験の開始時に、手術を受けていないラット(すなわち、対照群)に対して1回だけ行う。

6. マーカートレース

  1. 計算ソフトウェアを開き、インターフェイスでビデオファイルを開きます。
  2. ビデオのプログレスバー上の両側コントロールバーをクリックしてドラッグし、10ステップのトレッドミル歩行記録のみが表示されるようにします(補足ファイル3)。各特性点を画面右下隅の3Dモデルからカメラで撮影した4つの初期画像のそれぞれに対応するマーカーにドラッグします(補足ファイル4)。
  3. 自動トレースアイコンをクリックして、自動マーカー トレース プロセスを開始します (補足ファイル 5、補足ファイル 6)。システムがマーカーを正確にトレースしない場合は、「手動ディジタイズ」アイコンをクリックして手動トレースモード (補足ファイル 7)に切り替え、3D モデルのトレース特性点をクリックし、画像内の対応するマーカーをクリックします。
  4. マーカーをクリックしたら、画像がビデオの次のフレームに切り替わるようにします。マーカートレースプロセスが完了するまで、マーカーを連続してクリックします。完了したら、保存アイコンをクリックします。

7. キネマティック解析

  1. 分析ソフトウェアを開き、インターフェイスで処理されたビデオ ファイルを開きます。
  2. 設定アイコンをクリックし、足首の角度、つま先の角度、骨盤シフト(X軸とZ軸)などの指定パラメータを右のポップアップウィンドウの表示リストに追加します(補足ファイル8)。[OK]をクリックすると、パラメータの値の変化を表すカーブがインタフェースに表示されます。
  3. [計測]アイコンをクリックし、プルダウンメニューで[スムーズ処理]を選択します。ポップアップメニューに20 Hzと入力して、カーブ内の 20 Hz を超える周波数を除去します (補足ファイル 9)。
  4. インターフェイスには、ラットの歩行ビデオ、動的な 3D モデル、10 ステップサイクルからのパラメータの値変化を表す曲線、パラメータの平均値変化を表すカーブ、スタンスとスイングフェーズの比率を表すヒストグラムとスケマティック ダイアグラムの 5 つのパネルがあることを確認します (補足ファイル 10)。
  5. パラメータの平均値の変化を表す曲線のパネルを右クリックし、プルダウンメニューの「データ出力」(「補足ファイル 11」)を選択します。これにより、足首とつま先の角度、骨盤シフト、および10ステップサイクル周期の他の所望のパラメータを含む後肢関節角度の平均値が生成されます。

結果

ラット坐骨神経クラッシュ傷害モデルにおける時間の経過に伴う機能的変化を調べる4つのパラメータを選択した。これらは、スタンス・ツー・スイング相の比率、重心(CoG)の軌道、足首の角度、および'つま先オフ'フェーズ9におけるつま先角度であった。24匹のラットは、対照群(C)、第1(1w)、第3(3w)、および左坐骨神経クラッシュ傷害の6週目の4つの群のいずれかに無作為に?...

ディスカッション

このプロトコルでは、安定した連続歩行ラットが運動学的分析の最も重要な要素である。トレッドミルの速度は20cm/sに設定されました。この歩行速度は、16のスペース制約なしにラットが動く場合、決して「高い」とは考えられない。それにもかかわらず、この速度は訓練されていないラットがトレッドミルを安定して歩くのには速すぎて、異常な歩行と不均一な動きをも?...

開示事項

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

本研究は、JSPS KAKENHI助成金番号JP19K19793、JP18H03129、およびJP18K19739によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
9-0 nylon sutureBear Medic Corporation.T06A09N20-25
Anesthetic Apparatus for Small AnimalsSHINANO MFG CO.,LTD.SN-487-0T
ISOFLURANE Inhalation SolutionPfizer Japan Inc.(01)14987114133400
Kine AnalyzerKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.A analysis software
Liquid adhesiveKANBO PRAS CORPORATIONPT-B180
Micro forcepsBRC CO.16171080
Motion RecorderKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.A recording software
Standard surgical hemostatFine Science Tools, Inc.12501-13
Surgical blade No.10FEATHER Safety Razor CO., LTD100D
Surgical hemostatWorld Precision Instruments503740
Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for Animal)KISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.A 3D motion analysis system that consists of cameras
Three-dimensional(3D) CalculatorKISSEI COMTEC CO.,LTD.N.A.A marker tracing software
TreadmillMUROMACHI KIKAI CO.,LTDMK-685a treadmill with affialiated the electrical schocker, transparent sheats and a speed control apparatus

参考文献

  1. Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1274 (1996).
  2. Takhtfooladi, M. A., Jahanbakhsh, F., Takhtfooladi, H. A., Yousefi, K., Allahverdi, A. Effect of low-level laser therapy (685 nm, 3 J/cm(2)) on functional recovery of the sciatic nerve in rats following crushing lesion. Lasers in Medical Science. 30 (3), 1047-1052 (2015).
  3. Xing, H., Zhou, M., Assinck, P., Liu, N. Electrical stimulation influences satellite cell differentiation after sciatic nerve crush injury in rats. Muscle & Nerve. 51 (3), 400-411 (2015).
  4. Yang, C. C., Wang, J., Chen, S. C., Jan, Y. M., Hsieh, Y. L. Enhanced functional recovery from sciatic nerve crush injury through a combined treatment of cold-water swimming and mesenchymal stem cell transplantation. Neurological Research. 37 (90), 816-826 (2015).
  5. Jiang, W., et al. Low-intensity pulsed ultrasound treatment improved the rate of autograft peripheral nerve regeneration in rat. Scientific Reports. 6, 22773 (2016).
  6. Ni, X. J., et al. The Effect of Low-Intensity Ultrasound on Brain-Derived Neurotropic Factor Expression in a Rat Sciatic Nerve Crushed Injury Model. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 461-468 (2017).
  7. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  8. Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery. 10 (3), 220-225 (1989).
  9. Wang, T., et al. Functional evaluation outcomes correlate with histomorphometric changes in the rat sciatic nerve crush injury model : A comparison between sciatic functional index and kinematic analysis. PLoS One. 13 (12), e0208985 (2018).
  10. de Ruiter, G. C., et al. Two-dimensional digital video ankle motion analysis for assessment of function in the rat sciatic nerve model. Journal of the Peripheral Nervous System. 12 (3), 216-222 (2007).
  11. Walker, J. L., Evans, J. M., Meade, P., Resig, P., Sisken, B. F. Gait-stance duration as a measure of injury and recovery in the rat sciatic nerve model. Journal of Neuroscience Methods. 52 (1), 47-52 (1994).
  12. Dijkstra, J. R., Meek, M. F., Robinson, P. H., Gramsbergen, A. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods. 96 (2), 89-96 (2000).
  13. Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
  14. Rui, J., et al. Gait cycle analysis: parameters sensitive for functional evaluation of peripheral nerve recovery in rat hind limbs. Annals of Plastic Surgery. 73 (4), 405-411 (2014).
  15. Yu, P., Matloub, H. S., Sanger, J. R., Narini, P. Gait analysis in rats with peripheral nerve injury. Muscle & Nerve. 24 (2), 231-239 (2001).
  16. Amado, S., et al. The sensitivity of two-dimensional hindlimb joint kinematics analysis in assessing functional recovery in rats after sciatic nerve crush. Behavioural Brain Research. 225 (2), 562-573 (2011).
  17. Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible?. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
  18. Varejao, A. S. P., et al. Motion of the foot and ankle during the stance phase in rats. Muscle & Nerve. 26 (5), 630-635 (2002).
  19. Lin, F. M., Pan, Y. C., Hom, C., Sabbahi, M., Shenaq, S. Ankle stance angle: a functional index for the evaluation of sciatic nerve recovery after complete transection. Journal of Reconstructive Microsurgery. 12 (3), 173-177 (1996).
  20. Patel, M., et al. Video-gait analysis of functional recovery of nerve repaired with chitosan nerve guides. Tissue Engineering. 12 (11), 3189-3199 (2006).
  21. Filipe, V. M., et al. Effect of skin movement on the analysis of hindlimb kinematics during treadmill locomotion in rats. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 55-61 (2006).
  22. Tajino, J., et al. Three-dimensional motion analysis for comprehensive understanding of gait characteristics after sciatic nerve lesion in rodents. Scientific Reports. 8 (1), 13585 (2018).

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